楊華 龔明福 徐建眾 鄒利光 張松

(1.重慶市中醫(yī)院放射科，重慶400021；2. 第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院放射科，重慶400037)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈血管依賴性，腫瘤血管的生成在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，抗腫瘤血管生成一直是腫瘤治療的研究熱點。體外腫瘤血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)試驗是目前研究腫瘤血管生成及抗腫瘤血管生成治療主要的研究手段。由于腫瘤血管的內(nèi)皮細胞(tumor-derived vascular endothelial cells，Td-VECs)與正常血管的內(nèi)皮細胞在結(jié)構(gòu)、分子表達和功能上有質(zhì)的不同[1]，因而研究腫瘤血管生成不能以正常VECs替代。然而，直接分離、培養(yǎng)腫瘤Td-VECs技術(shù)要求高，尤其是腫瘤新生血管的內(nèi)皮細胞更是難以獲得。研究表明[2,3]：通過模擬腫瘤環(huán)境，可以通過腫瘤因子誘導正常VECs向Td-VECs分化，然而，目前國內(nèi)相關(guān)文獻報道較少，尤其是針對細胞標記簡單有效的Td-VECs培養(yǎng)方法更是鮮有報道。因而，本研究描述了一種簡易、方便、可靠的Td-VECs培養(yǎng)方法，并對Td-VECs的分子表達及靶向結(jié)合能力進行分析，以期為靶向抗腫瘤血管生成提供細胞基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要的細胞、試劑與儀器 MDA-MB-231乳腺癌細胞由第三軍醫(yī)大學生物化學及分子生物學教研室惠贈；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)及染色試劑均購自美國sigma公司、Hyclone公司及Abcam公司；M199細胞培養(yǎng)液購自Hyclone公司；DAPI染色液購自美國Roche公司；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)支持物(ECGS)購自美國Sciencecell公司；Millicell小室購自美國Millipore公司；總RNA提取試劑、TriZOL試劑及DEPC水購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。超凈臺為蘇州潔凈化設(shè)備公司，核算儀為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，倒置顯微鏡和TCSSP5激光共聚焦顯微鏡為德國徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的分離、培養(yǎng) 超凈臺常規(guī)消毒、滅菌。原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基由1 mL谷氨酰胺、20mL胎牛血清、1mL肝素及1mL ECGS加入到80mL M199培養(yǎng)基中制成。取長約20cm新鮮嬰兒臍帶，剪去機械損傷的部分。在臍靜脈兩頭套上三通管，手術(shù)縫線固定，預(yù)冷的PBS液反復沖洗管腔以去除其內(nèi)殘留血液，氣體排凈PBS液。將0.1% I型膠原酶10mL注入管腔內(nèi)，關(guān)閉三通管后將臍帶置入廣口瓶中，37℃細胞孵箱內(nèi)消化。15min后取出臍帶，收集消化液1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，新鮮培養(yǎng)液重懸細胞于50mL一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。倒置顯微鏡每天觀察細胞生長情況，兩天更換一次培養(yǎng)液，細胞鋪滿瓶底約90%時進行1:2傳代。

1.2.2 HUVECs的鑒定 取第3代HUVECs以1×105/孔的密度接種于鋪有多聚賴氨酸(PLL)溶液包被的蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，待細胞爬片后以預(yù)冷的丙酮酸溶液固定，3%牛血清蛋白(BSA)封閉。將抗CD34抗體按梯度稀釋為1:50、1:100、1:150和1:200四個濃度，分別滴加到蓋玻片上，以PBS為對照，置于載玻片上4 ℃孵育過夜。將帶有FITC標記的2抗稀釋1500倍,滴加到蓋玻片上，37℃避光濕盒中孵育1h。DAPI顯色15min，防淬滅封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 MDA-MB-231乳腺癌細胞與HUVECs共培養(yǎng) 將人HUVECs按細胞密度5×104/孔接種于六孔板，在培養(yǎng)箱中孵育12h使細胞貼壁，然后將接種有5×104/孔密度人乳腺癌細胞MDA-MB-231的Millicell小室放入六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)3d后收獲六孔板內(nèi)的目標細胞。

