陳 蕾， 成家楊， 謝 靖， 唐 杰

(北京大學(xué)深圳研究生院，廣東深圳 518055)

浮萍(Lemnaminor)是最小的和最簡(jiǎn)單的水生植物之一，廣泛分布于世界各地，多生長(zhǎng)于湖泊、河流灣汊、沼澤、農(nóng)田等靜水之中。經(jīng)過(guò)幾十年的調(diào)查研究，目前已知的浮萍共分為5屬38種，分別為青萍屬(Lemna)、多根紫萍屬(Spirodela)、少根紫萍屬(Landoltia)、蕪萍屬(Wolffia)和無(wú)根蕪萍屬(Wolffiella)[1]。而中國(guó)的浮萍則以青萍、多根紫萍、少根紫萍和蕪萍為主，共4屬12種[2]。浮萍因其繁殖速度快、淀粉含量高、生物質(zhì)產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)，而成為極具潛力的新一代生物能源原料。Landolt等的研究結(jié)果表明，在適宜的生長(zhǎng)條件下，浮萍的淀粉含量最高可達(dá)75%[3]；而Xu等的研究發(fā)現(xiàn)，浮萍的生物質(zhì)干質(zhì)量產(chǎn)量可達(dá)39.1～105.9 t/hm2，遠(yuǎn)高于玉米、柳枝稷、芒草等能源植物[4]。

浮萍除了作為生物能源的原料外，在污水處理領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，這主要?dú)w因于浮萍對(duì)各種水環(huán)境的較強(qiáng)適應(yīng)力，以及其去除污水中的氮、磷和重金屬的能力。如Xu等研究發(fā)現(xiàn)，紫萍能夠很好地去除豬場(chǎng)稀釋廢水中的氨氮和磷酸磷，去除率分別為1.08、0.10 g/(m2·d)[5]；Miretzky等模擬自然環(huán)境的水污染，研究浮萍對(duì)重金屬Fe、Zn、Mn、Cu、Cr和Pb的去除效果，結(jié)果表明，浮萍對(duì)這6種重金屬的去除率分別可達(dá)78.47%、97.56%、95.20%、90.41%、96.64%和98.55%[6]；Dirilgen研究了不同Cr濃度條件下，青萍對(duì)Cr吸附效果的差異，結(jié)果表明，在pH值為5.0的條件下，當(dāng)Cr處理濃度取 10 mg/L 時(shí)，青萍單位鮮質(zhì)量去除量達(dá)最高，可達(dá)(863±38.8) mg/kg[7]。

浮萍雖具有潛在的污水處理能力，但不同種屬浮萍甚至不同來(lái)源的同種浮萍在污染水體中的生長(zhǎng)狀況以及污水凈化效果存在明顯差異[8-13]。例如，Kanoun-Boule等研究發(fā)現(xiàn)，青萍對(duì)Cu的富集效果優(yōu)于紫萍[10]；Chaudhuri等研究了不同濃度下青萍和紫萍對(duì)水體中Cd的去除能力，去除率分別為42%～78%和52%～75%[14]；紫萍對(duì)Cd的去除效果優(yōu)于青萍，單位鮮質(zhì)量去除量最高可達(dá)7 711.00 mg/kg；周雄飛研究發(fā)現(xiàn)，不同種屬浮萍對(duì)總氮、總磷的去除效果不同，當(dāng)青萍和紫萍以 1 ∶2 的比例混合培養(yǎng)時(shí)，對(duì)總氮、總磷的去除效果最好[15]。由此可見(jiàn)，浮萍對(duì)污水的耐受能力及處理效果與浮萍種屬以及污水類型有直接關(guān)系。而自然界中的浮萍種屬分布是否與其生活的水環(huán)境因子相關(guān)仍然不清楚，而相關(guān)研究結(jié)果對(duì)未來(lái)利用浮萍修復(fù)自然水體具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究以江蘇、廣東2省的浮萍材料及其生活水環(huán)境為研究對(duì)象，調(diào)查區(qū)域性的浮萍分布及其生長(zhǎng)水環(huán)境，并研究浮萍分布與水環(huán)境因子的相關(guān)性。本研究選擇江蘇、廣東2地進(jìn)行取樣主要基于以下2個(gè)原因：(1)江蘇、廣東分別位于長(zhǎng)三角、珠三角地區(qū)，都是工農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)的省份，淡水資源污染呈上升趨勢(shì)[16-17]。而對(duì)該地區(qū)浮萍的分布及其生長(zhǎng)的水環(huán)境調(diào)查開(kāi)展較少，限制了該地區(qū)浮萍資源的開(kāi)發(fā)以及在水體凈化方面中的應(yīng)用。(2)兩省地理位置相隔較遠(yuǎn)。較單一地區(qū)樣品以及多地區(qū)樣品更具有一般性，有助于保證相關(guān)性研究的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 浮萍和水樣采集

