李千惠，張丹丹，姜文龍，薛 源，張往祥,2，王改萍*

(1. 南方協(xié)同中心,南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037； 2. 揚(yáng)州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225200)

觀賞海棠(Malussp.)為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬植物，傳粉方式為典型的異花蟲媒傳粉。通過長(zhǎng)期的高度雜合，觀賞海棠已被培育出許多受歡迎的品種[1]，在美國(guó)和加拿大的園林景觀植物名錄中，可以見到的海棠栽培種就有500個(gè)以上[2]?，F(xiàn)有觀賞海棠重要特征的多樣化為培育期望值更高的新品種提供了更廣的范圍。觀賞海棠的花期，根據(jù)氣候的不同，約從3月底開始至5月初結(jié)束，可達(dá)30 d左右，而單個(gè)品種的花期范圍為3—7 d，因此，很多親本組合的雜交受到時(shí)間上的阻隔。

花色及果色的鮮艷亮麗且不褪色，是觀賞海棠的重要觀賞特征。‘高原紅’(M. ‘Prairifire’)作為兼具以上特點(diǎn)的品種之一，更有花量、果量均較大的優(yōu)勢(shì)，為絕佳的雜交親本品種。將這種特征傳授給其他花形優(yōu)美卻褪色的品種如白蘭地(M. ‘Brandymine’)，則會(huì)受到不同花時(shí)的影響，而花粉壽命及其質(zhì)量也會(huì)直接影響著授粉的結(jié)果[3]。因此，掌握花粉的貯藏特性，是合理開展雜交育種的基礎(chǔ)。目前，對(duì)一些樹種花粉的研究，涉及對(duì)在不同的貯藏條件下的花粉活力的測(cè)定，貯藏方法的優(yōu)化，以及對(duì)花粉進(jìn)行短期或長(zhǎng)期的儲(chǔ)存[4-6]?；ǚ刍盍κ軠囟鹊戎T多外在因素的影響，也因自身遺傳特性而異[7]。低溫能延長(zhǎng)花粉的貯藏期限，大多數(shù)植物在-20 ℃即可保持其生活力[8]。Perveen等研究了不同貯藏溫度下的蘋果花粉，發(fā)現(xiàn)相比4 ℃下貯藏的花粉，在-196 ℃溫度下貯藏的萌發(fā)率更高[9]。然而多數(shù)研究關(guān)注零上溫度與超低溫之間對(duì)花粉貯藏效果的影響，在小溫度差對(duì)花粉貯藏影響的區(qū)別研究上鮮有報(bào)道。因此，本研究基于4種貯藏溫度(4，-20，-70 ℃及室溫)下觀測(cè)花粉萌發(fā)率的動(dòng)態(tài)變化，開展了小溫差對(duì)花粉貯藏的影響及區(qū)別研究，探討了觀賞海棠花粉短期貯藏的適宜溫度。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于江蘇省江都市仙女鎮(zhèn)(東經(jīng) 119°55′，北緯 32°42′)南京林業(yè)大學(xué)海棠種質(zhì)資源圃，屬于北亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明。年平均氣溫約 14.9 ℃，年平均降雨量約 1 000 mm，無霜期約320 d。試驗(yàn)地地勢(shì)平坦，立地條件一致，土壤為沙壤土，土層深厚肥沃，灌排條件良好。

選取‘高原紅’5年生健壯無病蟲害實(shí)生苗作為試驗(yàn)材料。

1.2 花粉采集方法

于8:00—10:00采集高原紅盛花期花朵，放入硫酸紙袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用鑷子將花藥取下后，將其攤在硫酸紙袋上，置于避風(fēng)干燥處自然散粉，待完全散粉后用離心管收集花粉，備用。

1.3 掃描電鏡觀察

取海棠高原紅適量花粉于40 ℃干燥14 d后，直接將花粉撒在粘有雙面膠的樣品托上，真空噴鍍，置于KYKY-1000B型掃描電子顯微鏡下觀察，選取較為典型的花粉粒，在2 000—6 000 倍顯微下拍照。主要觀察花粉形狀，對(duì)稱性，赤道面觀特點(diǎn)，萌發(fā)孔，外壁紋飾等特征。將拍得數(shù)碼照片導(dǎo)入電腦后用DT2000圖像分析軟件對(duì)隨機(jī)選擇的100粒花粉，進(jìn)行其極軸長(zhǎng)(P)、赤道軸長(zhǎng)(E0)、赤道軸到2端點(diǎn)中間橫截面的直徑(E1/2)及萌發(fā)孔長(zhǎng)寬的測(cè)定。

1.4 熒光顯微觀察

分別采集授粉后(高原紅♂×白蘭地♀)8，12 h的雌蕊各10個(gè)(花柱和子房)，用FAA固定液(75%乙醇∶甲醛∶冰醋酸=89∶6∶5，體積比)固定，然后進(jìn)行低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

