蔣瑩瑩，鐵 偲，王 揚，程香普，卞丹丹，王 婷，劉 梅，段鐘平，鄭素軍，張金蘭

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院疑難肝病與人工肝中心，北京 100069；2.協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全世界的重要公共衛(wèi)生問題，據(jù)統(tǒng)計，全球約有30%的人口目前或既往曾感染過HBV。HBV感染是肝硬化和肝癌的重要病因，約40%的男性和15%的女性慢性HBV感染者最終死于肝硬化或肝細(xì)胞癌(hepato cellular carcinoma,HCC)[1-2]。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是目前臨床上HCC診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測最靈敏、最特異的腫瘤標(biāo)志物[3]。盡管如此，在HCC患者中，只有約60%的患者出現(xiàn)AFP的升高，即高達(dá)40%的HCC無法通過篩查AFP來早期發(fā)現(xiàn)[4]。由于HBV相關(guān)HCC多數(shù)在肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生，尋找特異的、能將AFP陰性HCC與乙肝肝硬化相區(qū)別的腫瘤標(biāo)志物，則有助于AFP陰性HCC的篩查、早期診斷和及時治療，最終提高該類患者的生存率。

近來研究[5]顯示，鞘脂不僅是構(gòu)成細(xì)胞膜不可或缺的基本成分，且是重要的脂質(zhì)調(diào)控分子，在介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號傳遞過程中起到重要作用，是目前研究的熱點。多項研究[5-10]顯示，鞘脂組學(xué)代謝參與到乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，且鞘脂代謝紊亂參與了HCC的發(fā)病過程。因此，我們推測，基于HBV相關(guān)AFP陰性HCC(本文簡稱“乙肝相關(guān)AFP陰性HCC”)患者外周血清鞘脂表達(dá)譜，有可能篩選出其診斷標(biāo)志物。本研究對此進(jìn)行了初步探索，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2014年7月至2015年5月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院疑難肝病及人工肝中心住院的64例患者，包括49例乙肝肝硬化患者及15例乙肝相關(guān)AFP陰性HCC患者。所有納入本研究的患者血清HBsAg或HBV DNA陽性超過6個月。所有收集的血清標(biāo)本在-80 ℃冰箱冷凍保存。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)、生物化學(xué)或血液學(xué)檢查存在肝細(xì)胞合成功能障礙或門靜脈高壓癥(如脾功能亢進(jìn)及食管胃底靜脈曲張)證據(jù)，或組織學(xué)符合肝硬化診斷(例如Metavir評分=4分或Ishak評分≥5分)；或Fibroscan的結(jié)果>17.5 kPa。所有患者經(jīng)影像學(xué)或肝穿病理檢查排除HCC。

AFP陰性HCC的診斷標(biāo)準(zhǔn)：血清AFP陰性(≤20 ng/ml)。病灶直徑1～2 cm情況下，兩種影像學(xué)(CT、MRI)檢查均存在HCC典型表現(xiàn)(動脈期快速不均質(zhì)血管強化，而靜脈期或延遲期快速洗脫)；病灶直徑≥2 cm時，CT和MRI兩項影像學(xué)檢查中，有一項顯示上述HCC的特征；或經(jīng)肝臟組織病理診斷確診[11]?；颊呔鶠槭状卧\斷HCC，在采集血標(biāo)本時未接受過手術(shù)(包括肝移植)、介入、放化療、血管靶向藥物等任何針對HCC的相關(guān)治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：其他病因(包括自身免疫性、酒精性或藥物性)導(dǎo)致的慢性肝??；除肝臟損傷外伴有其他嚴(yán)重的活動性身心疾病，包括未被控制的原發(fā)性腎臟、心臟、肺臟、血管性、神經(jīng)性、代謝性疾病(明顯甲亢、嚴(yán)重糖尿病和腎上腺疾病)；脂質(zhì)代謝異常：嚴(yán)重高脂血癥、脂質(zhì)貯積病、肥胖癥(BMI≥25 kg/m2)、免疫缺陷病或合并其他系統(tǒng)腫瘤等；妊娠期或哺乳期。

1.3血樣本的檢測血清鞘脂的檢測采用高效液相色譜法與串聯(lián)質(zhì)譜法(high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所完成。HPLC-MS/MS在帶有電噴霧接口的H重四極質(zhì)譜分析儀和Agilent 1200 RRLC系統(tǒng)的Agilent 6410B 三級四級質(zhì)譜儀(Agilent Technologies Inc, Santa Clara, 美國)上進(jìn)行。本課題組既往已有多項研究[7,12-14]使用該方法檢測血樣本鞘脂濃度。