2015年4月，在江蘇、廣東2省隨機(jī)選擇了59個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行樣品采集，樣品采集地的GPS信息和浮萍分布如表1所示。

表1 樣品采集地浮萍分布及采集地經(jīng)緯度

注：La、Lp、Sp、Wg分別代表青萍、多根紫萍、少根紫萍和蕪萍；La+Sp代表青萍和多根紫萍共生；Sp+Wg代表多根紫萍和蕪萍共生。

浮萍樣品采集后，立即裝入7.5 cm×10 cm的無(wú)菌密封袋中，并放置在簡(jiǎn)易冰盒中保存。同時(shí)，取40～50 mL的表層水樣于50 mL離心管中，立即放入冰盒中保存。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行預(yù)處理。水樣放入-20 ℃冰箱保存，而浮萍則按以下方法進(jìn)行處理：首先用蒸餾水清洗浮萍，去除雜質(zhì)；然后用0.5% NaClO溶液對(duì)浮萍葉片消毒1 min，再用去離子水漂洗2～3次，放入SH改良培養(yǎng)液中培養(yǎng)。SH改良培養(yǎng)液成分：硝酸鉀2.50 g/L，硫酸鎂0.20 g/L，磷酸二氫銨 0.30 g/L，無(wú)水氯化鈣0.15 g/L，乙二胺四乙酸二鈉 19.80 mg/L，六水氯化鈷0.10 mg/L，無(wú)水硫酸銅0.20 mg/L，硼酸5.00 mg/L，碘化鉀1.00 mg/L，一水硫酸錳10.00 mg/L，二水鉬酸鈉0.10 mg/L，七水硫酸鋅1.00 mg/L。設(shè)置光照培養(yǎng)箱的溫度為25 ℃，光照度為7 000 lx，光—暗周期為16 h—8 h，使其盡快適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，快速增殖擴(kuò)大生物量，用于浮萍分子鑒定。

1.2 浮萍種屬鑒定

采用DNA Barcoding鑒定浮萍種屬。使用植物基因組DNA提取試劑盒(深圳新拓?fù)渖锟萍加邢薰?提取浮萍的總DNA，并合成用于擴(kuò)增atpF-atpH間隔序列的引物(Forward：5′-ACTCGCACACACTCCCTTTCC-3′；Reverse：5′-GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT-3′)[18]。以浮萍總DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增atpF-atpH間隔序列。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，49 ℃退火 1 min，72 ℃延伸40 s，共進(jìn)行35循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送到華大基因(BGI)進(jìn)行測(cè)序。采用Lasergene.v7.1軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和拼接，將組裝序列在NCBI網(wǎng)站上(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行Blast比對(duì)。根據(jù)Blast比對(duì)結(jié)果，選取參考浮萍序列。在MEGA 6.0軟件中采用Neighbor-joining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，分析本研究收集浮萍與參考浮萍間的親緣關(guān)系。

1.3 水樣分析

1.3.1 水體pH值、氨氮、硝氮、總磷含量的測(cè)定 水樣在測(cè)定之前，先用0.45 μm的濾膜過(guò)濾除雜，而后分別測(cè)定水體pH值(雷磁PHS-25)、氨氮含量(納氏試劑分光光度法HJ535-2009)、硝氮含量(紫外雙波長(zhǎng)分光光度法)、總磷含量(過(guò)硫酸鉀氧化-鉬酸銨分光光度法GB 11893—1989)。

1.3.2 水體重金屬濃度的測(cè)定 水樣過(guò)0.22 μm的濾膜后，稀釋10倍，采用Thermo Fisher X SERIESⅡ測(cè)量樣品中重金屬的濃度。首先，配制成0、20、25、50、100 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以比率與濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb這7種元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。然后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，計(jì)算水體中Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb這7種重金屬的濃度。

