黃娟 鄧國富 高利軍 高菊 卿冬進(jìn) 朱昌蘭

摘要：基因編輯是一項(xiàng)對目的基因進(jìn)行修飾的新技術(shù)，由成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR associated，Cas）組成的系統(tǒng)（CRISPR/Cas）為新一代基因編輯技術(shù)，其中Cas9蛋白與CRSPR結(jié)合形成的編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9因其簡單易操作的特性已廣泛應(yīng)用于植物基因組編輯，發(fā)展?jié)摿薮?。文章論述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理、發(fā)展歷程及在植物基因組中的定點(diǎn)編輯效應(yīng)，并分析CRISPR/Cas9在水稻、小麥、玉米等作物育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)其在改良水稻產(chǎn)量和質(zhì)量相關(guān)性狀、小麥白粉病抗性及玉米乙烯敏感等性狀上效果明顯。在今后的研究中，應(yīng)針對不同作物的育種目標(biāo)，深入了解目標(biāo)基因的功能作用來設(shè)計(jì)相應(yīng)的操作方案，并提高該系統(tǒng)對作物目的基因改良的效率，加強(qiáng)其安全性等，以促進(jìn)基因編輯在作物育種中的應(yīng)用，加快育種進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：作物育種；基因編輯；CRISPR/Cas9系統(tǒng)；定點(diǎn)修飾

0引言

基因編輯是對基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)，其原理是通過序列特異性核酸酶進(jìn)行精確定位，對靶標(biāo)DNA片段進(jìn)行剪切或插入新基因片段使基因沉默或同源重組，達(dá)到目標(biāo)性狀表達(dá)的目的（王亞萍等，2017；沈蘭等，2017）。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，許多作物的基因組測序工作已相繼完成。面對大量的基因組信息，科研工作者需詮釋其功能，并有效應(yīng)用于生產(chǎn)生活（景潤春和盧洪，2016）。近十年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源DNA隨機(jī)插入和RNA下調(diào)基因表達(dá)成為反向遺傳學(xué)分析基因功能的一種有效方法，但存在不可控性、干擾調(diào)控遺傳穩(wěn)定性差等缺陷，阻礙其在作物育種中的應(yīng)用和發(fā)展。正向遺傳學(xué)分析則是利用傳統(tǒng)的基因重組、突變等方法，經(jīng)過多世代選擇來培育新品種，存在耗時長、工作量大等弊端，其中分子標(biāo)記輔助育種（MAS）常因多代回交和連鎖累贅而丟失分子標(biāo)記，影響作物育種進(jìn)程。隨著人工核酸酶的出現(xiàn)和真核細(xì)胞技術(shù)體系的完善，基因組編輯技術(shù)飛速發(fā)展，將靶向基因操作推向高潮（Bogdanove and Voytas，2011；Jinek et al，2012；Cong et al，2013；Shan etal，2013），為作物育種工作提供了新途徑。

目前，主要有3種基因編輯技術(shù)：（1）鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）技術(shù)，該技術(shù)是第1代基因組編輯技術(shù)。ZFN是由一個鋅手指DNA結(jié)合域和一個取自限制性內(nèi)切酶的DNA切割結(jié)構(gòu)域所組成的融合蛋白，可結(jié)合并切割基因組位點(diǎn)（Bibikovaet al，2001；Umov et al，2005）。（2）轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（Transcription activator-like effector nu-cleases，TALEN）技術(shù)，該技術(shù)已逐步取代ZFN技術(shù)，其原因是TALEN能特異性識別DNA序列，具有較強(qiáng)的設(shè)計(jì)性，不受上、下游序列影響，較ZFN技術(shù)更具有應(yīng)用潛力（Christian et al，2010）。（3）成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)及其關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR/Cas），CRIS-PR/Cas是古細(xì)菌和細(xì)菌用于清除外源入侵DNA的一種免疫系統(tǒng)，其靶序列的結(jié)合特異性是由單向?qū)NA（sgRNA）和原間隔序列基序（PAM）共同決定。其中Cas9蛋白無需形成蛋白二聚體，利用向?qū)NA（gRNA）進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對決定靶序列的特異性（Barrangou et al，2007；Gasiunas et al，2012），因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比之下極大降低了技術(shù)門檻，一經(jīng)面世就迅速得到廣泛應(yīng)用。

