◎ 曾鳳仙，周道志，謝 燕

（湛江國聯(lián)水產(chǎn)開發(fā)股份有限公司，廣東 湛江 524022）

1 研究背景

1.1 食源性生物活性肽抗氧化活性的研究現(xiàn)狀及存在問題

自1960年Marcuse[1]首次報道活性肽的抗氧化作用起，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)食物蛋白中的多肽或寡肽具有抗氧化性。抗氧化肽結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性高，且無任何免疫毒性，同時還兼具營養(yǎng)功能。近年來，酶解蛋白制備抗氧化活性肽的研究從來源上主要集中于大豆、蛋清等動植物[2-9]和魚、扇貝等[10-12]海洋生物。

有研究指出，類蛋白反應(yīng)修飾可提高蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。類蛋白反應(yīng)是指在一定條件下通過蛋白酶催化將濃度較高的蛋白質(zhì)水解物與蛋白酶一起加熱處理生成一種類似高分子蛋白質(zhì)物質(zhì)的一類反應(yīng)。與美拉德反應(yīng)修飾相比，類蛋白反應(yīng)的優(yōu)勢在于反應(yīng)過程中不用添加非蛋白成分，同時還能改善蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值和某些功能特性[13-18]。此外，有研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，添加氨基酸可以改善類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)。王豪等[14]人的報告中指出，當某些特定的氨基酸組合至二肽中后，會表現(xiàn)出更強的抗氧化活性；疏水性肽段的抗氧化活性比親水性肽段更強；抗氧化活性與構(gòu)成肽段的氨基酸殘基的順序密切相關(guān)。

1.2 波紋巴非蛤加工利用情況

波紋巴非蛤大部分是帶殼鮮銷，也有去殼取肉加工成干制品、罐頭、蛤油等，但經(jīng)濟效益均不高。目前，國內(nèi)外對波紋巴非蛤的研究主要集中在基本成分測定、低分子肽制備方面[21]。近年來，研究者開始對波紋巴非蛤酶法提取活性肽及其抗氧化活性進行研究分析，研究均表明波紋巴非蛤蛋白酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑[21-22]。2014年，何小慶等[21]人的研究中指出，波紋巴非蛤三個蛋白組具有很好的抗氧化活性。

但由于波紋巴非蛤蛋白酶解所得的抗氧化肽得率低、活性不高，不利于商業(yè)化生產(chǎn)，因此提高波紋巴非蛤酶解肽抗氧化活性是本課題的主要研究目的。

1.3 本課題研究的主要內(nèi)容及意義

本課題以波紋巴非蛤酶解液為研究對象，根據(jù)類蛋白反應(yīng)的機理，添加外源氨基酸，以游離氨基酸減少量、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率為指標，研究添加外源氨基酸酶促修飾對波紋巴非蛤酶解肽抗氧化活性的影響。實驗內(nèi)容包括：①篩選酶促修飾反應(yīng)的蛋白酶和外源氨基酸種類。②利用單因素實驗與響應(yīng)面實驗相結(jié)合，對外源氨基酸酶促修飾反應(yīng)的工藝條件進行優(yōu)化。③采取高效體積排阻色譜法（HPSEC），對波紋巴非蛤的酶解產(chǎn)物和進行外源氨基酸酶促脅迫反應(yīng)后的產(chǎn)物進行分子量分析。

本課題研究利用外源氨基酸酶促修飾技術(shù)提高波紋巴非蛤酶解肽的抗氧化活性，提高波紋巴非蛤抗氧化肽進行工藝化生產(chǎn)的可行性；同時，讓波紋巴非蛤蛋白資源在制備抗氧化生物活性肽領(lǐng)域上得到進一步發(fā)展，提高波紋巴非蛤的經(jīng)濟效益。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

