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布魯菌病(以下簡(jiǎn)稱布病)是由布魯菌(Brucella)侵入機(jī)體引起的傳染——變態(tài)反應(yīng)性人獸共患傳染病，在我國(guó)屬于國(guó)家法定管理的乙類傳染病，嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。布魯菌是一類兼性胞內(nèi)寄生、革蘭染色陰性的短小桿菌[1]，以牛、羊、豬、犬等家畜和野生動(dòng)物為主要儲(chǔ)存宿主，也存在于海洋動(dòng)物中，可經(jīng)呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)黏膜以及皮膚等多種途徑引起感染。人感染布魯菌可累及全身多個(gè)組織器官，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)肌肉疼痛等[2-3]，急性期可以治愈，但不易被確診，常遷延為慢性感染，慢性期布病患者可有肝、脾及睪丸腫大，關(guān)節(jié)和脊柱強(qiáng)直，肌腱攣縮變硬等，很難治愈，如引起腦炎和心肌炎者可致命，嚴(yán)重影響人類健康[4]。動(dòng)物感染后主要引起流產(chǎn)，造成畜牧業(yè)減產(chǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致極大的經(jīng)濟(jì)損失。布魯菌易借助氣溶膠的方式傳播，呈高度傳染性(僅吸入10-100個(gè)細(xì)菌即可導(dǎo)致人類患病[5])，因此布魯菌被認(rèn)為是一種潛在的生物戰(zhàn)劑，已被列入《國(guó)際禁止生物武器公約》的核查清單，也是美國(guó)反生物恐怖襲擊中的生物劑之一[1，6]。

近年來(lái)全球布病發(fā)病率上升，被WHO稱為“再度肆虐”的傳染病。我國(guó)自20世紀(jì)90年代中期以來(lái)，布病再度流行，疫情逐年上升，防控形勢(shì)嚴(yán)峻。2000年以后，北京市布病疫情與全國(guó)一樣，報(bào)告病例數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，疫區(qū)人群感染率不斷升高，并向普通人群擴(kuò)散。此外，畜間疫情頻發(fā)，并有局部暴發(fā)[7]，防控形勢(shì)非常嚴(yán)峻。了解布病病原特點(diǎn)和遺傳特征是布病防控的基礎(chǔ)，本項(xiàng)研究采用基于布魯菌屬外膜蛋白31基因的PCR(BCSP31-PCR)和基于插入序列IS711的牛、羊、綿羊附睪和豬種布魯菌特異的PCR(AMOS-PCR)技術(shù)對(duì)2013年和2014年北京地區(qū)分離自布病患者血液的2株布魯菌進(jìn)行屬和種(型)鑒定，采用多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence typing，MLST)技術(shù)對(duì)2株布魯菌菌株的19個(gè)管家基因、1個(gè)外膜蛋白基因及1個(gè)基因間區(qū)的序列進(jìn)行測(cè)定，將各個(gè)等位基因的序列與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的等位基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定菌株的等位基因譜及9位點(diǎn)序列型(sequence type，ST)和21位點(diǎn)序列型，分析其與布魯菌不同ST型的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為北京地區(qū)布病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 菌株培養(yǎng)基采用哥倫比亞血平板，購(gòu)于英國(guó)OXOID公司，貨號(hào)PB0123A。PCR試劑Platinum PCR SuperMix，購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)11306-016。核酸自動(dòng)電泳用卡夾(QIAxcel DNA Screening Kit)與QX Alignment Marker 15bp/3Kb購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，貨號(hào)分別為929004和929522。DL2,000bp DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)為D501A。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)菌株 實(shí)驗(yàn)菌株BJ3與BJ91為分離自北京地區(qū)2013年和2014年布病患者血液的分離株。

1.3菌株DNA制備 將分離菌株接種于哥倫比亞血平板，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h后，刮取1～2接種環(huán)菌苔到150 μL去離子水中，振蕩混勻制成菌懸液。再放入數(shù)控干浴器中，于100 ℃下煮沸10 min；12 000 r/min離心10 min，最后取上清液于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4BCSP31-PCR法鑒定布魯菌屬 采用布魯菌屬特異性基因BCSP31作為定屬基因，按照參考文獻(xiàn)[8-9]提供的B4和B5引物序列和參數(shù)進(jìn)行布魯菌屬的鑒定。