1CRISPR/Cas9系統(tǒng)

自1987年CRISPR簇從大腸桿菌的基因組被鑒定出以來（Ishino et al，1987）即倍受關(guān)注（Moiica etal，1995，2000），至2005年其生物學(xué)功能被確認(rèn)（Moiica et al，2005）。CRISPR簇的基因序列與病毒和質(zhì)粒上的基因序列具有同源性，說明其在細(xì)胞中發(fā)揮適應(yīng)性免疫作用（Bolotin et al，2005；Pourcelet al，2005）。CRISPR簇附近存在一系列保守的基因Cas，編碼具有核酸功能的Cas蛋白，兩者結(jié)合可保護(hù)細(xì)胞而抵制病毒人侵，形成基于RNA介導(dǎo)的DNA打靶免疫機(jī)制（Brouns et al，2008；Marraffniand Sontheimer，2008；Gameau et al，2010）。

根據(jù)Cas基因核心元件序列的差異，CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被分為3種類型（Ⅰ、Ⅱ和IⅡ型），其中Ⅱ型系統(tǒng)最簡單，來自釀膿鏈球菌（Jinek et al，2012），其特征性蛋白為Cas9蛋白，經(jīng)改造成為序列特異性核酸酶，與ZFN和TALEN一樣具有靶向切割DNA序列的功能，稱為CRISPR/Cas9系統(tǒng)。該免疫系統(tǒng)是原核細(xì)胞通過整合間隔序列而獲得，間隔序列是入侵DNA的一小片段，位于CRISPR簇末端的2個相鄰重復(fù)序列之間。CRISPR簇（包括其間隔序列）在與入侵的DNA匹配后被轉(zhuǎn)錄，加工成小干擾CRISPRRNA（crRNA），長度約40 nt，再與反式激活CRISPRRNA（TracrRNA）結(jié)合對Cas9核酸酶進(jìn)行激活，引導(dǎo)其切割入侵的DNA（Dekcheva et al，2011；Jinek etal，2012）。在入侵DNA上被切割的同源雙鏈DNA序列稱為原間隔序列（Barrangou et al，2007），其被切割的先決條件是入侵DNA下游存在一段保守的原間隔序列基序（PAM），通常為5'-NGG-3'序列（Gasiunas et al，2012），但剪切的特異性是由PAM上游約12個基礎(chǔ)序列決定。當(dāng)crRNA和目的DNA相匹配，Cas9核酸酶在gRNA的引導(dǎo)下對DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生兩端的單鏈NHEJ（Non-homologous end ioining）可介導(dǎo)目的性突變（Cristea et al，2013；Maresca et al，2013）。已有研究表明，當(dāng)一段序列與斷裂雙鍵DNA周圍的序列為同源序列時，DNA即可能被同源修復(fù)（Homologousrecombination，HR），該機(jī)制可用于精確地修復(fù)或插入基因（Puchta，2005）。

研究表明，僅改變crRNA數(shù)十個核甘酸即可重新設(shè)置目標(biāo)DNA，且其與TracrRNA融合為sgRNA時可保證剪切的特異性，成功實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)從生物學(xué)現(xiàn)象到基因工程工具的轉(zhuǎn)變（Jinek et al，2012）。此外，哺乳動物基因組編輯的實(shí)現(xiàn)也證明了CRISPR/Cas9和sgRNA構(gòu)成的系統(tǒng)在真核細(xì)胞中發(fā)揮編輯作用（Cong et al，2013；Jinek et al，2013；Hwang et al，2013；Mali et al，2013），尤其是具有不同序列的多重gRNA可同時在不同位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)高效的多重基因組修飾（Cong et al，2013；Mali et al，2013）。可見，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個簡單、廉價、多樣化的基因編輯工具，導(dǎo)致其相關(guān)研究成為熱點(diǎn)（Bortesi and Fischer.2014）。

2CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組的定點(diǎn)編輯

來自細(xì)菌等微生物的CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為基因工程工具已廣泛應(yīng)用于人類及哺乳動物等真核生物研究（Cong et al，2013；Mali et al，2013）。為將其應(yīng)用于植物，植物科學(xué)家開展了大量研究。自2013年8月首次報(bào)道利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對植物基因組進(jìn)行編輯（Li et al，2013；Nekrasov et al，2013；Shan et al，2013）以來，大量相關(guān)研究相繼開展（Feng et al，2013；Xie and Yang，2013）。這些研究分別以擬南芥、生煙、水稻和小麥等植物為供試材料，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將優(yōu)化的Cas9基因和gRNA轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了植物基因組的定點(diǎn)編輯，證明該技術(shù)在植物生物學(xué)研究領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價值。隨后該技術(shù)被應(yīng)用于高梁（Jiang et al，2013）、玉米（Liang et al，2014）、甜橙（Jia and Wang，2014）、番茄（Ron et al，2014）、地錢（Sugano et al，2014）、大豆（Cai et al，2015）、大麥（Lawrenson et al，2015）、甘藍(lán)（Lawrenson et al，2015）、楊樹（Zhou et al，2015）、棉花（Iqbal et al，2016）、甘蔗（Mohan，2016）、亞麻薺（Jiang et al，2016）等作物。這些研究結(jié)果如突變頻率、剪切特異性、位點(diǎn)結(jié)構(gòu)辨識（Jiang et al，2013；Miao et al，2013；Shan et al，2013；Xie andYang，2013；Fauser et al，2014；Feng et al，2014；Zhang et al，2014；Cai et al，2015；Mikami et al，2015）、創(chuàng)造大片段染色體缺失、同源重組的潛在性及脫靶概率等（Mao et al，2013；Gao et al，2014；Zhou et al，2014；Ma et al，2015；Xie et al，2015；Xu et al，2015；Li et al，2016a）可為后續(xù)研究提供參考。

通過對各世代轉(zhuǎn)基因苗的檢測發(fā)現(xiàn)，在水稻（Zhou et al，2014；Ma et al，2015）、小麥（Zhang etal，2016）、番茄（Brooks et al，2014）、擬南芥（Wanget al，2015）、玉米（Char et al，2016）等作物的第1代轉(zhuǎn)基因植株中就可獲得雙等位或純合突變，且該系統(tǒng)在生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)獲得的遺傳突變可通過正常的生殖方式遺傳給下一代（Brooks et al，2014；Feng etal，2014；Ma et al，2015；Wang et al，2016）。另外，可通過T₁或T₂代的分離選擇含有目的基因修飾而不含轉(zhuǎn)基因的單株，而CRISPR/Cas9瞬時表達(dá)的基因組編輯體系可避開外源DNA插入獲得純合的T₀代突變體，保證材料的安全性（zhou et al，2014；Char etal，2016；Gao et al，2016；Wang et al，2016；Li etal，2016b）。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步的育種應(yīng)用提供了可靠依據(jù)。