新鮮波紋巴非蛤，購于湛江市東風市場。

2.2 儀器和試劑

2.2.1 主要儀器設(shè)備

Sigma3k3高速冷凍離心機（貝朗國際生物工程公司）、T18 basic高速組織搗碎機（德國IK集團公司）、FA2104A型電子天平（上海天平儀器廠）、數(shù)顯雷磁PHS-25型酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）、FDU-1100冷凍干燥機（EYELA東京理化器械柱式會社）、FA2104A電子分析天平（上海天平儀器廠）、SHZ-B型恒溫水浴震蕩器（江蘇金壇市佳美儀器有限公司）、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市佳美儀器有限公司）、CR22G Ⅱ型高速冷凍離心機（日立工機株式會社）、ST2106多功能電磁爐（廣東美的生活電器電磁爐制造有限公司）、UV-2102紫外/可見分光光度計（龍尼柯儀器有限公司）、AgilentLC1200液相色譜儀（美國安捷倫公司）Waters Protein-PAK60A（WAT085250）色譜柱（美國Waters公司）。

2.2.2 主要化學試劑

95%乙醇（分析純）、無水乙醇（分析純）、福林（Folin）-酚試劑、DPPH自由基、水楊酸、硫酸亞鐵、氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、無水碳酸鈉（分析純）、硼酸、OPA（鄰苯二甲醛）、β-巰基乙醇、三氯乙酸、牛血紅蛋白。

2.3 試驗方法

2.3.1 原料預(yù)處理

波紋巴非蛤去殼、去內(nèi)臟，然后用清洗瀝水，最后分裝、冷凍。

2.3.2 波紋巴非蛤酶解

波紋巴非蛤肉解凍→攪碎→加水勻漿（料水比1∶2）→調(diào)節(jié)pH值為8.0→保溫→酶解（堿性蛋白酶加酶量3 300 U/g，溫度為55 ℃）→滅酶→冷卻→離心→陶瓷膜（200 nm）→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→真空冷凍干燥→分裝→凍藏。

2.3.3 可溶性蛋白含量測定

采用福林（Folin-Phenol）酚試劑法[23]。

2.3.4 酶活性測定

①采用福林酚法[20]，測得堿性蛋白酶活力10萬U/g、木瓜蛋白酶活力12萬U/g、胰蛋白酶活力9萬U/g。②參照文獻[24]，采用血紅蛋白為底物的分光光度測定法，測得結(jié)果為胃蛋白酶活力20萬U/g。

2.3.5 游離氨基酸含量測定

采用OPA[25-26]（鄰苯二甲醛）法。參照文獻[20]的方法，準確稱取0.07 g OPA（鄰苯二甲醛）置于小燒杯中，邊加無水乙醇邊充分攪拌，使其完全溶解，精確定容至10 mL容量瓶，配制成濃度為7 g/L的OPA乙醇溶液。取配制好的OPA乙醇溶液1 mL，加入β-巰基乙醇40 μL，用0.4 mol/L的硼酸緩沖液（pH 9.5）將其定容至100 mL，得到OPA稀釋液。精確稱亮氨酸0.300 0 g，加入5 mL 1 mol/L HCl使之完全溶解，用蒸餾水定容到100 mL，再取此液10 mL，用蒸餾水定容至50 mL，制得600 μg/mL的亮氨酸標準溶液。

按照表1將亮氨酸標準溶液配制成不同濃度的工作溶液，然后取各工作溶液3 mL，在室溫下加入3 mL OPA稀釋液，用漩渦混合儀將其混勻（準確計時6 min)，然后將其在紫外分光光度計上334.5 nm處測吸光值，每個濃度做3次平行試驗，根據(jù)亮氨酸工作液的濃度與其在334.5 nm處測得的吸光值的關(guān)系繪制出標準曲線如圖1所示，得到標準曲線方程y=42.948x-1.137 8，其相關(guān)系數(shù)R2=1.000 0。

將樣品溶液稀釋適當?shù)谋稊?shù)后，在相同條件下按照上述步驟測定樣品稀釋液在334.5 nm處的吸光值。根據(jù)標準曲線計算出樣品溶液中的游離氨基酸含量。

