，，，

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori，HP)對(duì)抗生素的耐藥性是導(dǎo)致根除治療失敗的重要原因，藥敏實(shí)驗(yàn)為判定HP是否具有抗藥性的金標(biāo)準(zhǔn)方法。異質(zhì)性耐藥(heteroresistance)，是指同一患者體內(nèi)同時(shí)存在對(duì)某種抗生素敏感和耐藥的菌株。異質(zhì)性耐藥的原因可能是最初的混合感染，也可能是菌株在宿主體內(nèi)的長(zhǎng)期感染過程中基因突變?cè)斓亩喾N突變體[1]，HP感染的相關(guān)特征尤為突出，因?yàn)镠P一旦感染，不經(jīng)規(guī)范根除治療，慢性感染往往會(huì)持續(xù)多年?？死顾厥荋P根除療法的一線藥物，HP克拉霉素耐藥問題已于2017年被世界衛(wèi)生組織列為全球耐藥問題高度優(yōu)先級(jí)[2]。臨床HP藥敏試驗(yàn)通常選取數(shù)個(gè)分離培養(yǎng)單菌落，很難充分反映HP的異質(zhì)性耐藥情況。目前，國(guó)外關(guān)于HP對(duì)甲硝唑[3]，克拉霉素[4]，阿莫西林[5-6]的異質(zhì)性耐藥均有報(bào)道，中國(guó)人群感染的HP具有甲硝唑和克拉霉素高耐藥特征，但對(duì)其異質(zhì)性耐藥的報(bào)道較少。Kao等[7]報(bào)道臺(tái)灣存在左氧氟沙星、克拉霉素和甲硝唑的異質(zhì)性耐藥，Wong等[8]報(bào)道了香港的甲硝唑異質(zhì)性耐藥，但均缺乏對(duì)相關(guān)特征的深入分析。

多位點(diǎn)序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)是對(duì)微生物的管家基因序列進(jìn)行比對(duì)分析的常用分型方法。本研究通過對(duì)6個(gè)克拉霉素異質(zhì)性耐藥樣本來源的81個(gè)HP克隆進(jìn)行MLST分析，以期對(duì)HP的異質(zhì)性耐藥特征進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1分離培養(yǎng)及抗生素耐藥檢測(cè) 選用特制的黏液刷于胃鏡下刷取某醫(yī)院50例13C呼氣試驗(yàn)陽(yáng)性患者的胃竇黏液樣本，進(jìn)行HP分離培養(yǎng) (Karmali培養(yǎng)基：OXOID公司，脫纖維羊血：北京蘭博瑞生物制品有限公司)，分離培養(yǎng)陽(yáng)性者44例，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)陽(yáng)性樣本挑選16個(gè)HP克隆(不足16個(gè)克隆者挑取所有HP克隆)，用Etest法測(cè)定每個(gè)克隆的克拉霉素最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。依照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)，將克拉霉素MIC≥1 mg/L的HP判定為耐藥克隆。最終得到全敏感克隆相關(guān)病例24例，異質(zhì)性耐藥病例11例，全耐藥克隆相關(guān)病例9例。從11例異質(zhì)性耐藥患者中選取6例MIC值差異較大的標(biāo)本(編號(hào)1，2，3，4，5，6)，共81個(gè)HP克隆，進(jìn)行進(jìn)一步的進(jìn)化特征分析。

1.2 基于MLST的進(jìn)化特征分析

1.2.1核酸提取 每個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN公司，德國(guó))進(jìn)行基因組的提取。

1.2.2PCR擴(kuò)增測(cè)序 選取MLST官網(wǎng)推薦的8個(gè)管家基因(atpA,efp,mutY,ppa,trpC,ureI,vacA,yphC)，引物序列參考http://pubmlst.org/helicobacter，見表1，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并測(cè)序。引物合成由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物的純化及測(cè)序由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行。

表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物
Tab.1 Primers used in PCR amplification and sequencing