1.2.4 Td-VECs的鑒定 ①PCR引物的設(shè)計，美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)檢索人腫瘤血管內(nèi)皮標志物Tem1、Tem8和人actin蛋白的基因序列，設(shè)計PCR引物如下：Tem1: LEFT PRIMER:983 21 61.11 52.38 4.00 1.00 actacgttggtggcttcgagt，RIGHT PRIMER:1271 23 59.79 52.17 2.00 1.00 tagggtatctgtggctctctgtc；Tem8: LEFT PRIMER:1183 21 62.20 52.38 3.00 0.00 gaggttcgttggggagaaaag，RIGHT PRIMER:950 21 61.70 52.38 4.00 2.00 atctccttctgcatcctgtcg；actin: LEFT PRIMER:357 22 60.76 50.00 4.00 2.00 gacccagatcatgtttgagacc，RIGHT PRIMER:950 21 61.70 52.38 4.00 2.00 atctccttctgcatcctgtcg。交由Takara(大連)生物工程有限公司合成。②Td-VECs總RNA提取，取六孔板中生長良好的細胞，加入1 mL Trizol溶液，機械吹打，充分裂解，離心管內(nèi)室溫放置5min。加入0.2 mL氯仿，劇烈搖動15s，室溫放置3min。4℃下，12000轉(zhuǎn)/分離心15min，吸取上層無色水相至新的離心管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫沉淀10min。4℃下，12000轉(zhuǎn)/分離心10min，棄上清。加入1 mL DEPC水配制的75%乙醇，顛倒混勻，4℃下，7500轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清。加入20uL DEPC水溶解后取少許在核酸儀上測量核酸的含量。③Td-VECs的聚合酶鏈反應(yīng)，雙蒸水溶解合成的Tem1、Tem8和actin引物，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)試劑盒的操作說明配制成25uL的反應(yīng)體系。設(shè)置程序，將Tem1、Tem8和actin的退火溫度分別設(shè)為53 ℃、51 ℃和52 ℃，循環(huán)數(shù)定為30個。將合成的DNA產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠加樣孔中電泳，1h后置于紫外燈下看結(jié)果。

1.2.5 Td-VECs免疫熒光染色 誘導后的VECs經(jīng)預(yù)冷丙酮溶液固定15min后BSA封閉30min，將抗CD105抗體按梯度稀釋為1:50、1:100、1:150和1:200四個濃度，分別滴加到蓋玻片上，以PBS為對照，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。將帶FITC標記的二抗稀釋1500倍滴加到蓋玻片上，避光濕盒中37℃孵育1h，DAPI顯色15min， PBS清洗后防淬滅封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，以未誘導的VECs對比，了解CD105表達的程度是否有差異。

1.2.6 靶向CD105納米粒細胞標記 取經(jīng)MDA-MB-231細胞誘導后處于對數(shù)生長期的VECs。以1x105/孔的密度接種于鋪有PLL溶液包被的蓋玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)待細胞爬片。分別以鐵濃度為0、0.5、1、2、5 、10ug/mL向誘導后的VECs內(nèi)加入靶向CD105的CL-PEG-MnFe2O4納米粒(為靶向CD105結(jié)合肽的磁性納米粒，已在另文中詳述[4])，每個濃度設(shè)3個復孔。孵育24h后固定，常規(guī)普魯士藍染色，倒置顯微鏡下觀察、攝片，任意取30個視野行陽性細胞計數(shù)，計算細胞標記陽性率：標記陽性率=視野內(nèi)陽性細胞數(shù)/視野內(nèi)細胞總數(shù) ×100%。以未誘導VECs為對照。實驗中注意避光操作。

2 結(jié)果

2.1 HUVECs的分離、培養(yǎng)和鑒定 從臍帶取材到完成細胞分離整個過程大致需要2h。原代細胞培養(yǎng)12h后可見細胞貼壁；48h細胞鋪滿瓶底約30%，呈梭形或小圓形，細胞漿、細胞核顯示清晰；4d后觀察，細胞呈梭形，貼壁生長，鋪滿瓶底約60～70%，呈“鋪路石”樣改變；6d后，細胞鋪滿瓶底約90%，部分區(qū)域呈簇狀生長，出現(xiàn)細胞重疊，進行第一次傳代(見圖1)。此后3d進行一次細胞傳代。細胞CD34免疫熒光染色(見圖2)，可見細胞呈CD34陽性，胞膜呈綠色熒光，胞核呈藍色熒光，而PBS對照只見藍色胞核，未見綠色熒光的細胞膜。

圖1 不同時段分離細胞的培養(yǎng)(×200)Figure 1 Culture of isolated cells at different time periods

圖2 分離細胞的CD34免疫熒光染色Figure 2 CD34 immunofluorescence staining of isolated cells注： a、b. 為CD34標記細胞; c. 為PBS對照