表1 不同濃度亮氨酸工作溶液的配制表

圖1 亮氨酸標準曲線圖

2.3.6 抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除活性的測定。參照文獻[27]的方法，略加修改。取3.0 mL樣液與等體積的0.2 mmol/L DPPH自由基的95%乙醇溶液于試管中，混勻后在室溫下放置30 min，測定其在517 nm波長下的吸光值，做3個平行。DPPH自由基清除率（Y1）計算公式為：

式中，AS為樣品和3.0 mL DPPH自由基乙醇溶液反應(yīng)后的吸光值；A0為樣品和3.0 mL 95%乙醇溶液反應(yīng)后的吸光值；A為蒸餾水和3.0mL DPPH自由基乙醇溶液反應(yīng)后的吸光值。

（2）羥自由基清除能力的測定。參照文獻[28]的方法，略加修改。取2.0 mL樣液、2.0 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液和等體積的9 mmol/L硫酸亞鐵溶液于試管中，混勻，加入2.0mL 8.8 mmol/L H2O2反應(yīng)。在37 ℃水浴中保溫30 min后，在510 nm波長下測其吸光值，做3個平行。羥基自由基清除率（Y2）計算公式為：

式中，AS為實驗組的吸光值；A0為蒸餾水代替樣品組的吸光值；AC為蒸餾水代替H2O2組的吸光值。

2.3.7 添加外源氨基酸酶促脅迫反應(yīng)條件優(yōu)化

酶促脅迫修飾是指在類蛋白反應(yīng)的轉(zhuǎn)肽或縮合反應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用高濃度的蛋白水解物在合適的條件下（底物濃度、pH、溫度等），在適宜蛋白酶的催化作用下，添加適量氨基酸與高濃度的蛋白質(zhì)水解物一起加熱處理，最終得到一種高分子蛋白類似物的技術(shù)。因此，首先進行蛋白酶和氨基酸的篩選。參照文獻[1]可知，蛋白酶添加量、氨基酸添加量、底物濃度、pH、溫度和反應(yīng)時間均為影響酶促脅迫修飾反應(yīng)的因素，以此為依據(jù)，依次進行單因素實驗。

對單因素試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理分析，篩選出顯著的影響因素及水平，進行響應(yīng)面實驗。以游離氨基酸減少量（Y1）、DPPH自由基清除率（Y2）、羥自由基清除率（Y3）作為響應(yīng)目標，采用Box-Behnken實驗設(shè)計采集實驗數(shù)據(jù)，確定最優(yōu)反應(yīng)條件。

2.3.8 分子量分布的檢測（高效體積排阻色譜法HPSEC）

采取高效體積排阻色譜法（HPSEC）測定波紋巴非蛤的酶解產(chǎn)物和最優(yōu)條件下進行外源氨基酸酶促脅迫反應(yīng)產(chǎn)物的分子量分布情況，測定得到標準品分子量分布如圖2所示。以標準物獲得的保留時間（t），相對分子量Mr的對數(shù)LgMr為縱坐標，繪制分子量標準曲線如圖3所示。計算得到關(guān)于分子量的線性回歸方程y=-0.208 0x+6.045 0，其決定系數(shù)R2=0.990 5，接近于1，說明回歸模型具有良好的線性相關(guān)程度和擬合效果。

圖2 標準品分子量分布圖

圖3 分子量標準曲線圖

3 結(jié)果與分析

3.1 蛋白酶種類和外源氨基酸種類的考察

（1）蛋白酶種類的考察。分別選擇木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶進行實驗，測得反應(yīng)游離氨基酸減少量、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率結(jié)果見表2。

表2 蛋白酶種類的考察結(jié)果表

結(jié)果顯示，當選擇木瓜蛋白酶進行反應(yīng)時，其DPPH自由基清除率和羥自由基清除率都明顯高于其他3種蛋白酶。故選擇木瓜蛋白酶作為外源氨基酸酶促脅迫反應(yīng)實驗的添加蛋白酶。