取出固定的樣品裝入10 mL離心管中，用50%，30%酒精溶液及清水依次分別清洗3次，貼上標(biāo)簽，加入10 mol/L的NaOH溶液軟化8 h，隨后用0.15 mol/L水溶性苯胺藍(lán)置于暗處染色12 h。染色完成后，用鑷子取出樣品，置于載玻片上，用鑷子、解剖針和刀片將子房和花柱分開，然后將子房和柱頭分別壓片，使其能在玻片上充分展開，點(diǎn)上50%甘油封片，置于暗處待觀察。用LeicaDM-5000 B熒光顯微鏡觀察，并記錄拍照。

1.5 花粉貯藏條件

將采集的花粉分別置于4種條件下 (4，-20，-70 ℃及室溫) 貯藏，其中4 ℃和-20 ℃貯藏冰箱為SIMENS BCD-277冰箱，-70 ℃貯藏冰箱為SANYO MDF-U32V超低溫冰箱。

1.6 花粉生活力測(cè)定

花粉培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)法[10]，在雙凹載玻片上滴加50 μL液體培養(yǎng)基(10%蔗糖溶液)，用大頭針蘸取適量花粉，使其均勻地散落在培養(yǎng)基上，將載玻片水平置于鋪有濕潤(rùn)脫脂棉的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25 ℃條件下保濕培養(yǎng)。用NIKON YS100光學(xué)顯微鏡觀察，每個(gè)玻片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的視野，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑視為萌發(fā)，測(cè)定花粉管長(zhǎng)度(如圖3E)。各試驗(yàn)均重復(fù)4次。

萌發(fā)率=(已萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù))×100%

1.7 數(shù)據(jù)分析

對(duì)高原紅花粉萌發(fā)試驗(yàn)的不同貯藏條件花粉管生長(zhǎng)速率，以DPS軟件采用Duncan進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電鏡觀察

花粉粒P值為(45.57±2.92) μm，E0值為(23.91±4.96) μm，E1/2值為(20.61±5.83)μm，反應(yīng)花粉相對(duì)大小的P×E0為(1 090.12±6.76)μm；花粉極面觀為3裂圓形，赤面觀為長(zhǎng)球形，P/E0為(1.91±4.72)μm，P/E1/2為(2.22±6.40)μm，E1/2/E0為(0.86±4.43)μm；花粉條脊寬(0.18±11.06)μm，條脊距(0.21±42.10)μm，條脊較長(zhǎng)且較清晰，分叉多，紋飾特征為局部規(guī)則多個(gè)方式型(PRM，100)。穿孔密度(9.31±24.01)個(gè)/μm2，分布不均勻且赤面較多，穿孔大(見圖1)。

(A) 赤面雙溝；(B) 極面觀；(C) 赤面紋飾；(D) 群體

2.2 花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

從表1可以看出，蔗糖在海棠花粉離體萌發(fā)中有著重要的作用，適宜的蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%)可使高原紅花粉的離體萌發(fā)率高達(dá)89.7%，過高或過低都會(huì)極顯著地降低其萌發(fā)率(P<0.01)。而在僅含有H3BO3的培養(yǎng)基中，隨著H3BO3濃度的升高，花粉萌發(fā)率表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，說明H3BO3的存在對(duì)高原紅花粉的萌發(fā)有一定程度的抑制作用，當(dāng)H3BO3濃度為0.3 mol/L時(shí)，花粉萌發(fā)率降低至0；當(dāng)H3BO3濃度為0.2 mol/L時(shí)，其萌發(fā)率與CK下差異不顯著。說明在小于0.2 mol/L的H3BO3濃度范圍內(nèi)，相對(duì)于CK，硼酸也在一定程度上促進(jìn)了花粉的萌發(fā)。新鮮花粉離體萌發(fā)的結(jié)果顯示，在10%的蔗糖溶液中及25 ℃的培養(yǎng)溫度下，高原紅花粉培養(yǎng)4 h的萌發(fā)率為92.7%，平均花粉管長(zhǎng)度可達(dá)2.26 mm(見圖2)。

表1 不同培養(yǎng)基成分對(duì)花粉離體萌發(fā)率的影響

2.3 ‘高原紅’海棠活體萌發(fā)狀況

新鮮‘高原紅’花粉在白蘭地柱頭的萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，授粉后第8 h時(shí)，花粉的萌發(fā)率較低，且花粉管并未伸長(zhǎng)到花柱中部，而在授粉后第12 h時(shí)，花粉管則在柱頭大量萌發(fā)，且花粉管已經(jīng)伸長(zhǎng)花柱中部至基部，說明高原紅花粉在白蘭地柱頭萌發(fā)時(shí)，授粉后8—12 h是花粉管在花柱的快速伸長(zhǎng)期。

