鄭晨輝 徐小宏 孫秋華 王蓓?

外科術(shù)后腸動力障礙（Postoperative Ileus，POI）被認(rèn)為外科術(shù)后“不可避免的”臨床并發(fā)癥，常表現(xiàn)為腹痛腹脹、肛門停止排氣排便等腸梗阻癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)負(fù)氮平衡、體重下降、腸道黏膜萎縮、腸道菌群失調(diào)和移位等嚴(yán)重并發(fā)癥［1］。本課題組前期研究表明參黃散外敷POI大鼠的脾俞和腎俞，可通過減輕小腸平滑肌的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胃腸道傳輸，同時還可促進(jìn)胃腸道激素Ghrelin的分泌和小腸平滑肌Ghrelin受體的表達(dá)［2］。外科術(shù)后胃腸道激素對腸道功能的恢復(fù)和機體氮平衡發(fā)揮重要作用。本文探討參黃散外敷POI大鼠對血清胃腸道激素的影響，以期為參黃散臨床推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠24只，3個月齡，體質(zhì)量252～302g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，合格證號為SCXK（滬）2013-0016。動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)屏障級動物實驗中心，動物飼養(yǎng)環(huán)境：室溫21～23℃，濕度40%～60%，每12h更替光照，24h供應(yīng)無菌飼料及飲用水。

1.2 試劑和儀器 Motilin（Porcine）RIA Kit（RK-045-03）；Calcitonin Gene Related Peptide（CGRP）Rat RIA Kit（RK-015-09）；Obestatin Rat Ultra sensitive RIA Kit（RKU-031-90）；Vasoactive Intestinal Peptide（VIP）Rat RIA kit（RK-064-16），試劑盒均購于美國Phoenix Pharmaceuticals公司；GPR39抗體（ab213716，abcam公司）；Obestatin抗體（GTX79314，GeneTex公司）；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)（BIO-RAD公司）；高速勻漿機（GLAS-COL德國）。

1.3 藥物 參黃散由人參300g、丹參300g、大黃300g、枳實200g、厚樸200g、丁香100g、吳茱萸100g等藥組成，每包3g生藥。透皮劑由厚樸、 吳茱萸和丁香經(jīng)90%乙醇加熱回流提取所得，采用微量胡椒粉輔助，均由浙江省中醫(yī)院制劑室制作提供。

1.4 方法 （1）動物模型制備和給藥：參照文獻(xiàn)［3］制備改良型SD大鼠POI模型。大鼠術(shù)前24h禁食，異氟烷吸入麻醉，在無菌操作下，取腹部正中切口切開腹腔，將小腸及盲腸向左側(cè)翻出腹腔，置于生理鹽水浸濕的紗布上，用兩棉棒自胃十二指腸向回盲部和部分結(jié)腸探查2次約10min，使少量腸內(nèi)容物過回盲部，致胃腸道壁充血水腫明顯，鹽水紗布覆蓋小腸10min后將小腸按順序還納，關(guān)閉腹腔。取24只SD大鼠分為假手術(shù)組（SHAM）、模型組（IM）和參黃散組（SHP），每組各8只。假手術(shù)組僅行開腹操作；參黃散組造模后取參黃散藥包，滴數(shù)滴透皮劑至藥包，均勻浸透后帖敷于大鼠脾俞和腎俞，模型組造模后使用等量透皮劑滴入細(xì)沙包外敷，各組每隔3h換1次藥包或細(xì)沙包。（2）單位體重增加百分?jǐn)?shù)、標(biāo)準(zhǔn)化攝入量和結(jié)腸傳輸時間測定：大鼠稱體重和攝入量均在術(shù)后24h、48h和72h時間點。動物禁食前所稱體重作為初始體重。單位體重增加百分?jǐn)?shù)=（觀察點體重-初始體重）/初始體重×100%；大鼠標(biāo)準(zhǔn)化攝入量=觀察點累積攝入量/每100g觀察點體重（g/100g b.wt.）。參考文獻(xiàn)［4］測定結(jié)腸傳輸時間，將直徑2mm玻璃球經(jīng)SD大鼠肛門逆行插入3cm深，然后測定玻璃球從肛門排泄時間作為結(jié)腸傳輸時間。（3）放射免疫法測定血漿胃腸激素濃度：術(shù)后第3天，各組SD大鼠安樂處死后即刻從腹腔靜脈采血2ml，注入含100g/L EDTA-Na2 20μl和抑肽酶40μl的離心管，顛倒混勻后4℃3000r/min離心15min，上清液移入EP管中，-20℃保存待測。按放免試劑盒說明書測出樣品中血清胃動素（Motilin，MTL）、血管活性腸肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）、肥胖抑制素（Obestatin）和降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP）含量（pg/ml）。MTL、VIP和 CGRP可測濃度范圍均為10～1280pg/ml；Obestatin 可測濃度范圍為 5～640pg/ml。（4）Western blot檢測和分析：SD大鼠處死后，即刻進(jìn)腹，游離大小網(wǎng)膜，切取3cm×3cm胃體，4℃ PBS液清洗干凈后顯微鏡下剝離出胃平滑肌層，冰浴中剪碎組織，RIPA裂解勻漿并超聲破碎，4℃ 13500r/min，離心20min，取上清液，Bradford法定量測蛋白濃度，制定標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，8%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為65V×2h，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，加Obestatin多克隆抗體（1：1000）和GPR39抗體（1：1000）孵育4℃過夜，含吐溫PBST液洗脫（10min×2次），加AP標(biāo)記的二抗（鼠抗兔 1：1000）孵育1h，PBST洗脫二抗（10min×3次），滴加顯影液（NBT／BCTP），發(fā)光后壓片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參黃散對POI大鼠攝食、體重及結(jié)腸傳輸功能的影響 造模后第3天，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠標(biāo)準(zhǔn)化攝入量、單位體重增加百分?jǐn)?shù)下降和結(jié)腸傳輸功能時間延長差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，參黃散組大鼠標(biāo)準(zhǔn)化攝入量、單位體重百分?jǐn)?shù)增加和結(jié)腸傳輸功能時間下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）見表1。