肝功能、AFP等檢測由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院檢驗中心完成。使用自動生化檢測器(AU640生化分析儀，OLYMPUS，日本)進(jìn)行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等生化指標(biāo)的測定。血清APF檢測使用ADVIA Centaur XP免疫分析系統(tǒng)(Siemens)。

2 結(jié)果

2.1患者一般臨床特征64例患者中，男52例，女12例，年齡(53.33±11.56)歲。盡管乙肝相關(guān)AFP陰性HCC組患者ALT、AST較乙肝肝硬化組患者水平高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者的肝臟纖維化指標(biāo)(FIB-4評分、APRI評分)及肝病嚴(yán)重程度的指標(biāo) (凝血功能、TBIL、ALB、MELD評分等)相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 乙肝相關(guān)AFP陰性HCC患者和乙肝肝硬化患者一般特征Tab 1 The characteristics of HBV-related AFP negative HCC and cirrhosis patients

注: TBIL: 總膽紅素；DBIL: 直接膽紅素；TP:總蛋白；ALB: 白蛋白；GGT: 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；PLT: 血小板；PTA: 凝血酶原活動度；INR: 國際標(biāo)準(zhǔn)化比率；APTT: 活化部分凝血活酶時間；MELD: 終末期肝病模型。

2.2乙肝相關(guān)AFP陰性HCC患者血清鞘脂表達(dá)情況本研究共檢測了61種鞘脂，其中14種鞘脂水平在兩組患者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。對該14種鞘脂表達(dá)水平進(jìn)行正態(tài)、UV處理后，使用OPLSDA模型探索潛在的能夠區(qū)分乙肝相關(guān)AFP陰性HCC和乙肝肝硬化的鞘脂標(biāo)志物，滿足既定三個條件的鞘脂分別為Cer(d18∶1/8∶0)-1-P、Sphingosine (d17∶1)-1-P和Sphingosine (d18∶1)-1-P。這三種血清鞘脂在乙肝相關(guān)AFP陰性HCC患者中的水平分別為217.74 pmol/0.1 ml、62.99 pmol/0.1 ml、58.28 pmol/0.1 ml，分別高于乙肝肝硬化患者的207 pmol/0.1 ml、57.81 pmol/0.1 ml、56.26 pmol/0.1 ml(P均≤0.001)。

將三種鞘脂納入Logistic多因素回歸分析，結(jié)果表明，Cer(d18∶1/8∶0)-1-P (OR=0.667,95%CI: 0.481～0.923,P<0.05)與乙肝相關(guān)AFP陰性HCC獨立相關(guān)(見表3)。

表2 乙肝相關(guān)AFP陰性HCC、乙肝肝硬化患者血清鞘脂水平Tab 2 Serum sphingolipid levels in HBV-related AFP-negative HCC and cirrhosis patients pmol/0.1 ml