2.4 花粉貯藏過程中的活力變化

花粉貯藏試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，4種溫度下貯藏的花粉，其萌發(fā)率及平均花粉管長(zhǎng)度均呈現(xiàn)出不同程度的降低和減小(見圖2，3)。室溫(17—20 ℃)貯藏的花粉，在第10 d時(shí)，其離體萌發(fā)率即降低為0，4 ℃下貯藏的花粉萌發(fā)率則在第30 d時(shí)降低為0，比室溫貯藏的時(shí)間增加了200.0%，且當(dāng)室溫貯藏花粉的離體萌發(fā)率降低為0時(shí)，4 ℃貯藏的花粉萌發(fā)率與平均花粉管長(zhǎng)度仍然可達(dá)到39.8%和0.94 mm。然而，在-20 ℃與-70 ℃下貯藏的花粉在保存的第30 d萌發(fā)率仍然能夠分別達(dá)到31.3%和39.2%，平均花粉管長(zhǎng)度則分別為0.3 mm和0.45 mm，且在整個(gè)貯藏過程中，-70 ℃下貯藏的花粉萌發(fā)率均持續(xù)顯著高于其他溫度下貯藏的花粉(P<0.05)。而在貯藏的第2 d時(shí)，4 ℃與-20 ℃溫度下貯藏的花粉萌發(fā)率差異不顯著；貯藏至第4 d時(shí)，4 ℃下貯藏的花粉萌發(fā)率為72.54%，相對(duì)-20 ℃下貯藏的花粉，僅降低了4.1%。

圖2 不同貯藏溫度下的花粉離體萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度

A，B，C，D分別為室溫，4，-20，-70 ℃條件下保存10 d的花粉萌發(fā)情況；E，F(xiàn)顯示視為萌發(fā)的花粉(GP)、視為未萌發(fā)的花粉(UGP)與花粉管在10×視野下的狀態(tài)

3 討論

Stanley等認(rèn)為花粉離體萌發(fā)法提供的條件與花粉在柱頭萌發(fā)的條件更為接近，是檢測(cè)花粉活力最為可靠的方法[11]。離體萌發(fā)測(cè)定法根據(jù)花粉離體培養(yǎng)時(shí)的萌發(fā)率判定其生活力，要在一定的溫度和培養(yǎng)條件下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，迅速，合理，并可完全定量。蔗糖和硼酸是在花粉離體萌發(fā)時(shí)所需培養(yǎng)基的主要成分[12-13]。蔗糖是大多數(shù)植物花粉離體培養(yǎng)所必需的更為重要的培養(yǎng)成分[14-15]，其能在花粉離體培養(yǎng)時(shí)為花粉管的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和花粉萌發(fā)所需的滲透壓[16]；硼酸作為花粉離體萌發(fā)的另一重要因素，對(duì)花粉離體萌發(fā)同樣有著較為重要的作用，在離體培養(yǎng)條件下，適宜的硼酸處理可以有效提高花粉萌發(fā)率[17-19]。本研究結(jié)果表明，適宜的蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%)能夠顯著促進(jìn)花粉的萌發(fā)，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖在花粉的萌發(fā)中有顯著差異；硼酸濃度對(duì)花粉萌發(fā)有顯著影響，花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的升高而顯著下降，當(dāng)硼酸的濃度為0.05 mol/L時(shí)，‘高原紅’花粉的萌發(fā)效果最好，這可能是由于‘高原紅’花粉適宜的硼酸濃度在0—0.05 mol/L之間。以上結(jié)果說明，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖或者硼酸能夠促進(jìn)‘高原紅’花粉的萌發(fā)，過高則會(huì)起到抑制萌發(fā)的作用。

除本身的遺傳基因外，環(huán)境條件是花粉耐貯藏性的另一重要影響因素[20]，許多研究表明，貯藏溫度是保存花粉壽命的關(guān)鍵因子之一[21-23]，適宜的低溫條件較利于花粉的貯藏。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在花粉貯藏過程中，室溫(17—20 ℃)下貯藏的花粉活力急速下降，花粉管長(zhǎng)度與4，-20，-70 ℃差異顯著(P<0.01)，4 ℃下貯藏的花粉離體萌發(fā)率同樣呈現(xiàn)急速下降的趨勢(shì)，與-20,-70 ℃差異顯著(P<0.01)，而-20 ℃與-70 ℃下貯藏的花粉其離體萌發(fā)率差異不顯著，而超低溫(-70 ℃)下貯藏的花粉取出時(shí)若處理不當(dāng)容易出現(xiàn)凍融現(xiàn)象，因此，-20 ℃更適合‘高原紅’花粉的保存。

綜上所述，適宜的硼酸濃度在0—0.05 mol/L，‘高原紅’花粉離體萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基成分為10%蔗糖溶液，并與活體萌發(fā)相比較，發(fā)現(xiàn)離體萌發(fā)較快于活體萌發(fā)，且活體萌發(fā)中花粉管在授粉后第8—12 h為快速伸長(zhǎng)期；‘高原紅’花粉適宜的貯藏溫度為-20 ℃。

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