表1 各組大鼠單位體重增加百分?jǐn)?shù)、標(biāo)準(zhǔn)化攝入量和結(jié)腸傳輸功能比較（x±s）

2.2 參黃散對POI大鼠血清Obestatin、MTL、VIP和CGRP水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清MTL、VIP和CGRP含量降低差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），血漿Obestatin水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，參黃散組大鼠血漿VIP含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MTL和CGRP升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而血漿obestatin水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）見表2。

表2 各組大鼠血清胃腸激素濃度比較（x±s）

2.3 各組大鼠胃體Obestatin和GPR39的表達(dá) Western blot顯示造模術(shù)后第3天胃平滑肌層Obestatin及其受體GPR39表達(dá)在各組均有陽性條帶。與假手術(shù)組比較，模型 組Obestatin和GPR39表達(dá)均增加差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，參黃散組Obestatin和GPR39表達(dá)減少，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）見圖1。

圖1 各組大鼠術(shù)后第3天胃平滑肌Obestatin和GPR39的表達(dá)

3 討論

POI是常見醫(yī)源性腹部甚至非腹部手術(shù)并發(fā)癥。研究表明常規(guī)腹部手術(shù)胃腸道各段的蠕動恢復(fù)時間并不相同，小腸蠕動恢復(fù)平均約24h，胃為24～48h，而結(jié)腸為48～72h。有學(xué)者提出早期POI是正常生理現(xiàn)象，術(shù)后POI＞3d甚至＞6d才考慮病理性腸動力障礙。Ryash Vather等［5］復(fù)習(xí)文獻(xiàn)提出延遲性外科術(shù)后腸道功能障礙（Delayed Postoperative Ileus，DPOI）和復(fù)發(fā)性外科術(shù)后胃腸功能障礙（Recurrence Postoperative Ileus，RPOI）的概念和診斷標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的臨床意義。鑒于此，本實驗選擇術(shù)后3d為觀察時間點，并以結(jié)腸傳輸時間反映胃腸道傳輸功能更為客觀合理。然而，基于傳統(tǒng)POI發(fā)病的核心環(huán)節(jié)是手術(shù)促發(fā)小腸平滑肌層炎癥反應(yīng)，單純作用某一靶點減輕腸道炎癥級聯(lián)反應(yīng)或免疫反應(yīng)，臨床研究表明治療效果并不理想［6］。表明POI時胃腸功能障礙的病理生理極其復(fù)雜，考慮是多因素或系統(tǒng)協(xié)同作用結(jié)果，如術(shù)后胃腸道激素的變化、圍手術(shù)期麻醉藥、鎮(zhèn)痛藥和抗膽堿藥、水電解質(zhì)紊亂和手術(shù)創(chuàng)傷等。