1.5AMOS-PCR法鑒定布魯菌種/型 采用參考文獻(xiàn)[10-11]提供的以布魯菌屬IS711插入序列為基礎(chǔ)建立的AMOS-PCR引物及參數(shù)進(jìn)行布魯菌種/型的鑒定。

1.6MLST分型 采用參考文獻(xiàn)[12-13]提供的布魯菌19個(gè)管家基因(gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、int-hyp、omp25、prpE、caiA、csdB、soxA、leuA、mviM、fumC、fbaA、ddlA、putA、mutL和acnA)、1個(gè)外膜蛋白基因(omp25)和1個(gè)基因間區(qū)int-hyp作為MLST的靶標(biāo)基因，選取的靶標(biāo)基因、引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。ddlA基因擴(kuò)增的退火溫度為55 ℃，其他條件不變。PCR產(chǎn)物采用核酸自動(dòng)電泳儀電泳檢測(cè)，以DL 2 000 bp DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。觀察電泳結(jié)果判斷PCR擴(kuò)增是否成功。若PCR成功，直接將電泳檢測(cè)后的樣品委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化及測(cè)序。運(yùn)用MLST在線工具(網(wǎng)址https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_brucella_seqdef&page=sequenceQuery)，分別將每株菌的21個(gè)特殊位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果與布魯菌MLST標(biāo)準(zhǔn)菌株等位基因序列進(jìn)行比對(duì)，明確序列是否與某個(gè)等位基因型的序列一致，如果一致，則定義為某個(gè)等位基因型，否則定義為一個(gè)新的等位基因型，從而獲得每株菌的等位基因譜(gap/aroA/glk/dnaK/gyrB/trpE/cobQ/int-hyp/omp25/prpE/caiA/csdB/soxA/leuA/mviM/fumC/fbaA/ddlA/putA/mutL/acnA)。將得到的等位基因譜與布魯菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)菌株的等位基因譜進(jìn)行比對(duì)，從而確定每株菌的ST型。

表1 用于擴(kuò)增和測(cè)序分析的21對(duì)引物序列
Tab.1 21 Primer sets for amplificstion and sequencing