（2）外源氨基酸種類的考察。分別添加相同量的組氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸進行實驗，測定反應(yīng)游離氨基酸減少量、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率。結(jié)果顯示，添加半胱氨酸的實驗組DPPH自由基清除率高達90%明顯高于其他實驗組，但羥自由基清除率只有43.5%，均低于其他實驗組，故選擇半胱氨酸分別與其他4種氨基酸等比混合進行二次考察實驗。

第2次實驗結(jié)果顯示，4組DPPH自由基清除率均達90%，無顯著差異，但半胱氨酸與賴氨酸混合實驗組羥自由基清除率明顯高于其他3組，綜合考慮后選擇以半胱氨酸與賴氨酸混合的氨基酸。為確定最佳氨基酸混合比，故選擇半胱氨酸、賴氨酸的比例分別為4∶6、3∶7、2∶8混合比進行第三次考察實驗。

第3次實驗結(jié)果顯示，實驗組（2∶8）的DPPH自由基清除率明顯低于其他兩組實驗組，而這兩組結(jié)果無顯著差異；實驗組（4∶6）的羥自由基清除率明顯低于其他兩組實驗組，而這兩組結(jié)果無顯著差異，故綜合考慮，選擇以半胱氨酸∶賴氨酸=3∶7的混合氨基酸為外源氨基酸。

固定木瓜蛋白酶和半胱氨酸∶賴氨酸=3∶7的混合氨基酸，按順序依次進行單因素實驗，測定酶促脅迫反應(yīng)產(chǎn)物的游離氨基酸減少量和抗氧化活性，并將測定結(jié)果利用Excel繪制成圖4～9。

3.2 單因素試驗

3.2.1 蛋白酶添加量的考察

選擇反應(yīng)條件為底物濃度40%、氨基酸添加量0.4 g/g（底物中游離氨基酸含量，下同）、pH 6.0、反應(yīng)時間5 h、反應(yīng)溫度40 ℃。蛋白酶添加量的考察水平為2 000、3 000 、4 000 U/g和5 000 U/g。測定結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶添加量對酶促脅迫反應(yīng)的影響圖

由圖4可知，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，游離氨基酸減少量無明顯變化，DPPH自由基清除率和羥自由基清除率隨酶添加量的增加而增加，添加量為4 000 U/g時，DPPH自由基清除率和羥自由基清除率為最大值。

3.2.2 外源氨基酸添加量的考察

選擇反應(yīng)條件為底物濃度40%、木瓜蛋白酶添加量4 000 U/g、pH 6.0、反應(yīng)時間5 h、反應(yīng)溫度40 ℃。氨基酸添加量的考察水平為0.2、0.3、0.4、0.5 g/g和0.6 g/g。測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 氨基酸添加量對酶促脅迫反應(yīng)的影響圖

由圖5可知，隨著混合氨基酸添加量的增加，游離氨基酸減少量、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率隨之增加，添加量為0.5 g/g時，游離氨基酸減少量、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率均達到最大值。

3.2.3 底物濃度的考察

選擇反應(yīng)條件為木瓜蛋白酶添加量為4 000 U/g、氨基酸添加總量為0.5 g/g、pH 6.0、反應(yīng)時間5 h、反應(yīng)溫度40 ℃。底物濃度的考察水平為20%、30%、40%和50%。測定結(jié)果如圖6所示。

圖6 底物濃度對酶促脅迫反應(yīng)的影響圖

由圖6可知，隨著底物濃度的增加，DPPH自由基清除率隨之增加，游離氨基酸減少量和羥自由基清除率隨無規(guī)律性變化；底物濃度為40%時，游離氨基酸減少量羥自由基清除和率DPPH自由基清除率均達到最大值。

3.2.4 pH的考察

選擇反應(yīng)條件為底物濃度40%、木瓜蛋白酶添加量為4 000 U/g、氨基酸添加總量為0.5 g/g、反應(yīng)時間5 h、反應(yīng)溫度40 ℃。pH的考察水平為4.0、5.0、6.0、7.0。測定結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH對酶促脅迫反應(yīng)的影響圖