3

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在作物育種中的應(yīng)用

3.1在水稻育種中的應(yīng)用

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，并已成為重要的模式植物，相對于小麥復(fù)雜的基因組背景，水稻的基因編輯更易操作。2013年，Shan等首次對水稻中的OsPDS、OsBADH2和OsMPK2等基因進(jìn)行修飾，并獲得了OsPDS基因編輯后雙位點(diǎn)純合的突變植株，為水稻基因定點(diǎn)突變的提供技術(shù)參考。有研究表明，水稻的苯達(dá)松抗性基因Bel功能喪失會導(dǎo)致植株對苯達(dá)松敏感（Pan et al，2006），該特性可用于兩系雜交水稻種子的生產(chǎn)，通過基因編輯使雄性不育系對苯達(dá)松敏感，雜交種子被不育系自交污染的問題就可通過在苗期噴灑苯達(dá)松來解決。Xu等（2014）利用日本晴為材料，對其Bel基因第二內(nèi)含子上的目的序列進(jìn)行編輯，獲得雙等位變異、對苯達(dá)松敏感的轉(zhuǎn)基因苗，有效提高雜交稻生產(chǎn)安全性。Zhou等（2016）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)使水稻溫敏型雄性不育基因tms5發(fā)生特異性突變，以此開發(fā)出11個無轉(zhuǎn)基因成分的改良TGMS品系，在水稻的秈亞種和粳亞種中均具有巨大育種潛力，有效利用了水稻雜種優(yōu)勢。水稻生產(chǎn)中雜草防治是決定產(chǎn)量的重要因素之一，目前草甘膦已成為世界上使用量最大的除草劑。Li等（2016c）利用基因定點(diǎn)替換和定點(diǎn)插入兩種方法實(shí)現(xiàn)了水稻內(nèi)源5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合成酶基因（OsEPSPS）保守區(qū)兩個氨基酸T102I和P106S（TIPS）的定點(diǎn)替換，在T₀代獲得了TIPS定點(diǎn)替換的雜合體，其對草甘膦表現(xiàn)抗性，且TIPS突變能穩(wěn)定地遺傳給下一代。Wang等（2016）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)修飾稻瘟病侵染效應(yīng)因子基因OSERF922，以提高對水稻稻瘟病抗性，結(jié)果表明，通過T₁和T₂代分離可獲得僅含目的基因修飾成分而不含轉(zhuǎn)基因的植株，且6個T₂代純合突變株系在苗期和分蘗期的稻瘟病感染率均較野生型大幅度降低，但其他農(nóng)藝性狀上無明顯差異。水稻產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)基因多為數(shù)量性狀控制，基因編輯為水稻育種提供新思路和新方法。Miao等（2013）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻分蘗基因LAZYI，使其發(fā)生雙等位變異，結(jié)果表明T₁代轉(zhuǎn)基因幼苗的分蘗數(shù)量明顯增多。Shen等（2016）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對5個粳稻品種的粒型基因GS3和穗粒數(shù)基因Gnla進(jìn)行編輯，導(dǎo)致基因突變失活，從而獲得粒長和穗粒數(shù)均明顯增加的株系，但其產(chǎn)量明顯下降。Li等（2016c）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻品種中花11的4個產(chǎn)量相關(guān)基因dep1、gnla、gs3和inal進(jìn)行編輯，結(jié)果表明T2代gnla、depl和gs3基因突變使其穗粒數(shù)增加，穗型密集，籽粒變長，但ipal，基因突變產(chǎn)生兩個相反的表型，一種為分蘗減少、莖稈變粗，另一種為分蘗增多、株高變矮。Xu等（2016）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對粒重基因GW2、GW5和TGW6同時進(jìn)行編輯，結(jié)果得到gw5tgw6和gw2gw5tgw6突變體，其粒重較野生型品種粳稻LH422明顯增加，且3個基因問無互作關(guān)系。沈蘭等（2017）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對4個優(yōu)質(zhì)水稻品種定向改良粒長和穗粒數(shù)性狀，結(jié)果顯示從T₁代即可獲得無選擇標(biāo)記的突變體，其中g(shù)s3和gs3gnla突變體的粒長和千粒重較野生型明顯增加，表明該系統(tǒng)在水稻品種的定向改良工作中應(yīng)用潛力巨大。綜上所述，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻目的基因進(jìn)行編輯和修飾可實(shí)現(xiàn)較理想的突變，有效推進(jìn)水稻品種改良和育種進(jìn)程，雖然部分性狀未達(dá)到預(yù)期效果，但通過進(jìn)一步研究和改進(jìn)一定能達(dá)到預(yù)期效果。

