曾麗瓊，何學(xué)友，蔡守平，黃金水

(福建省林業(yè)科學(xué)研究院/國家林業(yè)局南方山地用材林培育重點實驗室，福建 福州 350012)

松萎蔫病又名松材線蟲病，是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引發(fā)的一種森林病害，屬國際重要檢疫對象，列為森林病蟲害之首[1]，被稱為“松樹的癌癥”[2-3]。該病靠媒介松墨天牛(Monochamusalternatus)攜帶傳播，使用化學(xué)藥劑可以有效控制松褐天牛，但化學(xué)藥劑造成的環(huán)境污染對生態(tài)平衡帶來越來越明顯的負(fù)面影響。隨著人們環(huán)境意識的增強，對植物寄生線蟲生物防治細(xì)菌的研究逐漸興起，應(yīng)用細(xì)菌防治植物寄生線蟲的工作己經(jīng)取得了諸多進展。研究人員對于利用細(xì)菌作為松材線蟲防治制劑的報道，多見于對具有殺松材線蟲活性細(xì)菌的篩選，如牛秋紅、鄭海營等[4-5]分別從土壤和海水中分離篩選出對松材線蟲具有較強殺線蟲活性的細(xì)菌。內(nèi)生細(xì)菌作為最具防病潛力與應(yīng)用價值的一類生物防治細(xì)菌，是植物病害生物防治的天然資源菌，其廣闊的理論研究價值和開發(fā)應(yīng)用前景，成為許多學(xué)者研究的熱點對象[6-8]。馬尾松作為松材線蟲的寄主，從其本身分離篩選對松材線蟲活性有抑制作用的細(xì)菌，是理性控制松材線蟲病的途徑，但是對于從松樹上分離的內(nèi)生細(xì)菌的研究報道較少，僅見朱麗梅、鄧海娟、李亮亮等[9-11]的報道。本研究開展了對馬尾松內(nèi)生細(xì)菌分離和對松材線蟲殺線活性的測定研究，篩選出具有較強抑制線蟲活性的細(xì)菌，并對篩選到的菌株進行初步鑒定，以期為微生物防治和開發(fā)植物寄生線蟲生物防治制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2014年11月，2015年3，6和9月分別選取在松材線蟲疫區(qū)健康生長的馬尾松枝條作為分離材料的來源。樹齡為6—7年生，采樣時將枝條放入滅菌的紙袋中帶回實驗室進行內(nèi)生細(xì)菌分離。松材線蟲來源于疫區(qū)枯死木，采用貝曼漏斗法分離后在多毛孢平板中培養(yǎng)備用。

1.2 內(nèi)生菌分離

取松樹嫩梢松針、枝條，依次用無菌水沖洗表面，75%乙醇消毒30 s、10%NaClO消毒5 min，再在無菌水中漂洗4次，用消毒枝剪剪成小段，放入裝有2 mL無菌水和少許滅過菌的石英砂的無菌研缽，將其研磨成勻漿后，靜置5 min。用移液槍吸取150 μL于NA平板中涂板，28 ℃下培養(yǎng)。待長出菌落后，觀察生長細(xì)菌菌落的狀況。同時檢查檢驗表面消毒的效果，方法為吸取150 μL第4次漂洗消毒材料的無菌水，涂平板，經(jīng)培養(yǎng)后若無微生物長出，證明表面消毒徹底。3—7 d，待長出菌落后，對不同單菌落的顏色、大小、突起特征、邊緣特征、表面光滑與否和透明度等的特征進行描述，并根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色和大小選取分離到的菌株，在平板上進行純化保存。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌殺線蟲活性測定

將保存的菌株在NA平板上活化后接種到NA培養(yǎng)液中，28 ℃條件下160 r/min培養(yǎng)48 h，取2 mL細(xì)菌發(fā)酵液至離心管中，經(jīng) 5 000 r/min離心5 min，取上清液，用濾膜孔徑為0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾，取900 μL濾液分裝到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的樣品孔中，以不接菌的NA培養(yǎng)液濾液為對照，加入線蟲懸液100 μL(50 000 條/mL)混勻，每個處理重復(fù)3次，25 ℃下慢速振蕩培養(yǎng)，分別在處理24和48 h后觀察并統(tǒng)計線蟲死亡數(shù)，觀察時取100 μL(觀察的線蟲總數(shù)不少于30頭)點到載玻片上，在10倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)死亡線蟲數(shù)及線蟲總數(shù)(線蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)是蟲體僵直，用解剖針攪動或接觸刺激時仍不活動視為死亡[12-13])。毒力級別劃分參照萬樹青[14]方法，即Ⅰ級：死亡率≥90%；Ⅱ級：70%≤死亡率<90%；Ⅲ級：50%≤死亡率<70%；Ⅳ級：30≤死亡率<50%；Ⅴ級：10≤死亡率<30%；Ⅵ代表無殺線活性。

1.4 高活性菌株的鑒定

對得到的高活性菌株進行形態(tài)觀察，革蘭氏染色和KOH拉絲試驗按照常規(guī)方法進行。細(xì)菌基因組的提取利用PCR技術(shù)，對待鑒定細(xì)菌的16S rDNA序列進行擴增，其中正向引物27F：5’-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3’，反向引物1492R：5’- T￣A￣C￣G￣G￣C￣T￣A C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C G￣A￣C￣T￣T-3’。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)33次，再在72 ℃延伸5 min后終止反應(yīng)。 PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖膠電泳進行分析，緩沖液為TAE，委托福建省尚辰生物技術(shù)有限公司進行測序，將測序結(jié)果與NCBI上面進行BLAST同源性比對，選取同源性高的菌株模式菌株序列，用MEGA5.0的Neighbor—Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值取1 000。