續(xù)表2

鞘脂總例數(shù) (n=64)均值 標(biāo)準(zhǔn)誤乙肝肝硬化(n=49)均值標(biāo)準(zhǔn)誤乙肝相關(guān)AFP陰性HCC(n=15)均值標(biāo)準(zhǔn)誤Z值P值Cer(d18∶1/22∶0)5465.16550.95379.6601.355744.661330.23-0.3880.698Cer(d18∶1/24∶0) 14501.361821.5712398.831146.0121369.656678.13-0.7530.452Cer(d18∶1/24∶1) 35961.394611.1530627.362923.6853385.8916857.7-0.8160.414Cer(d18∶1/26∶0) 629.7791.24484.4943.431104.38343.05-2.6550.008Cer(d18∶1/26∶1)1613.69256.661205.89118.682945.86970.3-2.6070.009C28(octacosanoic acid derivatives)60.250.260.080.1560.80.72-0.8560.392Cer(d18∶1/8∶0)-1-P209.520.822070.36217.742.25-4.6520.000Cer(d18∶1/12∶1)-1-P 88.952.4888.963.1988.931.95-1.4580.145Cer(d18∶1/14∶1)-1-P 60.360.1560.320.1860.490.26-1.0940.274Cer(d18∶1/14∶0)-1-P(a)60.910.2360.820.2761.20.46-0.8560.392Cer(d18∶1/14∶0)-1-P(b)108.397.72111.129.8699.496.97-0.8160.414Cer(d18∶1/16∶0)-1-P89.925.5894.47.0875.323.96-1.1410.254Cer(d18∶1/16∶1)-1-P 73.473.874.364.8170.564.1-1.0860.278Cer(d18∶1/18∶0)-1-P7064.12909.657476.151148.555718.15971.34-0.2300.818Cer(d18∶1/18∶1)-1-P 978.59164.841080.29210.29646.39127-0.1030.918Cer(d18∶1/20∶1)-1-P 121.5723.27132.6830.2785.273.66-0.8000.424Cer(d18∶1/20∶0)-1-P 411.7759.33424.6974.88369.5467.97-0.0080.994Cer(d18∶1/22∶0)-1-P 82.933.0781.152.8888.759.24-0.6580.511Cer(d18∶1/22∶1)-1-P 60.810.2460.620.2561.430.61-1.3310.183Cer(d18∶1/26∶0)-1-P 736.8166.99753.6984.59681.6475.71-0.7690.442Cer(d18∶1/26∶1)-1-P643.2656.49654.1871.37607.5964.07-0.7850.433Cer(d18∶1/28∶0)-1-P 293.1629.27299.5936.53272.1538.19-0.6100.542Cer(d18∶1/28∶1)-1-P 501.7538.69491.1147.21536.560.56-1.3870.166HexCer (d18∶1/8∶0) 184.350.02184.340.02184.370.03-1.9730.048HexCer (d18∶1/12∶0) 63.850.1863.910.2163.640.33-1.5290.126HexCer (d18∶1/14∶0)211.870.67212.420.85210.070.53-1.6560.098HexCer (d18∶1/14∶1) 216.511.21217.421.53213.561.05-1.1170.264HexCer (d18∶1/16∶0) 19762.871758.921277.852210.1214813.921551.51-2.2270.026HexCer (d18∶1/16∶1) 723.158.42767.9874.71576.4931.83-1.0380.299HexCer (d18∶1/18∶0) 392.3721.79417.7526.91309.4719.16-2.1630.031HexCer(d18∶1/18∶1) 541.9737.41582.5546.43409.4132.95-2.2430.025HexCer (d18∶1/20∶0) 206.877.99207.959.78203.3712.31-0.1660.868HexCer (d18∶1/20∶1) 414.0517.43418.1421.35400.6526.65-0.0550.956HexCer (d18∶1/22∶0) 1596.64104.471557.5127.491724.48161.19-1.4820.138HexCer(d18∶1/22∶1) 254.9428.41257.6935.65245.9735.38-0.5470.585HexCer (d18∶1/24∶0) 4180.1279.594067.61293.864547.55721.91-0.1190.905HexCer (d18∶1/24∶1) 65370.123709.8765956.974099.3263453.098700.55-0.6100.542dhSphingosine (d18∶1/18∶0)31.242.2128.741.8839.406.95-2.2270.026dhS(d18∶1/18∶0)-1-P 56.40.0856.350.156.560.14-2.3980.016dhCer(d18∶0/18∶0) 61.650.4461.760.5661.290.37-0.9830.326dhCer (d18∶0/18∶1)67.672.1569.332.7562.280.93-1.4740.140dhCer (d18∶0/20∶0) 65.941.3366.981.762.550.75-0.5150.606dhCer(d18∶0/24∶0) 851.4184.97934.11106.28581.2472.67-1.8310.067dhCer (d18∶0/24∶1) 2366.59326.391970.17198.353661.541203.43-0.9590.338dhCer (d18∶0/16∶0)-1-P 294.3734.23316.2643.79222.8623.07-0.8640.388dhCer (d18∶0/16∶0)1-1-P186.2519.89174.6920.67224.0351.76-1.4030.161dhCer (d18∶0/18∶0)-1-P 219.624.63241.6231.21147.6916.01-1.0300.303dhCer (d18∶0/18∶1)-1-P86.811.1292.0714.4769.591.59-0.6100.542

續(xù)表2

鞘脂總例數(shù) (n=64)均值標(biāo)準(zhǔn)誤乙肝肝硬化(n=49)均值標(biāo)準(zhǔn)誤乙肝相關(guān)AFP陰性HCC(n=15)均值標(biāo)準(zhǔn)誤Z值P值dhCer (d18∶0/24∶1)-1-P 60.870.2660.710.3361.370.32-2.4730.013HexSph(d18∶1) 46.80.4146.70.547.120.64-1.9730.048Sphingosine (d17∶1)-1-P 59.020.5757.810.3462.991.84-3.3840.001Sphingosine (d18∶1)-1-P56.730.2156.260.0958.280.73-4.0300.000Sphingosine(d18∶1)83.023.7480.593.8690.979.81-1.1330.257

