殷玥　李媛媚　黃娟　開(kāi)振鵬　周昌艷　陳珊珊

【摘 要】本文介紹了三代基因編輯技術(shù)ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9的作用機(jī)制和技術(shù)關(guān)鍵，對(duì)利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行昆蟲(chóng)研究相關(guān)的靶標(biāo)選擇案例與實(shí)際應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行介紹。針對(duì)各項(xiàng)實(shí)際案例的研究結(jié)果，系統(tǒng)地對(duì)這項(xiàng)技術(shù)可能出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行分析闡述，展望其在害蟲(chóng)防治方面的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】基因編輯；害蟲(chóng)防治；CRISPR/Cas9

Genome editing and its application in pest control

YIN Yue1，2 LI Yuan-mei2 HUANG Juan3 KAI Zhen-peng2 ZHOU Chang-yan1 CHEN Shan-shan1

（1.Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Institute for Agrifood Standards and Testing Technology， Shanghai201403，China；

2.Shanghai Institute of Technology， College of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai 201400，China；

3.Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China）

【Abstract】This review introduced the genome editing technology and summarizes the application of genome editing in pest control. Then the accounts of prospects and challenges for the use of these technology for pest control were presented. This review provided the reference for the further application of genome editing in pest control.

【Key words】Gene silence； Genome editing； Pest control

0 前言

每年，由于害蟲(chóng)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失和用來(lái)控制害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)劑花費(fèi)都高達(dá)上百億元。同時(shí)，殺蟲(chóng)劑的長(zhǎng)期使用也會(huì)帶來(lái)污染和抗藥性等諸多問(wèn)題。害蟲(chóng)的安全、有效防治一直是植物保護(hù)研究中的主要關(guān)注點(diǎn)。

基因技術(shù)很早就被昆蟲(chóng)學(xué)家作為研究的重要工具。前期主要采用化學(xué)誘變劑和輻射等方式。自1980年轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們對(duì)于昆蟲(chóng)基因的靶向修飾變得越來(lái)越方便和精確。通過(guò)基因的重組和編輯能達(dá)到以低毒的方式對(duì)害蟲(chóng)的數(shù)量進(jìn)行控制。目前常用技術(shù)主要包括：轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)已發(fā)展的較為完善，并已廣泛運(yùn)用在植物保護(hù)中。近年來(lái)，基因編輯技術(shù)得到了極大的發(fā)展。人們通過(guò)注射的手段將外源基因?qū)氲嚼ハx(chóng)體內(nèi)，敲除、修改或加入某種特定基因，從而影響其正常生長(zhǎng)。基因編輯技術(shù)應(yīng)用在諸多昆蟲(chóng)上都得到了較好的驗(yàn)證效果。通過(guò)基因?qū)哟蔚母脑鞂?duì)害蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)控為人們提供了一套安全有效的害蟲(chóng)防治方法。

本文就基因編輯技術(shù)ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9的概況及在害蟲(chóng)防治方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 基因編輯技術(shù)概況

第一代基因編輯技術(shù)采用鋅指蛋白核酸酶（ZFN）。它是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，結(jié)合在DNA的特定位點(diǎn)，由非特異性核酸酶剪切，實(shí)現(xiàn)在DNA特定位點(diǎn)的定點(diǎn)斷裂。第二代基因編輯技術(shù)采用植物病原菌黃單胞菌屬（Xanthomonas）分泌的蛋白激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）識(shí)別特異性的DNA堿基對(duì)，并與之結(jié)合進(jìn)行切割，導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)。盡管相比于ZFNs，TALENs要更加簡(jiǎn)便，但仍需要大量的基因合成和建構(gòu)。第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒的進(jìn)攻所演化而來(lái)的獲得性免疫防御機(jī)制。與ZFNs和TALENs不同的是，CRISPR/Cas9基因編輯不需要重復(fù)的設(shè)計(jì)和表達(dá)Cas9蛋白，只需要產(chǎn)生目的特異性的向?qū)NA（gRNAs）與Cas9蛋白結(jié)合。近期，針對(duì)CRISPR-Cas9 技術(shù)的脫靶效應(yīng)，加州大學(xué)伯克利分校的詹妮弗·杜德納研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)，抗 CRISPR 蛋白AcrllA4能將脫靶效應(yīng)降低四分之一，而整個(gè)過(guò)程中目標(biāo)位點(diǎn)的基因編輯沒(méi)有受到絲毫影響。

2 基因編輯技術(shù)在昆蟲(chóng)研究領(lǐng)域的進(jìn)展

ZFNs在鱗翅目、直翅目、雙翅目昆蟲(chóng)中都成功實(shí)現(xiàn)了基因編輯。Merlin C等人[1]以黑脈金斑蝶的Dpcry2基因?yàn)榘袠?biāo)，通過(guò)體外合成的mRNA注射，成功實(shí)現(xiàn)了基因敲除，在細(xì)胞S期的敲除率最高可達(dá)88%。McMeniman等人[2]以埃及伊蚊的AaGr3基因?yàn)榘袠?biāo)，不僅實(shí)現(xiàn)了基因敲除，還進(jìn)行了基因片段插入的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到基因敲除的率達(dá)到43.8%，插入的結(jié)果僅為0.49%。但在果蠅中，Rosy基因的插入實(shí)驗(yàn)成功率可達(dá)到60%[3]?；虻牟迦牒颓贸诩?xì)胞周期的不同階段得到的結(jié)果也不同。由于設(shè)計(jì)有效的ZFNs存在困難，且成本較高，目前在昆蟲(chóng)研究上應(yīng)用較少。