基因引物序列(5′?3′)長(zhǎng)度/bpatpAatpA＿FGGACTAGCGTTAAACGCACG626?627atpA＿RCTTGAAACCGACAAGCCCACefpefp＿FGGCAATTTGGAT?GAGCGAGCTC410efp＿RCTTCACCTTTTCAAGATACTCmutYmutY＿FGTGGTTGTAGYTGGAAACTT?TACAC419?420mutY＿RCTTAAGCGTGTGTYTTTCTAGGppappa＿FGGAGATTGCAATGAATTTAGA398ppa＿RGTGGGGTTAARATCGTTAAAT?TGtrpCtrpC＿FTAGAATGCAAAAAAG?CATCGCCCTC456trpC＿RTAAGCCCGCACACTT?TATTTTCGCCureIureI＿FAGGTTATTCGTAAGGTGCG585ureI＿RGTTTAAATCCCTTAGATTGCCvacAvacA＿FACAACCGTGATCATTCCAGC364?445vacA＿RATACGCTCCCACGTATTGCyphCyphC＿FCACGCCTATTTTTTTGACTA?AAAAC504?531yphC＿RCATTYACCCTCCCAATGATGC

1.2.3MLST分析 將81個(gè)HP克隆的8個(gè)管家基因進(jìn)行序列分析，用MEGA 7.0軟件中的clusterW程序?qū)λ行蛄羞M(jìn)行多序列比對(duì)，并與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有等位基因進(jìn)行比對(duì)，將新的等位基因序列提交，以獲得已有或新發(fā)現(xiàn)的等位基因序列號(hào)；提交新的等位基因譜(7個(gè)管家基因：atpA,efp,mutY,ppa,trpC,ureI,yphC)，以獲得已有或新發(fā)現(xiàn)的ST型別。

1.2.4菌株進(jìn)化關(guān)系分析 將每個(gè)克隆的8個(gè)管家基因的核心序列串聯(lián)成1個(gè)3 850 bp的序列，用MEGA 7.0軟件中的clusterW程序?qū)Υ?lián)序列進(jìn)行比對(duì)和分析，采用Bootstrap的1 000次重復(fù)，進(jìn)化距離用最大似然法(Maximum Composite Likelihood method)計(jì)算，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)生樹[9-12]。

2 結(jié) 果

2.1異質(zhì)性耐藥情況 44個(gè)分離培養(yǎng)成功的樣本中，有20(46.51%)個(gè)克拉霉素耐藥，耐藥樣本中有11(55.00%)例為異質(zhì)性耐藥，異質(zhì)性耐藥占全部分離培養(yǎng)陽(yáng)性樣本的25.58%。對(duì)6個(gè)異質(zhì)性耐藥樣本分離所得的81個(gè)克隆對(duì)克拉霉素的MIC值，見圖1。6個(gè)樣本中耐藥克隆所占比例為21.43%～90.91%(平均值62.00%，中位數(shù)75.00%)。6個(gè)樣本內(nèi)部MIC值差異很大。

圖1 6個(gè)異質(zhì)性耐藥樣本中的81個(gè)HP克隆對(duì)克拉霉素的MIC值Fig.1 Clarithromycin MIC values of all 81 isolates in 6 heteroresistant samples

2.2MLST分析結(jié)果 對(duì)81個(gè)HP克隆的8個(gè)管家基因的核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，得到的序列剪切后上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得17個(gè)ST型別，均為新發(fā)現(xiàn)的ST型。每個(gè)病例的9～16個(gè)分離株被分為1～6種不同的ST型，各分離株間vacA基因的差異又將其分為不同的基因型，見表2。

表2 81個(gè)HP克隆的ST型別，vacA基因型及對(duì)應(yīng)克隆耐藥情況
Tab.2 ST type, vacA genotype and clarithromycin susceptibility of all 81 isolates