1.4 浮萍種質(zhì)資源分布與水環(huán)境影響因子相關(guān)性分析

采用CANOCO 4.53軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(DCA)和RDA分析。首先進(jìn)行DCA分析。DCA是一種間接排序方法，能夠?qū)⒎治鰧?duì)象在二維和三維空間加以梯度排列，一般來(lái)說(shuō)，梯度長(zhǎng)度小于3，選擇線性模型比較合理，介于3～4之間，單峰模型和線性模型都是合適的，梯度大于4，選擇單峰模型比較合理。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行DCA分析后，梯度長(zhǎng)度為1.456 4(<3)，因此使用線性模型RDA分析浮萍種屬與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系。在RDA排序圖內(nèi)，環(huán)境因子一般用箭頭表示，箭頭連線的長(zhǎng)度代表某個(gè)環(huán)境因子與種屬分布間相關(guān)程度的大小，連線越長(zhǎng)，說(shuō)明相關(guān)性越大。為消除量綱的影響，分析前用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)g(x+1)處理。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行。利用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 浮萍種屬鑒定

本研究總共獲得了59份浮萍樣品，其中4個(gè)樣品存在2種浮萍共生現(xiàn)象(表1)，故共獲得63株浮萍。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)鑒定(圖1)，63株浮萍分別屬于青萍(51株)、多根紫萍(9株)、少根紫萍(2株)和蕪萍(1株)。結(jié)合表1可以看出，2個(gè)省的樣品采集地浮萍分布均以青萍為主，其次是多根紫萍和少根紫萍。該結(jié)果與Tang等的研究[19]一致，表明在中國(guó)青萍的分布占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，這可能跟其適應(yīng)性相關(guān)。而本研究中鑒定的浮萍，除了JS10、JS20與參考浮萍L.aequinoctialis6612的相似度為97.7%和99.7%外，其余61株浮萍與其對(duì)應(yīng)參考浮萍的相似度均為100%。結(jié)果表明這些浮萍的atpF-atpH基因序列相對(duì)保守，適合用于系統(tǒng)發(fā)育分析，能準(zhǔn)確鑒定出浮萍的種屬。

2.2 浮萍生長(zhǎng)環(huán)境

分別從平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、范圍、中位數(shù)和變異系數(shù)對(duì)水樣結(jié)果進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)浮萍生長(zhǎng)水體的水質(zhì)狀況。因樣品中少根紫萍和蕪萍的數(shù)量較少，因此只列出了測(cè)定結(jié)果，而沒(méi)有進(jìn)行其他統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2.1 浮萍生長(zhǎng)水體的水質(zhì)狀況(pH值、氨氮、硝氮、總磷) 從表2中浮萍生長(zhǎng)的pH值范圍和中位數(shù)可以看出，青萍、多根紫萍均適宜在偏堿性的水體中生長(zhǎng)，而少根紫萍和蕪萍也采自堿性水體。青萍在6.70～9.50的酸堿環(huán)境中均有分布，相對(duì)于多根紫萍能夠適應(yīng)更廣范圍的pH值。張飛等對(duì)太湖流域的水體調(diào)查結(jié)果表明，青萍在pH值6.34～8.78的范圍均有分布[20]，該研究中青萍具有更廣的酸適應(yīng)性，而本研究中的青萍具有更廣的堿適應(yīng)性。這些研究結(jié)果表明，青萍對(duì)水體pH值的耐受范圍優(yōu)于其他種屬。因此，青萍可優(yōu)先考慮用作治理pH值變化較大的水體。

根據(jù)我國(guó)GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》相關(guān)規(guī)定，V類水的氨氮濃度≤2.0 mg/L，總磷濃度≤0.4 mg/L。而本次采集的59份水樣中，有25份水樣的氨氮濃度、38份水樣的總磷濃度超過(guò)了V類水標(biāo)準(zhǔn)?？傮w來(lái)看，本次采樣地區(qū)的水體存在一定的氮、磷污染，部分水體污染較為嚴(yán)重。

本研究中青萍生長(zhǎng)水體的氨氮濃度平均值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3個(gè)種屬，且青萍在氨氮濃度0～5.02 mg/L的范圍均有分布，說(shuō)明青萍對(duì)氨氮的耐受能力強(qiáng)，且適宜在氨氮濃度較高的水體中生長(zhǎng)。因此，后續(xù)可進(jìn)一步研究、篩選青萍品種治理氨氮污染水體。通過(guò)對(duì)比青萍和多根紫萍的水體環(huán)境發(fā)現(xiàn)，青萍生長(zhǎng)水體的硝氮濃度范圍是多根紫萍的2.5倍，平均值略低于多根紫萍。而張飛等的研究中，青萍與多根紫萍在水體硝氮濃度方面的差異并不顯著[20]。這表明，不同來(lái)源的同種浮萍對(duì)硝氮的耐受能力存在差異，因此對(duì)地理小種生理特性的鑒定是非常必要的。此外，本研究中青萍所生長(zhǎng)水體總磷的平均值為1.35 mg/L，為多根紫萍的1.5倍，且總磷濃度最高的采樣點(diǎn)亦為青萍生長(zhǎng)的水體，說(shuō)明青萍對(duì)總磷的耐受能力更高，在0.04～9.05 mg/L范圍均有分布。