2.2 Td-VECs的培養(yǎng)和CD105靶向能力鑒定 誘導后VECs總RNA的RT-PCR反應(yīng)顯示，所獲得的DNA產(chǎn)物大小分別為594 bp、289 bp和321 bp，符合actin、Tem1和Tem8的DNA鏈長，電泳結(jié)果顯示誘導細胞的Tem1和Tem8表達量明顯增高(見圖3)，具有Td-VECs的特性。Td-VECs的CD105免疫熒光染色(見圖4)，呈CD105陽性，細胞膜見紅色熒光，胞核呈藍色熒光，而PBS對照組只見胞核藍色熒光，未見紅色熒光的細胞膜，且誘導后的VECs熒光強度強于未誘導的內(nèi)皮細胞。在鐵濃度為0、0.5、1、2、5 、10ug/mL時，共同孵育24h后，誘導后和未誘導的VECs的標記率分別為0%、(25.35±4.23)%、(58.07±4.12)%、(86.68±3.42)%、100%、100%和0%、(10.58±2.62)%、(16.31±4.32)%、(46.33±3.42)%、(77.62±4.13)%、100%，誘導后細胞與靶向CD105納米粒的結(jié)合力明顯強于未誘導細胞，見圖5。

3 討論

血管內(nèi)皮細胞為內(nèi)襯在血管腔面的單層細胞。除在肺部幫助進行氣體交換外，血管內(nèi)皮細胞更多的是在受體的存在下調(diào)節(jié)血細胞及多種生物活性分子(如：凝血蛋白、生長因子、脂蛋白和激素等)的量。此外，內(nèi)皮細胞在很多生理過程中也起著重要作用：通過促血栓形成因子和抗血栓形成因子的表達調(diào)節(jié)止血；與內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)和平滑肌的協(xié)同來調(diào)節(jié)血管緊張素酶-I的轉(zhuǎn)化、血管活性胺的代謝及緩激肽的降解；內(nèi)皮細胞還借助表面抗原、細胞因子和粘附分子的合成參與炎癥及免疫應(yīng)答的過程[5,6]。

盡管臍靜脈內(nèi)皮細胞并不能確切代表人體各個器官、不同類型內(nèi)皮細胞的生理、代謝及毒性反應(yīng)過程，但由于取材方便，分離、培養(yǎng)方法簡單，且一次性獲取細胞量大，依然是目前應(yīng)用最廣泛的內(nèi)皮細胞模型。參考Jaffe等[7]的內(nèi)皮細胞分離方法，我們將取材到內(nèi)皮細胞分離完成的整個過程縮短到2h，不僅提高效率，同時也最大限度的保護內(nèi)皮細胞不受損傷。諸如CD31、CD34、CD54、CD106、血管緊張素、細胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)、血管粘附分子-1(VCAM-1)、Ⅷ因子等均為內(nèi)皮細胞標志物，其中，CD31、CD34的是目前最常用的內(nèi)皮細胞標志物[8]。我們的結(jié)果顯示：第3代細胞CD34免疫熒光染色呈CD34陽性，說明所獲得的細胞為HUVECs。

圖3 誘導后VECs的PCRFigure 3 PCR after induction of VECs

圖4 血管內(nèi)皮細胞的免疫熒光染色Figure 4 Immunofluorescence staining of vascular endothelial cells 注：a、b. 誘導后VECs的CD105染色; c. 未誘導的VECs的CD105染色; d.誘導后VECs的PBS對照

圖5 鐵濃度為5ug/mL的CL-PEG-MnFe2O4標記細胞的普魯士藍染色(×200)Figure 5 Prussian blue staining of CL PEG MnFe 2O4 labeled cells with iron concentration of 5ug/mL注： a、b. 分別為誘導后及未誘導VECs; c.為誘導后VECs的PBS對照

細胞數(shù)量的擴增可以通過傳代培養(yǎng)來實現(xiàn)，但細胞會隨著傳代次數(shù)的增加而加速衰老和自發(fā)性的凋亡，從而使很多蛋白(如：前列環(huán)素和血管緊張素I等)的表達逐漸減少，通常，應(yīng)選擇第3-4代細胞進行下一步實驗[9]。同時，在細胞培養(yǎng)的過程中所添加的外源性生長因子及其代謝產(chǎn)物也可能會改變細胞蛋白的合成和轉(zhuǎn)運[10]。因而，為最大限度的模擬內(nèi)皮細胞特性，在細胞培養(yǎng)過程中，應(yīng)盡可能選用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基，且在培養(yǎng)過程中盡量避免添加任何促細胞生長因子。