TALENs技術(shù)在鱗翅目、直翅目、雙翅目昆蟲(chóng)的基因編輯中都有成功的案例。Xu等人[4]以家蠶為研究對(duì)象，以性別決定相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)，整合包含系統(tǒng)組件的相關(guān)基因，基因敲除率達(dá)到100%。除了轉(zhuǎn)基因的方式，TALENs也可以通過(guò)注射體外合成的mRNA進(jìn)行基因敲除，在埃及伊蚊中敲除率可達(dá)到90%[5]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然才被人們發(fā)現(xiàn)不久，但已經(jīng)受到諸多研究者的關(guān)注。目前研究對(duì)象主要包括鱗翅目、直翅目、半翅目昆蟲(chóng)。目前，人們對(duì)于提高基因編輯效率采用了三種不同的方案：（1）引入質(zhì)粒載體，體外編碼Cas9的RNA和sgRNA[6]；（2）注射質(zhì)粒sgRNA相關(guān)DNA到轉(zhuǎn)基因后的果蠅體內(nèi)[7]；（3）建立一個(gè)包含Cas9-sgRNA的轉(zhuǎn)基因模型[8]。根據(jù)比較，Shih-Ching Lin得出了建立生物模型更為高效的結(jié)論。Gratz SJ等人還嘗試將該系統(tǒng)與Cre-loxP系統(tǒng)聯(lián)合使用，篩選效率更高。該系統(tǒng)關(guān)鍵在3xP3-RFP基因，相比于過(guò)去的基因插入技術(shù)，Cre-loxP與CRISPR/Cas9聯(lián)用能有效提高基因編輯的成功率，為解決脫靶率高這一問(wèn)題提供了解決手段。Honglun Bi等人[9]以鱗翅目害蟲(chóng)斜紋夜蛾為研究對(duì)象，利用Cas9對(duì)其Slabd-A基因進(jìn)行編輯，最終成功地抑制了該基因的表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)相關(guān)基因的編輯對(duì)害蟲(chóng)起到致命的作用。并且研究還開(kāi)創(chuàng)了一種有效的顯微注射方法，在注射后，死亡率大大提升。endprint

近期，主要由埃及伊蚊傳播的寨卡病毒在南美，尤其在巴西大爆發(fā)。目前生物技術(shù)公司Oxitec已經(jīng)研發(fā)出轉(zhuǎn)基因蚊子。他們通過(guò)基因編輯技術(shù)將Oxitec基因插入蚊子體內(nèi)，使得其后代未成為成蟲(chóng)就死亡。轉(zhuǎn)基因的埃及伊蚊在被放入野外后與雌蚊交配，產(chǎn)生的后代無(wú)法活到成年。該公司試驗(yàn)點(diǎn)的蚊子能減少90%。這是直接將基因編輯技術(shù)應(yīng)用到害蟲(chóng)防治領(lǐng)域的一次嘗試，其結(jié)果顯示基因編輯作為一種新的害蟲(chóng)防治手段具有可行性。

3 基因編輯技術(shù)在害蟲(chóng)防治方面的應(yīng)用前景及問(wèn)題

基因編輯技術(shù)，尤其是CRISPR/Cas9為昆蟲(chóng)學(xué)家提供了一種控制害蟲(chóng)的新方法。通過(guò)基因編輯技術(shù)能產(chǎn)生新基因型或產(chǎn)生與其他昆蟲(chóng)相似的基因型。在對(duì)蚊子的研究中，研究者一直在尋找一種消除或改變蚊子表現(xiàn)型的方法[10]。Galizi R等人[11]利用核酸內(nèi)切酶表達(dá)具有組織特異性和階段特異性的基因，表達(dá)該基因的雄性按蚊產(chǎn)生的后代都為含Y染色體的雄性。由此形成了一個(gè)性別比例失衡的系統(tǒng)，有效降低了按蚊的種群數(shù)量?；蚓庉嫷哪康囊部赡苁歉淖兒Γㄏ罗D(zhuǎn)第42頁(yè)）（上接第51頁(yè)）蟲(chóng)的表現(xiàn)型，使之無(wú)害。另外利用基因編輯技術(shù)，研究害蟲(chóng)基因功能，發(fā)現(xiàn)的殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)，也是行之有效的害蟲(chóng)防治策略之一。

基因編輯技術(shù)應(yīng)用于害蟲(chóng)防治上具有很大的潛力，但一項(xiàng)技術(shù)被用于實(shí)踐還要考慮兩方面的因素：（1）是否有相應(yīng)的技術(shù)將此系統(tǒng)遞送到特定的細(xì)胞，并在特定的階段得到表達(dá)。（2）目標(biāo)物種能否控制交配和篩選過(guò)程并進(jìn)行基因分析。

目前，基因編輯技術(shù)缺乏成功的實(shí)踐范例以及能廣泛使用的框架。在一些范例中，最終并沒(méi)有產(chǎn)生基因突變，未得到預(yù)期的效果[12]。對(duì)于基因編輯技術(shù)，不僅要考慮其有效性，還要考慮對(duì)環(huán)境帶來(lái)的影響。這些都還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語(yǔ)

利用生物手段對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行控制能有效解決抗藥性和化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生的污染等問(wèn)題，可能是未來(lái)害蟲(chóng)防治的主要手段，而基因編輯的效果已在研究階段得到了很好的驗(yàn)證，相信隨著研究的進(jìn)一步深入，該項(xiàng)技術(shù)存在的問(wèn)題能得到解決并廣泛應(yīng)用到害蟲(chóng)的防治中。同時(shí)，我們認(rèn)為基因編輯技術(shù)可以與常規(guī)的化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)用，在害蟲(chóng)防治中共同發(fā)揮作用。

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[責(zé)任編輯：朱麗娜]endprint