表2 浮萍生長(zhǎng)水體的pH值、氨氮、硝氮、總磷的含量

綜上所述，青萍對(duì)pH值、氨氮、硝氮、總磷的耐受能力均強(qiáng)于多根紫萍，對(duì)水體各指標(biāo)廣泛的耐受能力可能是青萍廣泛分布的主要原因。

2.2.2 浮萍生長(zhǎng)水體的水質(zhì)狀況(重金屬) GB 3828—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定Ⅱ類水體中Cr(六價(jià))的濃度≤50 μg/L，Mn的濃度≤4 000 μg/L，Cu的濃度 ≤1 000 μg/L，Zn的濃度≤1 000 μg/L。從Cr、Mn、Cu、Zn這4個(gè)重金屬濃度的指標(biāo)來(lái)看，本次采集的水體樣品均未超地表水Ⅱ類水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(表3)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)Ⅰ類水的規(guī)定，本次采集的59份水樣均滿足Ⅰ類水對(duì)Cd、Pb濃度的要求?？傮w來(lái)看，本次采集的水樣受重金屬污染程度較小。

對(duì)比表3中浮萍生長(zhǎng)水體中的重金屬含量發(fā)現(xiàn)，青萍生長(zhǎng)水體的Mn濃度平均值為458.92 μg/L，Ni濃度平均值為11.92 μg/L，Cu濃度平均值為1.70 μg/L，Zn濃度平均值為30.19 μg/L，分別為多根紫萍的4.8倍、7.4倍、3.6倍、5.8倍，也高于少根紫萍和蕪萍。這些結(jié)果表明，本研究中的青萍與其他浮萍品種相比，對(duì)Mn、Ni、Cu、Zn具有更廣的重金屬耐受范圍。多根紫萍生長(zhǎng)水體的Cr濃度平均值為10.00 μg/L，高于青萍的6.12 μg/L，亦高于少根紫萍和蕪萍。多根紫萍生活水體的Cr濃度范圍為5.37～28.93 μg/L，而青萍的僅為0.20～13.96 μg/L。雖然多根紫萍對(duì)Mn、Ni、Cu、Zn的耐受能力不如青萍，但是多根紫萍對(duì)Cr的耐受能力明顯強(qiáng)于青萍，故在處理Cr含量較高的污染水體時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮選用多根紫萍。因水樣的Cd、Pb濃度均很低，故較難判斷4個(gè)種屬對(duì)Cd、Pb耐受能力的高低。

表3 浮萍生長(zhǎng)水體的重金屬濃度

浮萍對(duì)重金屬的耐受能力因種屬不同而存在差異。因此，廣泛收集各地浮萍樣本并篩選優(yōu)質(zhì)的浮萍品種，對(duì)有針對(duì)性地處理不同重金屬污染的水體至關(guān)重要[21-22]。而自然界中的浮萍分布是否與水體重金屬濃度有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究。

2.4 浮萍分布與環(huán)境因子相關(guān)性分析

本次采集的63株浮萍中，少根紫萍和蕪萍僅有3株，分析其與環(huán)境因子的相關(guān)性不具代表性，故只對(duì)青萍和多根紫萍進(jìn)行浮萍分布與環(huán)境因子的相關(guān)性分析。

2.4.1 利用Spearman分析環(huán)境因子自相關(guān)性 在進(jìn)行浮萍與環(huán)境因子的相關(guān)性分析之前，首先對(duì)環(huán)境因子的自相關(guān)性進(jìn)行分析。Spearman相關(guān)性分析能夠評(píng)估環(huán)境因子兩兩之間的相關(guān)性，S-W檢驗(yàn)結(jié)果顯示，峰度系數(shù)和偏度系數(shù)均不為0，表明環(huán)境因子數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析更為合理，分析結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，Cd、Ni、Pb、Zn、Cu 5個(gè)環(huán)境因子彼此之間顯著相關(guān)(P<0.01)。為減少數(shù)據(jù)分析的重復(fù)性，從Cd、Ni、Pb、Zn、Cu中選擇任意一種做后續(xù)分析即可，pH值、硝氮、氨氮、總磷、Cr、Mn皆可作為自由的環(huán)境因子。