由于從腫瘤組織中分離Td-VECs操作難度大，且分離細胞數(shù)量少、培養(yǎng)困難，因而學者們多采用HUVECs替代以解決Td-VECs難以獲得的問題。研究表明[11]：由腫瘤細胞自分泌和(或)旁分泌的血管因子，可刺激血管內(nèi)皮細胞向Td-VECs分化，誘導內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔生成。Khodarev[12]利用transwell小室將HUVECs和U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞進行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示：HUVECs在形態(tài)、表型及功能變化等方面具有了Td-VECs的特性。同樣，Mikhaylova等采用millicell小室成功誘導人真皮淋巴管內(nèi)皮細胞(HDLECs)向乳腺癌淋巴管內(nèi)皮細胞分化[13]。因而，為了模擬Td-VECs生長的內(nèi)環(huán)境，我們采用了膜孔徑為0.4微米的millicell小室建立了內(nèi)皮細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)模型，小室內(nèi)的內(nèi)皮細胞不能透過微孔膜，而下室腫瘤細胞分泌的細胞因子能夠通過微孔膜進入上層Millicell小室內(nèi)，從而模擬形成腫瘤內(nèi)皮細胞生長環(huán)境。經(jīng)誘導后內(nèi)皮細胞總RNA的RT-PCR反應(yīng)及DNA電泳結(jié)果顯示：誘導后內(nèi)皮細胞的Tem1和Tem8表達量明顯增高，由于Tem1和Tem8僅在腫瘤血管內(nèi)皮細胞上表達，說明誘導后的血管內(nèi)皮細胞具有Td-VECs的特性。

CD105是內(nèi)皮細胞膜上的一種糖蛋白，在處于增殖狀態(tài)的腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞過表達，且CD105的表達水平與內(nèi)皮細胞的增殖程度密切相關(guān)，基于CD105染色的腫瘤微血管密度與腫瘤的預(yù)后高度相關(guān)[14]。因而，可以將CD105作為分子靶標用于檢測所誘導血管內(nèi)皮細胞的Td-VECs特性。結(jié)果顯示誘導后的VECs熒光強度強于未誘導的內(nèi)皮細胞。并且靶向CD105納米粒與誘導后細胞標記率也明顯高于未誘導細胞，表明所獲得的細胞不僅具有Td-VECs的分子特性，并且具有很好的CD105靶向結(jié)合力。

4 結(jié)論

腫瘤細胞共培養(yǎng)法可誘導VECs向Td-VECs分化，是獲取基于CD105分子靶向研究的Td-VECs可靠方法，可為進一步靶向抗腫瘤血管生成治療研究提供可靠的細胞基礎(chǔ)。

【參考文獻】

[1]Zhang WJ, Wu LQ, Ye LY,etal. Immunologic characteristics of tumor-derived vascular endothelial cells [J]. Ai Zheng, 2005, 24(5):634-638.

[2]Rape A, Ananthanarayanan B, Kumar S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2014, 79(80):172-183.

[3]Avci NG, Fan Y, Dragomir A,etal. Investigating the Influence of HUVECs in the Formation of Glioblastoma Spheroids in High-Throughput Three-Dimensional Microwells [J]. IEEE Trans Nanobioscience, 2015, 14(7):790-796.

[4]楊華,龔明福,鄒利光,等.靶向Endoglin的CL-PEG-MnFe2O4探針構(gòu)建及體外實驗 [J].中國醫(yī)學物理學雜志, 2016, 33(7):751-756.

[5]Mou Y, Yue Z, Zhang H,etal. High quality in vitro expansion of human endothelial progenitor cells of human umbilical veinorigin [J]. Int J Med Sci, 2017, 14(3):294-301.

[6]Baudin B, Bruneel A, Bosselut N,etal. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells [J]. Nature protocols, 2007, 2(3): 481-485.

[7]Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG,etal. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria [J]. Journal of Clinical Investigation, 1973, 52(11): 2745.

[8]Liu X, Wang J, Dong F,etal. Human gingival fibroblasts induced and differentiated into vascular endothelial-like cells [J]. Dev Growth Differ, 2016, 58(9):702-713.

[9]Johnson A, Dipietro LA. Apoptosis and angiogenesis: an evolving mechanism for fibrosis [J]. FASEB J, 2013, 27(10):3893-3901.

[10] Siow RC. Culture of human endothelial cells from umbilical veins [J]. Methods Mol Biol, 2012, 806:265-274.

[11] Morin KT, Dries-Devlin JL, Tranquillo RT. Engineered microvessels with strong alignment and high lumen density via cell-induced fibrin gel compaction and interstitial flow [J]. Tissue Eng Part A, 2014, 20(3-4):553-565.

[12] Khodarev NN, Yu J, Labay E,etal. Tumour-endothelium interactions in co-culture: coordinated changes of gene expression profiles and phenotypic properties of endothelial cells [J]. Journal of cell science, 2003, 116(6): 1013-1022.

[13] Mikhaylova M, Mori N, Wildes FB,etal. Hypoxia increases breast cancer cell-induced lymphatic endothelial cell migration [J]. Neoplasia, 2008, 10(4): 380-389.

[14] 楊華,鄒利光. Endoglin (CD105) 在腫瘤新生血管靶向診斷及治療中的應(yīng)用[J]. 臨床腫瘤學雜志, 2011, 16(12): 1130-1132.