由圖7可知，隨著反應(yīng)pH的增加，游離氨基酸減少量無明顯變化，而DPPH自由基清除率及羥自由基清除率先增加后減少，當pH為5.0時，DPPH自由基清除率及羥自由基清除率均達到最大值。

3.2.5 反應(yīng)時間的考察

選擇反應(yīng)條件為底物濃度40%、木瓜蛋白酶添加量為4 000 U/g、氨基酸添加總量為0.5 g/g、pH為5.0、反應(yīng)溫度40 ℃。反應(yīng)時間的考察水平為2、3、4、5 h和6 h。測定結(jié)果如圖8所示。

圖8 反應(yīng)時間對酶促脅迫反應(yīng)的影響圖

由圖8所示，隨著反應(yīng)時間的增加，羥自由基清除率先增加后減少，游離氨基酸減少量及DPPH自由基清除率無明顯變化。當反應(yīng)時間為3 h時，羥自由基清除率達到最大值。

3.2.6 反應(yīng)溫度的考察

選擇反應(yīng)條件為底物濃度40%、木瓜蛋白酶添加量為4 000 U/g、氨基酸添加總量為0.5 g/g、pH為5.0、反應(yīng)時間3 h。反應(yīng)溫度的考察水平為20、30、40、50 ℃和60 ℃，測定結(jié)果如圖9所示。

圖9 反應(yīng)溫度對酶促脅迫反應(yīng)的影響圖

由圖9可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，游離氨基酸減少量無明顯變化，DPPH自由基清除率及羥自由基清除率先增加后減少，當溫度為30 ℃時，DPPH自由基清除率及羥自由基清除率均達到最大值。

3.2.7 響應(yīng)面分析因素水平的選取

對單因素實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 單因素方差分析結(jié)果表

由表3可知，不同外源氨基酸添加量，不同反應(yīng)溫度對反應(yīng)游離氨基酸減少量、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率均有較大影響（p＜0.05）；不同酶添加量對反應(yīng)羥自由基清除率有較大影響（p＜0.05）；不同反應(yīng)pH對DPPH自由基清除率、羥自由基清除率有較大影響（p＜0.05）；選擇不同底物濃度時，反應(yīng)游離氨基酸減少量、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率均無顯著性差異（p＞0.05）；選擇不同反應(yīng)時間時反應(yīng)游離氨基酸減少量、DPPH自由基清除率均無顯著性差異（p＞0.05）。

結(jié)合單因素實驗結(jié)果顯著性影響分析，綜合考慮酶的性質(zhì)和pH對DPPH和羥自由基測定的影響，固定反應(yīng)pH、底物濃度、反應(yīng)時間，確定選取酶添加量（X1）、氨基酸添加量（X2）、反應(yīng)溫度（X3）為響應(yīng)面分析因素，并根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，以各單因素最優(yōu)值點為中心，上下區(qū)域各取一個水平值作為響應(yīng)面實驗設(shè)計水平，設(shè)計出響應(yīng)面法實驗設(shè)計因素水平表見表4。

表4 響應(yīng)面實驗因素水平表

3.3 添加外源氨基酸酶促脅迫反應(yīng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果直觀分析結(jié)果，固定添加木瓜蛋白酶及半胱氨酸與賴氨酸（混合比為3∶7）、固定底物濃度為40%、pH為5.0、反應(yīng)時間為3 h，以游離氨基酸減少量（Y1）、DPPH自由基清除率（Y2）、羥自由基清除率（Y3）為評價指標，按照表1設(shè)計的試驗點進行Box-Behnken試驗，中心組合試驗設(shè)計結(jié)果見表5。所有實驗均以隨機化順序進行，并重復3次。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果表

3.3.1 添加外源氨基酸酶促脅迫反應(yīng)對游離氨基酸減少量的影響

利用三維響應(yīng)曲面圖描述三個因素對游離氨基酸含量的影響，通過固定其中1個因素水平作為0水平，利用Design-Expert.V8.06軟件作出的三維曲面圖，并進行二次多項回歸擬合，獲得響應(yīng)值游離氨基酸減少量（Y1）與因素加酶量（X1）、氨基酸添加量（X2）、反應(yīng)溫度（X3）之間關(guān)系的二次多項式回歸方程為：