位點(diǎn)推定功能引物序列5′?3′長(zhǎng)度/bp位置gap3?磷酸甘油醛脫氫酶glyceraldehyde3?phosphatedehydrogenaseYGCCAAGCGCGTCATCGTGCGGYTGGAGAAGCCCCA589AE0172231685083?1685671aroA3?磷基酰亞胺1?羧乙烯轉(zhuǎn)移酶3?phosphoshikimate1?carboxyvinyltransferaseGACCATCGACGTGCCGGGYCATCAKGCCCATGAATTC565AE01722329974?30538glk葡萄糖激酶glucokinaseTATGGAAMAGATCGGCGGGGGCCTTGTCCTCGAAGG475#AE017224988660?989134dnaK伴侶蛋白質(zhì)chaperoneproteinCGTCTGGTCGAATATCTGGGCGTTTCAATGCCGAGCGA470AE0172232066742?2067211gyrBDNA回旋酶B亞基DNAgyraseBsubunitATGATTTCATCCGATCAGGTCTGTGCCGTTGCATTGTC469AE017223142378?141910trpE蒽酸合成酶anthranilatesynthaseGCGCGCMTGGTATGGCGCKCSCCGCCATAGGCTTC486AE0172231538194?1537709omp2525kD外膜蛋白25kDaouter?membraneproteinATGCGCACTCTTAAGTCTCGCCSAGGATGTTGTCCG490#AE017223710041?710530cobQ鈷啉胺酸合成酶cobyricacidsynthaseGCGGGTTTCAAATGCTTGGAGGCGTCAATCATGCCAGC422#AE0172231289341?1288920int?hyp假定蛋白的上游5′端upstreamandextreme5′ofhypotheticalproteinCAACTACTCTGTTGACCCGAGCAGCATCATAGCGACGGA430#AE0172231372708?1372279prpE丙酸?輔酶A連接酶propionate?CoAligaseGGTGCTGTTCACGCTGGAAAGGTTTTCGCAGGCGGCGAA468AE0172231687838?1688305caiA脂肪酰?輔酶A脫氫酶acyl?CoAdehydrogenaseTGTGTTCGGCAAGCCTTTGGGTCAAAAGACGTGCCACA449AE017224633492?633940csdB半胱氨酸脫巰基酶cysteinedesulfhydraseCGTCACTTCCTGGATCATTTCGCCACCGACGCTTATGAGAA487AE017223930109?929623soxA肌氨酸氧化酶α亞基sarcosineoxidasealphasubunitCCTCGTAAAGCGCCTTCCTGTTCGATGCCTCCACATTGG486AE017223245488?245003leuA2?異丙基蘋果酸合酶2?isopropylmalatesynthaseTCAACCGGATGAAGGAAGTCCCCTCGATAGTCTTGGTGACA482AE0172231534688?1534207表1(續(xù))位點(diǎn)推定功能引物序列5′?3′長(zhǎng)度/bp位置mviM葡萄糖?果糖氧化還原酶前體glucose?fructoseoxidoreductaseprecursorATCGCCCGTTCGGTGACTGTTCGCCGTCCTTGTCC447#AE0172231990600?1990154fumC延胡索酸水合酶CfumaratehydrataseCCGACCATGTCAATATGAGCCGATATCGTTGGCGATCTTGAA452AE017224180504?180055fbaA果糖?二磷酸醛縮酶fructose?bisphosphatealdolaseCGTGAAATAACCTGATCTCACCATGCCGGTTTCAAGCGAAC458AE017224360206?360663ddlAD?丙氨酸?D?丙氨酸連接酶AD?alanine?D?alanineligaseATTTCAGTGCGCTCGAACAGGTTCTTCAATGATGAGATTAAA553AE0172231251848?1251296putA脯氨酸脫氫酶prolinedehydrogenaseGTGGGCGTGCAGCCTTTCGCCTGTGTGAGTACGAGCGG527AE017224512957?513483mutLDNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白DNAmismatchrepairproteinACATCCAAGCTGACCGACTCCCGTGCGATCACATCCGA549AE017224208009?207461acnA烏頭酸水合酶aconitatehydrataseGAAGGCCGCATCCCACTGGCGGCGAGGCAAGGTAAT490AE01722399997?99508

注：# 不同等位基因型有不同的片段長(zhǎng)度

1.7聚類分析 應(yīng)用eBURST軟件將2株布魯菌的ST型與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有ST型進(jìn)行聚類分析，探討這兩個(gè)ST型與已知ST型的進(jìn)化關(guān)系。應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)各ST型的核酸序列進(jìn)行聚類分析，探討各菌株間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1BCSP31-PCR鑒定 BCSP31-PCR方法對(duì)分離株和對(duì)照菌株核酸進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物采用核酸自動(dòng)電泳儀電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩株分離菌株及陽(yáng)性對(duì)照菌株核酸均擴(kuò)增出布魯菌屬特異的223 bp的條帶，而陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)。

2.2AMOS-PCR檢測(cè)結(jié)果 AMOS-PCR方法對(duì)分離株和對(duì)照菌株核酸進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物采用核酸自動(dòng)電泳儀電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性羊種對(duì)照菌株核酸可擴(kuò)增出178 bp的條帶和羊種布魯菌特異的731 bp的條帶，2株分離菌株只有178 bp條帶，此外無(wú)其他條帶，而陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)。

2.3MLST分型結(jié)果 2株菌的19個(gè)管家基因、1個(gè)外膜蛋白基因(omp25)和1個(gè)基因間區(qū)int-hyp的擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果與與布魯菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)等位基因信息比對(duì)，得到這2株分離株的21個(gè)位點(diǎn)(gap/aroA/glk/dnaK/gyrB/trpE/cobQ/int-hyp/omp25/prpE/caiA/csdB/soxA/leuA/mviM/fumC/fbaA/ddlA/putA/mutL/acnA)的等位基因序列號(hào)分別為2、1、2、2、1、3、1、4、1、13、2、2、2、2、1、1、3、7、6、2、3和2、1、2、2、1、3、1、4、29、13、2、2、2、2、1、1、3、7、6、2、3(表2，表3)。比對(duì)結(jié)果顯示，這2株布魯菌的9位點(diǎn)等位基因編號(hào)和21位點(diǎn)基因編號(hào)均為新組合，即新ST。