在諸多與POI相關(guān)的胃腸激素中，Obestatin是與Ghrelin同一基因編碼的由23個氨基酸組成的酰胺化腦腸肽，是G蛋白偶聯(lián)受體GPR39的內(nèi)源性配體，在大鼠胃和小腸均有表達(dá)，通過Obestatin/GPR39系統(tǒng)發(fā)揮其生物學(xué)活性，具有持續(xù)性抑制胃排空速度和抑制腸道收縮等效應(yīng)，同時抑制攝食和降低體質(zhì)量。注射外源性O(shè)bestatin 后可以明顯抑制大鼠的攝食量和體質(zhì)量的增加，且呈時間和劑量依賴性關(guān)系［7］。CGRP是一種含有37個氨基酸的神經(jīng)肽，由胃腸道的壁內(nèi)神經(jīng)元合成，具有調(diào)節(jié)胃腸血流和運動功能，減輕胃腸道的炎癥反應(yīng)，同時抑制腸道T細(xì)胞的增殖，降低巨噬細(xì)胞的抗原提呈活性及活化淋巴細(xì)胞的功能［8］。VIP是由28個氨基酸組成的直鏈陽離子神經(jīng)肽，可增加胃腸道蠕動和促進(jìn)消化，同時抑制腸道TNF、IL-6 和IL-12 的產(chǎn)生及iNOS 的誘導(dǎo)，刺激抗炎細(xì)胞因子IL-10 的產(chǎn)生［6，8］。MLT屬興奮性胃腸激素，是由22個氨基酸組成的多肽，主要存在于十二指腸及近端空腸黏膜內(nèi)分泌細(xì)胞中，胃動素主要調(diào)控消化間期肌電復(fù)合波（interdigestive myoelectric complex，IMC）周期性活動，明顯促進(jìn)胃運動和胃電活動，且作用持久［9］。

中醫(yī)中藥治療POI具有一定優(yōu)勢，本課題組根據(jù)辨證施治，由7味中藥組成的參黃散外敷POI大鼠可減輕小腸平滑肌炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胃腸道傳輸，同時還可促進(jìn)Ghrelin的分泌和小腸平滑肌Ghrelin特異性受體GHSR-1α的表達(dá)。當(dāng)Ghrelin與其受體GHSR-1α結(jié)合后可激活多個信號通路，對機體能量代謝起正性調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)胃腸道傳輸和胃酸分泌。本研究表明POI時除Ghrelin外還影響其它胃腸道激素的分泌，血清促胃腸動力激素CGRP、MLT和VIP濃度下降，而抑制胃腸道蠕動的血清Obestatin濃度增加，胃體Obestatin和GPR39表達(dá)也明顯增加，結(jié)腸傳輸時間延長。參黃散外敷POI大鼠可促進(jìn)CGRP、MLT、VIP 的分泌并抑制Obestatin的產(chǎn)生及其受體表達(dá)，單位單位體重增加百分?jǐn)?shù)和標(biāo)準(zhǔn)化攝入量均增加，顯示正氮平衡。課題組前期表明參黃散促進(jìn)胃腸蠕動的核心成分是橘皮苷（Hesperidin）、槲皮素（Quercetin）、蘆薈大黃素（Aloeemodin）、厚樸酚（Magnonol）、大黃（Chrysophanol）、人參皂苷 Rgl，Rbl（Ginsenosides Rgl，Rb1）［10］，具體如何調(diào)節(jié)胃腸激素變化有待進(jìn)一步研究?？傊?，參黃散外敷POI大鼠特別是延遲性POI可經(jīng)多靶點發(fā)揮作用，體現(xiàn)中醫(yī)中藥治療本癥的優(yōu)勢。

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［2］ 徐小宏,陳友雷,魏星,等.參黃散對術(shù)后腸動力障礙大鼠胃腸功能、血清Ghrelin水平及其小腸平滑肌受體表達(dá)的影響. 科技通,2015,31(11):105-109.

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