方差分析結(jié)果見表6。所得回歸模型極其顯著（p＜0.000 1）。失擬項（Lack of Fit）p=0.885 5＞0.05，無顯著性差異，表明模型擬合度良好，模型的殘差（Residual）可能是由隨機誤差產(chǎn)生，即可用此模型和方程來分析和預(yù)測游離氨基酸減少量。

由方差分析結(jié)果可知，對回歸方程進行檢驗，校正決定系數(shù)R2adj=0.943 1，表明模型能較好地反映出酶促脅迫反應(yīng)過程中游離氨基酸減少量變化情況。從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果中可知，模型的一次項中X2（氨基酸添加量）影響程度為極其顯著（p＜0.000 1），而其他項均無顯著影響（p＞0.05）。

表6 游離氨基酸減少量方差分析結(jié)果表

應(yīng)用Design-EXpert軟件所作的響應(yīng)面曲面圖及其等高線如圖10所示，可以得出以下結(jié)論：①隨著氨基酸添加量的增加，反應(yīng)體系游離氨基酸減少量逐漸提高。②酶添加量和反應(yīng)溫度對游離氨基酸減少量的影響趨勢不明顯。由響應(yīng)曲面的陡峭程度可知，氨基酸添加量對游離氨基酸減少量的影響極其顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖10 加酶量、氨基酸添加量和反應(yīng)溫度對游離氨基酸減少量的影響圖

3.3.2 添加外源氨基酸酶促脅迫反應(yīng)對DPPH自由基清除率的影響

利用三維響應(yīng)曲面圖描述三個因素對DPPH自由基清除率活性的影響，通過固定其中1個因素水平作為0水平，利用Design-Expert軟件作出的三維曲面圖，并進行二次多項回歸擬合，獲得響應(yīng)值DPPH清除率活性（Y2）與因素加酶量（X1）、氨基酸添加量（X2）、反應(yīng)溫度（X3）之間關(guān)系的二次多項式回歸方程為：

方差分析結(jié)果見表7。所得模型顯著（p＜0.05），失擬項（Lack of Fit）P=0.218 4＞0.05，無顯著性差異，表明模型擬合度良好，模型的殘差（Residual）可能是由隨機誤差產(chǎn)生，即可用此模型和方程來分析和預(yù)測DPPH自由基清除率。

由方差分析結(jié)果可知，對回歸方程進行檢驗，校正決定系數(shù)R2adj=0.881 7，表明模型能較好地反映出酶促脅迫反應(yīng)過程中DPPH自由基清除率變化情況。從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果中可知，模型的二次項中X12、X22、X32均顯著，其中X22影響程度為極其顯著（p＜0.000 1），而其他項均無顯著影響（p＞0.05）。

表7 DPPH自由基清除率方差分析結(jié)果表

應(yīng)用Design-Expert軟件所作的響應(yīng)面曲面圖及其等高線如圖11所示，可以得出以下結(jié)論：隨著加酶量、氨基酸添加量和反應(yīng)溫度的增加，反應(yīng)體系DPPH清除率逐漸提高，當體系中DPPH清除率增大到一定程度后，又逐漸降低。

圖11 加酶量、氨基酸添加量和反應(yīng)溫度對DPPH自由基清除率的影響圖

3.3.3 最佳反應(yīng)條件確定及驗證試驗

利用Design-Expert軟件求解回歸方程得到，以游離氨基酸減少量（Y1）、DPPH自由基清除率（Y2）、羥自由基清除率（Y3）為評價指標，添加外源氨基酸對波紋巴非蛤酶解肽酶促脅迫反應(yīng)最佳條件：酶添加量為3 745.96 U/g，混合氨基酸添加總量為0.56 g/g，反應(yīng)溫度為33.93 ℃，此條件下游離氨基酸減少量預(yù)測值為26.062 8 mg/mL，DPPH自由基清除率預(yù)測值為90.141 5%，羥自由基清除率預(yù)測值為52.159 9%。