我們將這2株布魯菌的資料及其各等位基因序列編號(hào)通過互聯(lián)網(wǎng)錄入布魯菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，已被接收并確認(rèn)為新ST，命名為ST74和ST75(9位點(diǎn)ST)與ST108和ST109(21位點(diǎn)ST)。

表2 2株分離株的等位基因譜(9位點(diǎn)ST)
Tab.2 Allele profile of 2 isolates (9 loci ST)

分離株STgaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQInt?hypomp25BJ3ST74212213141BJ91ST752122131429

表3 2株分離株的等位基因譜(21位點(diǎn)ST的其他12位點(diǎn))
Tab.3 Allele profile of 2 isolates (addtional 12 loci of 21 loci ST)

分離株STprpEcaiAcsdBsoxAleuAmviMfumCfbaAddlAputAmutLacnABJ3ST1081322221137623BJ91ST1091322221137623

2.4聚類分析結(jié)果 聚類分析顯示，迄今已發(fā)現(xiàn)的73個(gè)9位點(diǎn)MLST分型的ST型所包含的布魯菌10個(gè)種呈現(xiàn)出相同種ST型菌株聚集較緊密，不同種之間遺傳距離及親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的現(xiàn)象，這2株菌的9位點(diǎn)ST與其它幾個(gè)均屬于牛種布魯菌的ST型聚在一起，與ST2高度同源，遺傳關(guān)系較近，ST74與ST2只有1個(gè)等位基因int-hyp的差異，ST75與ST2有2個(gè)等位基因int-hyp、omp25的差異，提示ST74、ST75與ST2的親緣關(guān)系較近，ST2可暫定為1個(gè)可行度較高的始祖ST型(圖1)。運(yùn)用MegAlign軟件(By ClustalW Method)對(duì)各ST型9個(gè)位點(diǎn)的核酸序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示ST74、ST75型與屬于牛種布魯菌的其他18個(gè)ST型聚在一起(圖2)，對(duì)各ST型21個(gè)位點(diǎn)的核酸序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示ST108、ST109型與屬于牛種布魯菌的其他30個(gè)ST型聚在一起(圖3)，提示這2株菌為牛種布魯菌，與AMOS-PCR結(jié)果吻合。

圖1 2種新ST型與已知布魯菌ST型的eBURST分析結(jié)果Fig.1 eBURST analysis of 2 novel STs and the known STs

圖2 2種新ST型與已知布魯菌ST型間的進(jìn)化關(guān)系(9位點(diǎn)ST)Fig.2 Phylogenetic tree of 2 novel STs and the known STs (9 loci ST)

圖3 2種新ST型與已知布魯菌ST型間的進(jìn)化關(guān)系(21位點(diǎn)ST)Fig.3 Phylogenetic tree of 2 novel STs and the known STs (21 loci ST)