3.2在小麥育種中的應(yīng)用

小麥?zhǔn)钱愒炊啾扼w，其基因組龐大，高倍性和高度重復(fù)的DNA序列使得其正向和反向遺傳分析均難以進(jìn)行。MLO是白粉病抗性基因（Buschges etal，1997）。在小麥中，3個MOL同源基因（TaMLO-Al、TaMLO-B1和TaMLO-D1）在核酸和蛋白水平上的一致性分別為98%和99%。六倍體小麥3個MLO同源位點(diǎn)均發(fā)生自然變異或可遺傳的突變非常困難，因此至今尚未見有天然的或誘導(dǎo)的MLO基因突變的研究報(bào)道。Shan等（2013）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功誘導(dǎo)面包小麥原生質(zhì)體中MLO基因突變。Wang等（2014）在此基礎(chǔ)上采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對單個TaMLO位點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)，最終獲得變異植株，經(jīng)過不完全檢測，從72個T₀轉(zhuǎn)基因小麥株系中鑒定出4個獨(dú)立的突變體，其植株攜帶的突變在TaMLO-Al基因位點(diǎn)上各不相同，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在多倍體的面包小麥中誘導(dǎo)形成有利突變。利用TALEN誘導(dǎo)的TaMLO突變中出現(xiàn)了基因型為tamlo-aabbdd的植株，經(jīng)鑒定其葉子上出現(xiàn)白粉菌落的數(shù)量急劇減少，說明基因編輯可培育持久、廣譜抗性的面包小麥原材料。由此可見，通過優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)可擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因苗的選擇數(shù)量而達(dá)到育種效果。Zhang等（2016）利用CRISPR/Cas9瞬時表達(dá)系統(tǒng)對影響小麥籽粒性狀和分蘗的基因TaGASR7和TaDEPI進(jìn)行編輯，結(jié)果在T₀代即可獲得小麥純合敲除突變體，且突變體的千粒重和分蘗數(shù)明顯增加，但株高降低。

3.3在玉米育種中的應(yīng)用

玉米是最重要的糧飼兼用作物，其籽粒中的植酸占總磷含量的75%，具有抗消化特性，無法被單胃動物消化，易污染環(huán)境。因此，降低玉米籽粒的植酸含量非常重要。Liang等（2014）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對玉米植酸生物合成中的一個催化酶基因即肌醇1，3，4，5，6-戊基磷酸2激酶基因（ZmIPKIA）進(jìn)行編輯，并進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)體瞬時表達(dá)分析，結(jié)果顯示，該基因發(fā)生插入和缺失堿基的變異，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可有效誘導(dǎo)其突變，為選育低植酸含量的玉米品種提供新途徑。Svitashev等（2015）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除玉米的乙酰乳酸合酶基因ALS2，獲得了抗磺胺脲成分除草劑的玉米植株。Shi等（2017）同樣利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了玉米AGROS8突變體，其對乙烯利的敏感性明顯降低，抗旱能力也有所提高，故在干旱脅迫下其籽粒產(chǎn)量仍較高。雖然很多突變體的性狀與預(yù)期培育品種仍存在一定差距，但隨著基因編輯技術(shù)的不斷完善，對其進(jìn)一步基因改良，終會獲得人們生產(chǎn)所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種。

4展望

傳統(tǒng)育種手段仍是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上獲得新品種的主要方法，其周期長、見效慢，且很多作物品種的選育難有重大突破。為解決傳統(tǒng)育種手段的弊端，將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于作物育種，以此拓寬品種選育的遺傳基礎(chǔ)，加快育種效率，但新品種被轉(zhuǎn)入其他物種的基因或DNA片段后，其安全性受到質(zhì)疑。應(yīng)用基因編輯技術(shù)進(jìn)行作物育種，雖然操作過程類似于轉(zhuǎn)基因，但操作對象是自身基因，通過基因編輯使其沉默表達(dá)或獲得等位變異的突變體，從而精確達(dá)到育種目標(biāo)，新品種的安全性更高，因此該技術(shù)受到廣大科技人員的青睞，雖然目前該技術(shù)還存在很多不足，但發(fā)展和應(yīng)用前景巨大。