為了方便起見，將酶添加量定為3 800 U/g，混合氨基酸添加總量為0.56 g/g，反應(yīng)溫度為34 ℃，并依據(jù)所確定的最佳反應(yīng)條件進行實際驗證，重復次數(shù)為3次，實際得到游離氨基酸減少量為（24.05±0.24)mg/mL，DPPH自由基清除率為（90.24±0.46)%，羥自由基清除率為（50.44±0.07)%，與預(yù)測值基本吻合。

3.4 分子量分布測定結(jié)果

采取HPSEC測定酶促脅迫修飾反應(yīng)前后的產(chǎn)物的分子量分布如圖12所示。

圖12 酶促脅迫修飾反應(yīng)前后分子量分布對比圖

結(jié)合反應(yīng)前后分子量分布對比圖，得到酶促脅迫修飾反應(yīng)前后底物和產(chǎn)物抗氧化活性對比，結(jié)果見表8。

表8 酶促脅迫修飾反應(yīng)前后抗氧化活性對比表

由表8可知，酶促脅迫修飾反應(yīng)后產(chǎn)物的抗氧化活性顯著提高，而Mr＜5 000 Da的占比并沒有顯著上升，造成這一現(xiàn)象可能是由于底物中小分子肽間發(fā)生了轉(zhuǎn)肽反應(yīng)以及氨基酸等的縮合反應(yīng)。

4 結(jié)論

（1）通過篩選實驗篩選出外源氨基酸酶促修飾波紋巴非蛤酶解肽反應(yīng)添加的蛋白酶為木瓜蛋白酶，外源氨基酸為半胱氨酸與賴氨酸（混合比為3∶7）。

（2）通過單因素實驗方差分析結(jié)果可知，加酶量、氨基酸添加量、反應(yīng)溫度對波紋巴非蛤酶解肽添加外源氨基酸酶促脅迫反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性影響最顯著，而底物濃度、反應(yīng)時間、pH對產(chǎn)物抗氧化活性影響不太顯著。且最適宜的固定反應(yīng)條件是底物濃度為40%、pH為5.0、反應(yīng)時間為3 h。

（3）通過響應(yīng)面分析法，得到在添加外源氨基酸對波紋巴非蛤酶解肽進行酶促脅迫的反應(yīng)中最優(yōu)的反應(yīng)條件為加酶量3 800 U/g，混合氨基酸添加總量0.56 g/g，反應(yīng)溫度34 ℃。

（4）波紋巴非蛤酶解肽的DPPH自由基清除率為（38.67±0.46）%，羥自由基清除率為（34.7±0.43）%。在最適宜條件下對波紋巴非蛤添加外源氨基酸進行酶促脅迫實驗得到反應(yīng)產(chǎn)物游離氨基酸減少量為（24.05±0.24）mg/mL，DPPH自由基清除率為（90.24±0.46）%，羥自由基清除率為（50.44±0.07）%。添加外源氨基酸可提高波紋巴非蛤酶解肽抗氧化活性，其中DPPH自由基清除率有顯著提高，羥自由基清除率也有所提高。

（5）波紋巴非蛤酶解肽添加外源氨基酸進行酶促脅迫反應(yīng)后抗氧化活性有顯著提高，但HPSEC測定結(jié)果顯示Mr＜5 000 Da占比只有略微升高，造成這一現(xiàn)象可能是由于底物中小分子肽間發(fā)生了轉(zhuǎn)肽反應(yīng)以及氨基酸等的縮合反應(yīng)。

參考文獻：

[1]Marcuse R. Antioxidative effect of aminoacids[J].Nature，1960，186：886-887.

[2]劉 丹.大豆抗氧化活性肽的生物制備技術(shù)及穩(wěn)定性研究[D].長春：吉林大學，2014.