樣本ST型別vacA基因型分離株132067271?2，1?4，1?5，1?6，1?7，1?8，1?9，1?10，1?11，1?12，1?13，1?14，1?15，1?1632066611?1，1?3232077342?1，2?2，2?4，2?7，2?10，2?14，2?15，2?1632087342?3332097433?1，3?3，3?4，3?6，3?7，3?9，3?12，3?14，3?1632107433?232117433?5，3?8，3?11，3?13，3?15432127584?2，4?3，4?4，4?6，4?7，4?8，4?9，4?10，4?13，4?1432127594?11532137695?1，5?3，5?7，5?1032137735?4，5?13，5?15，5?1632137745?1432147695?2，5?932157695?5，5?632647695?832167695?1132177695?12632187856?2，6?832197856?3，6?4，6?5，6?10，6?1532207856?6，6?7，6?9，6?11，6?13，6?1632217856?14

注：克隆編號(hào)以下劃線表示耐藥克隆

對(duì)81個(gè)HP克隆構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖2。1號(hào)樣本的2個(gè)敏感克隆和14個(gè)耐藥克隆同屬ST3206型，但耐藥克隆相比敏感克隆，vacA基因有2個(gè)堿基缺失，遺傳距離為17.97%；2號(hào)樣本的2個(gè)ST型別間有5個(gè)堿基差異，均位于yphC基因，遺傳距離為0.13%；3號(hào)樣本的3個(gè)ST型別間僅有1個(gè)堿基差異，遺傳距離為0.03%～0.05%；4號(hào)樣本的所有克隆同屬1個(gè)ST型，但vacA基因有1個(gè)堿基差異，遺傳距離為0.03%；5號(hào)樣本的6個(gè)ST型各克隆間共有149個(gè)堿基差異，分布在7個(gè)等位基因(atpA,efp,mutY,ppa,ureI,yphC,vacA)中，兩兩組間遺傳距離為0.03%～3.84%，eBURST分析將其分為2組，3213，3216，3264為1組，3215，2314，3217為1組；6號(hào)樣本的4個(gè)ST型，atpA，mutY，ureI等位基因間分別相差10，13，7個(gè)堿基，組間遺傳距離為0.18%～0.78%?？梢妬碓从?號(hào)標(biāo)本的克隆明顯來源于至少2個(gè)型克隆，其他5例病人體內(nèi)的HP在進(jìn)化樹中分別獨(dú)立聚為單一克隆群，6份標(biāo)本中的克隆在聚類中沒有發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中的交叉。

注：標(biāo)尺單位為每個(gè)位點(diǎn)的堿基替換率圖2 全部81個(gè)HP克隆的MLST系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Evolutionary relationships of 81 isolates

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)HP克拉霉素異質(zhì)性耐藥占全部分離培養(yǎng)陽(yáng)性樣本的25.58%，占耐藥樣本的55.00%，這種高異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象應(yīng)引起高度重視；其中耐藥性克隆比例較低的異質(zhì)性耐藥樣本，常規(guī)耐藥性檢測(cè)有較高的檢測(cè)假陰性可能。

應(yīng)用MLST方法對(duì)菌株進(jìn)行遺傳相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)6例異質(zhì)性耐藥患者的樣本分離所得克隆，在5例中分別聚成單獨(dú)的克隆群。推測(cè)在患者感染HP過程中引起異質(zhì)性耐藥的原因分為兩類：一類是由于胃內(nèi)的HP在長(zhǎng)期感染的過程中一次或多次接觸抗生素壓力[13]，因此盡管MIC值差異很大，克隆間遺傳距離很近；另一類可能與不同HP菌株的混合感染相關(guān)[14]。

異質(zhì)性耐藥是對(duì)現(xiàn)有耐藥檢測(cè)方法的一大挑戰(zhàn)，本研究提示來自中國(guó)人群的HP感染菌株存在明顯的克拉霉素異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)中對(duì)少數(shù)培養(yǎng)菌落的檢測(cè)方式在某些病例可能不足以反映克拉霉素耐藥的真實(shí)情況；如何改進(jìn)HP克拉霉素耐藥檢測(cè)評(píng)價(jià)方法并指導(dǎo)臨床HP感染的精準(zhǔn)治療，應(yīng)引起高度重視。

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