2.3血清Cer(d18∶1/8∶0)-1-P對乙肝相關(guān)AFP陰性HCC診斷的預(yù)測價值血清Cer(d18∶1/8∶0)-1-P cut-off值為208.81 pmol/0.1 ml時，其預(yù)測乙肝相關(guān)AFP陰性HCC的靈敏度為81.6%(95%CI：68.0%～91.2%)，特異度為86.7%(95%CI：59.5%～98.3%)。ROC曲線下面積為0.899(95%CI：0.798～0.960，P<0.001)(見圖1)。

表3 三種鞘脂的Logistic多因素回歸分析Tab 3 Logistic regression analysis of three sphingolipids

3 討論

在中國，慢性乙型肝炎是導(dǎo)致肝硬化、HCC最重要的原因。由于APF陰性HCC早期篩查往往因AFP沒有陽性結(jié)果而容易被忽視，且HCC早期癥狀不典型，導(dǎo)致部分患者到臨床并發(fā)癥出現(xiàn)時才被確診，而此時已經(jīng)失去了治療的最佳時機[17]。篩選新的診斷標(biāo)志物，用來鑒別乙肝相關(guān)AFP陰性HCC及乙肝肝硬化，至關(guān)重要！本研究采用高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，對乙肝相關(guān)AFP陰性HCC血清中61種鞘脂進(jìn)行了檢測分析，首次發(fā)現(xiàn)Cer(d18∶1/8∶0)-1-P與乙肝相關(guān)AFP陰性HCC獨立相關(guān)(OR=0.667, 95%CI∶ 0.481～0.923,P<0.05)，其診斷的靈敏度為81.6%，特異度為86.7%。

神經(jīng)酰胺(ceramide)、鞘氨醇(sphingosine)、鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate)、神經(jīng)酰胺-1-磷酸(ceramide-1-phosphoric acid)等分子構(gòu)成了鞘脂家族，而神經(jīng)酰胺位于鞘脂代謝的中心。近年來，已有研究者在分子水平和小鼠模型中將鞘脂代謝與HCC的發(fā)病機制聯(lián)系起來[18-19]。盡管有研究曾用鞘脂來鑒別HCC和肝硬化[20]，但用鞘脂來鑒別乙肝相關(guān)AFP陰性HCC及乙肝肝硬化的研究尚未見報道。

GRAMMATIKOS等[20]針對長鏈(C16-C20)和非常長鏈(C22-C24)神經(jīng)酰胺，及神經(jīng)酰胺相關(guān)代謝產(chǎn)物,對其鑒別HCC和肝硬化作用進(jìn)行了相關(guān)研究。發(fā)現(xiàn)，與肝硬化患者相比，血清鞘磷脂代謝物水平在HCC患者中顯示上調(diào)，特別是C16-神經(jīng)酰胺和鞘氨醇-1-磷酸可以作為鑒別肝病患者HCC的新型診斷標(biāo)記物。與GRAMMATIKOS等的研究相比較，本研究不僅檢測了包含長鏈(C16-C20)和非常長鏈(C22-C24)，同時也包含了短鏈(C8-C14)，檢測的鞘脂種類更全面。有趣的是，本研究雖然也發(fā)現(xiàn)C16-神經(jīng)酰胺對于鑒別乙肝相關(guān)AFP陰性HCC及乙肝肝硬化具有一定的意義，但最終Logistic多因素回歸分析顯示，只有Cer(d18∶1/8∶0)-1-P與乙肝相關(guān)AFP陰性HCC獨立相關(guān)，表明乙肝相關(guān)AFP陰性HCC的鞘脂表達(dá)譜存在疾病獨特性。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)血清Cer(d18∶1/8∶0)-1-P水平上調(diào)有助于乙肝相關(guān)AFP陰性HCC的診斷，為潛在的診斷標(biāo)志物。但本研究也存在一些局限：我們的隊列納入64例患者，但乙肝相關(guān)AFP陰性HCC患者僅15例，研究結(jié)果需要進(jìn)一步用大樣本的臨床隊列來進(jìn)行驗證；同時，Cer(d18∶1/8∶0)-1-P是否對其他病因?qū)е碌腁FP陰性HCC也存在診斷價值，及其在HCC發(fā)病中作用，這也需要進(jìn)一步研究。

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