[3]吳欣欣.玉米蛋白酶解物抗氧化活性研究[D].鄭州：河南工業(yè)大學，2013.

[4]郭興鳳，胡二坤，蔣淑華，等.花生蛋白酶水解產(chǎn)物抗氧化活性研究[J].中國油脂，2005，30（3）：61-63.

[5]張 苗.甘薯蛋白酶解肽的抗氧化及結(jié)腸癌活性研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2012.

[6]金 晶.菜籽蛋白酶解及產(chǎn)物抗氧化活性的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2009.

[7]周雪松.雞肉蛋白酶解及其產(chǎn)物抗氧化活性研究[D].廣州：華南理工大學，2006.

[8]鄭 淋，林松毅，劉靜波，等.蛋清蛋白酶解物清除DPPH自由基活性研究[J].食品工業(yè)，2009（3）：1-3.[9]趙文博.干酪乳清水解產(chǎn)物的抗氧化活性研究[D].天津：天津科技大學，2010.

[10]厲 望.帶魚蛋白酶解制備抗氧化活性肽的研究[D].杭州：浙江大學，2013.

[11]張莉莉.扇貝抗氧化活性肽的制備及其活性的研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學，2013.

[12]汪秋寬，劉紅丹，徐 堅，等.牡蠣酶解液的抗氧化活性[J].中國水產(chǎn)科學，2007，14（2）：295-300.

[13]張君慧，張 暉，王興國，等.抗氧化活性肽的研究進展[J].中國糧油學報，2008，23（6）：227-233.

[14]王 豪，蘇米亞，孫克杰，等.食源性抗氧化肽研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012（24）：1680-1689.

[15]于麗娜，高俊安，楊慶利，等.不同處理條件對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響[J].食品科學，2012，33（11）：104-110.

[16]孟艷麗.Maillard反應(yīng)修飾鰱魚肽的理化特性及其抗氧化活性研究[D].青島：中國海洋大學，2012.

[17]尤 娟.鰱魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備及其糖基化產(chǎn)物功能特性的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2014.

[18]姚玉靜，崔 春，邱禮平，等.類蛋白反應(yīng)條件及其機理探討[J].中國調(diào)味品，2009，3（2）：45-48.

[19]岳 楠，趙新淮.苯丙氨酸添加下酪蛋白類蛋白反應(yīng)修飾物的抗氧化性質(zhì)[J].食品工業(yè)科技，2011，32（10）：99-102，106.

[20]岳 楠.兩種氨基酸添加下酪蛋白類蛋白物的抗氧化活性研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2012.

[21]何小慶，曹文紅，章超樺，等.波紋巴非蛤蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧活性及分子量分布研究[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30（1）：74-80.

[22]何小慶，曹文紅，章超樺.波紋巴非蛤蛋白分離及其性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工藝，2013，39（5）：229-233.

[23]錢 博.乳粉蛋白質(zhì)快速檢測方法的研究[D].杭州：浙江大學，2006.

[24]張耀庭，李 娟，吉海濱，等.應(yīng)用分光光度法測定胃蛋白酶活力[J].中國生物制品學雜志，1998，11（4）：196.

[25]Mahmoud M，Malone W，Cordle C. Enzymatic hydrolysis of casein:effect of degree of hydrolysis on antigenicity and physical properties[J].Journal of Food Science，1992，57（5）：1223-1229.

[26]Spellman D，Mcevoy E，O’Cuinn G，et al.Proteinase and exopeptidase hydrolysis ofwhey protein:comparison of the TNBS，OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis[J].International Dairy Journal，2003，13（6）：447-453.

[27] Zhu B W，Zhou D Y，Li T，et al. Chemical composition and free radical scavenging activities of a sulphated polysaccharide extracted from abalone gonad(Haliotis Discus Hannai Ino)[J].Food Chemistry，2010，121（3）：712-718.

[28]張興茂，吳 暉，賴富饒.醬油渣蛋白水解產(chǎn)物抗氧化性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（10）：1200-1204.