3 討 論

1985年WHO根據(jù)在細(xì)菌培養(yǎng)過程中的生化以及噬菌體裂解和血清凝集特性，將布魯菌分為羊種布魯菌、牛種布魯菌、豬種布魯菌、綿羊附睪種布魯菌、沙林鼠種布魯菌和犬種布魯菌共6個(gè)種19個(gè)生物型，此為布魯菌的經(jīng)典分型。之后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了4種新型布魯菌。目前認(rèn)為，布魯菌有10個(gè)種，它們分別為馬耳他布魯菌(羊種布魯菌B.melitensis，3個(gè)生物型)、流產(chǎn)布魯菌(牛種布魯菌B.abortus，8個(gè)生物型)、豬種布魯菌(B.suis，5個(gè)生物型)、綿羊附睪種布魯菌(B.ovis，1個(gè)生物型)、沙林鼠種布魯菌(B.eotomae，1個(gè)生物型)、犬種布魯菌(B.canis，1個(gè)生物型)，從海洋哺乳動(dòng)物如海豹、鯨、海豚等中分離出的鯨型布魯菌(B.ceti)[14]和鰭型布魯菌(B.pinnipedialis)[15]，從野鼠中分離出的田鼠型布魯菌(B.microti)[16]，在人乳房植入體中發(fā)現(xiàn)的湖浪布魯菌(B.inopinata)[17]。其中4個(gè)種(羊種B.melitensis，牛種B.abortus，豬種B.suis和犬種B.canis)對(duì)人致病，致病作用大小順序一般是羊種大于牛種、豬種，大于犬種。布魯菌因其生物種、型和菌株的不同，致病力各異，對(duì)人致病力最強(qiáng)的為羊種菌，其次為豬種菌，牛種菌對(duì)人致病力弱，但亦時(shí)有病例發(fā)生。因此，了解布病病原學(xué)特征對(duì)布病的有效預(yù)防和控制至關(guān)重要。本研究將來(lái)源于患者的2株菌株采用屬特異性BCSP31-PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示這兩株分離的可疑菌株均為布魯菌。AMOS-PCR結(jié)果只有178 bp條帶而無(wú)其他大小的目的條帶出現(xiàn)，提示分離菌株為為非羊種、非牛種1、2、4型、非豬種1型、非綿羊附睪種布魯菌。

傳統(tǒng)血清學(xué)方法鑒定只能將布魯菌鑒定到種(型)，無(wú)法對(duì)菌株進(jìn)行溯源分析。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些分子分型方法不斷出現(xiàn)，如PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFIP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAP-PCR)、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multi-locus variable-Humber tandem repeat analysis，MLVA-16)技術(shù)和多位點(diǎn)序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)技術(shù)等，但是PCR-RFIP、RAP-PCR和AFLP分辨率較低，在分子流行病學(xué)中應(yīng)用價(jià)值十分有限。由于布魯菌屬種間DNA同源性高達(dá)90%，需要高分辨力的分型方法用來(lái)提供疾病傳播模式和分子流行病學(xué)信息。PFGE、MLVA和MLST在布病病的病原鑒定、傳染源追蹤與病原體的溯源等方面發(fā)揮了重要作用。但PFGE實(shí)驗(yàn)過程中活菌操作繁多，實(shí)驗(yàn)室感染風(fēng)險(xiǎn)較大。相比MLVA-16，MLST在反映菌株遺傳特征方面更加敏感[18]，分辨率高，重復(fù)性好，數(shù)據(jù)可實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共享，不同的實(shí)驗(yàn)室之間具有良好的可比性[19]。2007年Whatmore等[12]根據(jù)7個(gè)管家基因、1個(gè)外膜蛋白基因及1個(gè)基因間區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)160株布魯菌進(jìn)行MLST分析，試驗(yàn)將160株布氏菌分為27個(gè)序列型。為了提高分辨率，Whatmore[13]等又新增了12個(gè)靶標(biāo)基因，加上之前的9個(gè)特殊位點(diǎn)，形成了BruMLSA21分型方案。對(duì)收集自全球的500多株布魯菌進(jìn)行MLST分析，結(jié)果分了101個(gè)序列型。此后不斷有新的ST型被發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)庫(kù)不斷豐富，目前9位點(diǎn)序列型有73個(gè)ST型，21位點(diǎn)序列型有107個(gè)ST型。因此，本研究中我們采用布魯菌MLST分子分型方法對(duì)2013年和2014年分離自北京地區(qū)布病患者的2株菌株進(jìn)行分子分型分析并與已發(fā)現(xiàn)的ST型進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株菌株的等位基因譜與目前已有的ST型的等位基因譜不完全一致，為新的ST型。

MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/brucella/)是國(guó)際上公認(rèn)的登載布魯菌序列分型信息的重要數(shù)據(jù)庫(kù)，注冊(cè)登錄后將發(fā)現(xiàn)的2種新ST型菌株的等位基因譜信息提交，被接受并予以命名，現(xiàn)該庫(kù)關(guān)于Brucella的9位點(diǎn)ST更新為75種，21位點(diǎn)ST更新為109種。本研究中2株菌的ST分別被命名為ST74、ST75(9位點(diǎn)MLST)和ST108、ST109(21位點(diǎn)MLST)。ST74與ST2只有1個(gè)等位基因int-hyp的差異，ST75與ST2有2個(gè)等位基因int-hyp、omp25的差異，見表2。為了進(jìn)一步分析新發(fā)現(xiàn)的ST型，利用eBURST工具分析目前布魯菌數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的73個(gè)ST型和新發(fā)現(xiàn)的ST型，并繪制出各ST型之間的關(guān)系圖。eBURST(Based Upon Related Sequence Type)是一種基于相關(guān)序列型的聚類分析方法。根據(jù)細(xì)菌的所有序列型的等位基因譜將細(xì)菌分為不同的組(group)，計(jì)算每個(gè)序列型的單位點(diǎn)變異型SLV(Single Locus Variants)個(gè)數(shù)、雙位點(diǎn)變異型DLV(Double Locus Variants)個(gè)數(shù)，鑒定可能的祖先序列型等。當(dāng)2個(gè)ST型之間只有1個(gè)等位基因數(shù)字不同時(shí)，這2個(gè)ST型互為單位點(diǎn)變異型SLV；如果有2個(gè)等位基因數(shù)字不同，這2個(gè)ST型則互為雙位點(diǎn)變異型DLV[20]?；閱挝稽c(diǎn)變異型的序列型構(gòu)成一組，若該組有足夠多的ST型且其中的1個(gè)ST擁有最多數(shù)量的SLV，該ST型則可以暫定為1個(gè)可行度較高的始祖ST型。eBURST分析顯示(圖1)：迄今已發(fā)現(xiàn)的73個(gè)ST型所包含的布魯菌10個(gè)種呈現(xiàn)出相同種菌株的ST型聚集較緊密，而不同種之間遺傳距離及親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的現(xiàn)象；以ST2、ST8、ST15、ST17、ST59各自為中心聚集在一起的ST型的親緣關(guān)系較近，這樣的菌株稱為克隆群(或稱克隆復(fù)合體clonal complexes)，分別為牛種、羊種、豬種、豬種和鯨型。ST74、ST75，ST108、ST109與其它幾個(gè)均屬于牛種布魯菌的ST型聚在一起，與ST2高度同源，遺傳關(guān)系較近，從遺傳學(xué)水平證實(shí)了這2株布魯菌為兩種新ST型牛種布魯菌。ST2可暫定為1個(gè)可行度較高的始祖ST型。運(yùn)用MegAlign軟件(By Clustal W Method)對(duì)各ST型9個(gè)位點(diǎn)的核酸序列進(jìn)行聚類分析，探討不同ST型間的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果顯示(圖2)：羊種布魯菌幾乎所有的ST型(除ST70以外)均處于同一個(gè)進(jìn)化分支上，表現(xiàn)的高度集中，說(shuō)明羊種布魯菌是一種高度保守的布魯菌，不同ST型間變異少，而國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)最多羊種ST型為ST8[21-22]。新發(fā)現(xiàn)的ST74、ST75型與ST2型遺傳關(guān)系很近，處于同一個(gè)進(jìn)化層次。ST74、75型與屬于牛種布魯菌的其他18個(gè)ST型聚在一起，21位點(diǎn)ST型的進(jìn)化樹分析顯示ST108、109型與屬于牛種布魯菌的其他30個(gè)ST型聚在一起(圖3)，提示這2株分離株為牛種布魯菌，與AMOS-PCR結(jié)果吻合。

近年來(lái)我國(guó)布病再度流行，防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。2000年以后，北京市布病疫情與全國(guó)一樣，報(bào)告病例數(shù)呈逐年上升，并由高危人群并向普通人群擴(kuò)散。此外，畜間疫情頻發(fā)，并有局部暴發(fā)[7]，防控形勢(shì)非常嚴(yán)峻。本研究結(jié)果顯示MLST分型具有較好的分辨率，能夠與其它方法互為補(bǔ)充，對(duì)布病的感染溯源具有重要作用，研究結(jié)果不僅充實(shí)了布魯菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，也為北京地區(qū)布病的防控提供了科學(xué)依據(jù)，在保護(hù)人群健康和保障畜牧業(yè)發(fā)展方面具有重要意義。

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