2.4.2 利用RDA分析浮萍分布與環(huán)境因子的相關(guān)性 選擇Cu作為Cd、Ni、Pb、Zn、Cu 5種環(huán)境因子的代表，pH值、硝氮、氨氮、總磷、Cr、Mn作為自由的環(huán)境因子，分析這7種環(huán)境因子與青萍、紫萍2個(gè)浮萍品種的相關(guān)性，RDA結(jié)果如圖3所示。

RDA相關(guān)性分析結(jié)果顯示，環(huán)境因子對(duì)青萍和多根紫萍分布的影響從高到低依次為氨氮、pH值、Cr、總磷、硝氮、Mn、Cu。RDA的總解釋量為27.57%，第一坐標(biāo)軸、第二坐標(biāo)軸軸線分別解釋了26.45%、1.12%的浮萍分布與環(huán)境因子的相關(guān)性。經(jīng)過(guò)對(duì)所有約束特征值999次1%的置換迭代計(jì)算(表4)，得出浮萍分布與環(huán)境因子的相關(guān)顯著性P值，結(jié)果表明，pH值、氨氮的P值均小于0.05，表明這2個(gè)環(huán)境因子與青萍和多根紫萍的分布具有顯著相關(guān)性，其中氨氮對(duì)浮萍的分布具有極顯著影響(P<0.01)。

表4 浮萍分布與環(huán)境因子相關(guān)顯著性檢驗(yàn)

注：“**”表示極顯著相關(guān)(P<0.001)；“*”表示顯著相關(guān)(P<0.01)。

RDA分析結(jié)果顯示氨氮對(duì)浮萍分布的影響最大，表明浮萍生長(zhǎng)對(duì)氨氮濃度很敏感。一方面，氨氮能夠提供浮萍生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)元素N，另一方面，氨氮濃度過(guò)高會(huì)抑制浮萍的生長(zhǎng)。Ingermarsson等的研究結(jié)果也表明，浮萍的細(xì)胞膜能夠?qū)H4+做出響應(yīng)[23]，具體機(jī)制目前還尚未清楚。Warren研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水體中氨氮濃度過(guò)高時(shí)，電離出的NH3會(huì)擾亂浮萍代謝[24]。本次調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，江蘇水樣氨氮的平均值為0.810 mg/L，遠(yuǎn)低于廣東地區(qū)的平均值2.710 mg/L。廣東地區(qū)水體的氨氮濃度過(guò)高，因此耐受能力較差的多根紫萍、少根紫萍、蕪萍難以存活，只有青萍可以適應(yīng)生長(zhǎng)。這或許是江蘇地區(qū)浮萍多樣性更豐富的原因之一。RDA的分析結(jié)果還表明，pH值對(duì)浮萍分布具有顯著影響。許多研究也表明，pH值對(duì)浮萍的生長(zhǎng)、發(fā)育以及重金屬的修復(fù)等方面具有顯著影響[25]。本次調(diào)查，廣東地區(qū)和江蘇地區(qū)水體pH值平均值分別為7.801和7.753，pH值范圍分別為7.160～9.500和 6.700～9.220。江蘇地區(qū)水體pH值稍低于廣東地區(qū)，這或許也是江蘇地區(qū)浮萍覆蓋廣、品種多的另一個(gè)原因。

3 結(jié)論

從江蘇、廣東2地采集的浮萍經(jīng)鑒定為青萍、多根紫萍、少根紫萍和蕪萍。其中青萍占所采集樣品數(shù)的81%，為優(yōu)勢(shì)浮萍品種；水質(zhì)分析表明，采樣地區(qū)的水體存在一定的氮、磷污染，部分水體較為嚴(yán)重。青萍、多根紫萍均適宜在偏堿性的水體中生長(zhǎng)。而青萍能夠適應(yīng)更廣范圍的pH值，對(duì)氨氮、硝氮、總磷的耐受能力也比其他浮萍強(qiáng)，是青萍廣泛分布的原因之一；所采集59份水樣的重金屬濃度均未超地表水Ⅱ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，受重金屬污染程度較小。青萍與其他浮萍品種相比，對(duì)Mn、Ni、Cu、Zn具有更廣的耐受范圍，而多根紫萍對(duì)Cr的耐受能力較好；氨氮、pH值與浮萍分布具有顯著相關(guān)性，是導(dǎo)致2個(gè)地區(qū)浮萍差異分布的主要因素。

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