表1 6株細(xì)菌發(fā)酵液對松材線蟲的殺線蟲活性比較

2 結(jié)果和分析

2.1 具殺線蟲活性內(nèi)生細(xì)菌分離及篩選

經(jīng)分離得105株馬尾松內(nèi)生細(xì)菌，篩選到6株能夠比較有效的抑制松材線蟲活性。由表1中可知，具有殺線蟲活性的細(xì)菌發(fā)酵濾液處理松材線蟲24 h后，死亡率在50%及以上，活性級別均不低于Ⅲ級，并且使線蟲蟲體滲漏或消解。6株細(xì)菌的殺線活性存在明顯差異，細(xì)菌Z11-2培養(yǎng)濾液處理松材線蟲24 h的致死率達到92%，與其他5株存在極顯著差異，Z35-1和G36處理也超過85%；6株細(xì)菌對松材線蟲的消解率也存在差異極顯著，其中Z11-2培養(yǎng)濾液的消解水平最高，48 h后松材線蟲蟲體消解率為87.4%，其次為G36菌株，其消解率為77.5%，Z35-1培養(yǎng)濾液對松材線蟲的消解率也超過了70%，說明這3株細(xì)菌培養(yǎng)液中含有較高的殺線蟲活性物質(zhì)，并可能含分解松材線蟲體壁的物質(zhì)。

2.2 具較高殺線蟲活性內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

由表2可知，細(xì)菌Z11-2和G36菌體桿狀，有芽孢形成，為革蘭氏陽性。Z11-2形成乳白色稍有光澤的圓形半透明菌落，菌落表面光滑稍有凸起，邊緣整齊；細(xì)菌G36菌落白色不透明，表面濕潤光滑稍有凸起，邊緣整齊。通過PCR技術(shù)，分別得到2株細(xì)菌16S rDNA的特異性擴增，將序列分別與GenBank中的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)2株細(xì)菌與芽孢桿菌屬的同源性都較高：菌株Z11-2與Bacilluspumilus的最大相似性達到100%，菌株G36與B.pumilus的同源性為99%。根據(jù)比對結(jié)果，選取芽孢桿菌屬20種的模式菌株序列與細(xì)菌Z11-2和G36的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)，Z11-2和G36與B.pumilus(AY876289.1)位于同一簇群，親緣關(guān)系最近，初步鑒定其為短小芽孢桿菌。

表2 2株具較高殺線活性細(xì)菌形態(tài)特征

圖1 細(xì)菌Z11-2和G36的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2 結(jié)論與討論

在馬尾松上分離得到6株對松材線蟲活性具有抑制作用的細(xì)菌Z11-1，Z11-2，Z35-1，G31，G36，G42，其中細(xì)菌Z11-2和G36的殺線活性較強，其毒力級別在Ⅱ級以內(nèi)，處理24 h的松材線蟲死亡率分別為92%和89%，48 h線蟲消解率分別為87.4%和77.5%。通過形態(tài)特征觀察，結(jié)合16S rDNA序列分析，初步鑒定這2株細(xì)菌為短小芽孢桿菌(B.pumilus)。

具殺線活性的微生物及其代謝產(chǎn)物為數(shù)不少，但目前能夠商品化的微生物制劑為數(shù)極少，植物寄生線蟲生物防治細(xì)菌的研究是控制線蟲危害的一種重要防治途徑。據(jù)有關(guān)報道，至今已發(fā)現(xiàn)多種對松材線蟲具有殺線蟲活性的細(xì)菌，如徐華潮等[15]發(fā)現(xiàn)一些蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)的伴孢晶體蛋白對松材線蟲有明顯毒殺作用，Oliveira等[16]曾報道側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporu)對松材線蟲具有殺線蟲活性，郝穎[17]在腌制芥菜表面分離篩選得到1株具有殺松材線蟲活性的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)LZ-01，朱麗梅、李亮亮等[9-11]從松樹體內(nèi)分離篩選出對松材線蟲具有較高殺線蟲活性的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensJK-JS3)和短小芽孢桿菌(B.pumilusLYMC-3)。篩選有效的拮抗細(xì)菌，對于開發(fā)新的植物寄生線蟲生物防治細(xì)菌制劑有重要意義，但現(xiàn)在對內(nèi)生細(xì)菌的研究報道，只是分離、純化、種類鑒定、離體防治效果及室內(nèi)防治效果測定，因林間防治效果受到多種復(fù)雜因素的影響，離體防治效果和室內(nèi)防治效果的結(jié)果一般不能反映林間防治效果[18]。本試驗將繼續(xù)開展內(nèi)生細(xì)菌用于線蟲的林間防治試驗，這對于保護森林資源，尤其是一些受松材線蟲病威脅的風(fēng)景名勝區(qū)、重點生態(tài)區(qū)的安全有重要意義。

本試驗中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Z11-2和G36培養(yǎng)濾液不但使松材線蟲死亡，還能造成線蟲體壁被分解，引起線蟲內(nèi)容物的泄漏，最終使線蟲蟲體的消解，這與前人研究報道[9-10,19]基本相同。試驗篩選出的細(xì)菌發(fā)酵濾液之所以對松材線蟲有較高殺線活性，可能是產(chǎn)生了某種對松材線蟲活性有抑制作用的物質(zhì)，但該類物質(zhì)的性質(zhì)及其作用途徑等尚不明確，不同菌株產(chǎn)生的物質(zhì)是否相同也有待研究。

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