4.1提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)對目的基因的改良效率

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物細(xì)胞中的應(yīng)用是基于序列核酸酶特異性切割及DNA自我修復(fù)。雖然目前已有大量研究報(bào)道，各種作物在細(xì)胞原生質(zhì)體水平上的基因編輯均有較高的誘變率，可獲得預(yù)期的轉(zhuǎn)基因苗（Shan et al，2013；Brooks et al，2014；Feng et al，2014；Zhang et al，2014；Zhou et al，2014；Wang et al，2014；Ma et al，2015），但成苗率較低，只有增加前期基因編輯的工作量，擴(kuò)大選擇范圍才能獲得預(yù)期的育種材料。由于突變和非突變的細(xì)胞以隨機(jī)方式再生成為幼苗，因此在Cas9和gRNA表達(dá)的細(xì)胞中增加突變細(xì)胞的比例將獲得更多可遺傳突變植株。已有研究表明，Cas9核酸酶的表達(dá)水平與突變頻率呈正相關(guān)，延長培養(yǎng)周期可提高突變細(xì)胞的比例及突變類型的多樣性，促使整個系統(tǒng)提高獲得非嵌合再生植株的能力（Mikami et al，2015）。CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)人植物細(xì)胞中會出現(xiàn)切割一修復(fù)一切割的往復(fù)操作，從而產(chǎn)生無效循環(huán)，降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)對目的基因的修飾效果。Wolfs等（2016）研究認(rèn)為，可通過加入一種RNA導(dǎo)向雙活性位點(diǎn)酶（TevCas9酶）在目的位點(diǎn)產(chǎn)生兩個不兼容的DNA斷裂，有效刪除目的位點(diǎn)的主要部分使其不再重新出現(xiàn)，以保證特異性地靶定基因。另外，CRISPR/Cas9瞬時表達(dá)系統(tǒng)可避免外源DNA的插入而獲得突變體，保證育種材料的安全性。這些技術(shù)的改進(jìn)提高了CRISPR/Cas9系統(tǒng)對目的基因的編輯效率，為作物育種提供技術(shù)支持。

4.2針對不同作物及基因功能設(shè)計(jì)相應(yīng)的操作方案

目前，對不同種類植物進(jìn)行基因編輯，其突變頻率不同，編輯效果也存在差異（Xie and Yang，2013；Fauser et al，2014；Cai et al，2015；Ma et al，2015；Li et al，2016b），因此對目的基因編輯前，要全面評估并設(shè)計(jì)針對性的操作方案。植物是一個有機(jī)整體，基因問存在互作效應(yīng)，簡單地基因敲除并不能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，如Shen等（2016）對影響水稻產(chǎn)量的穗粒數(shù)和粒長基因進(jìn)行敲除時，產(chǎn)量未按預(yù)期效果得到增長。在對目的基因進(jìn)行編輯時，要充分了解其功能原理及其與其他基因問的互作效應(yīng)，如反式作用因子、順式作用元件等對基因的調(diào)控等，根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)基因編輯方案，以期獲得理想的育種材料。另外，多數(shù)基因編輯中涉及轉(zhuǎn)化過程，有些物種在轉(zhuǎn)化過程會出現(xiàn)褐化致死的現(xiàn)象，限制了基因編輯的利用效率，如水稻的秈稻亞種（顧之中等，1992）、荔枝（范翠娜和劉國杰，2006）等。在提高編輯突變效率的同時，需針對不同品種配套選擇培養(yǎng)方法以獲得更多突變植株，提高作物育種效率。