成 果，黃 羽，楊 瑩，謝林君，黃小云，余 歡，謝太理，周詠梅，張 勁*

（廣西農業(yè)科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧 530007）

花色苷類物質是葡萄果實和葡萄酒的主要呈色物質，在很大程度上決定著葡萄果實和葡萄酒的品質[1]。葡萄的遺傳背景是品種花色苷組分的決定因素。因此，花色苷的組成和含量常被用作鑒定不同品種葡萄果實和葡萄酒的‘指紋’[2]。歐亞種（Vitis vinifera）葡萄和葡萄酒僅含有花色素單糖苷[2-3]，而美洲種（V. labrusca）、東亞種群的毛葡萄（V. quinquangularis）和刺葡萄（V. davidii）及其葡萄酒不僅含有花色素單糖苷也含有雙糖苷[2,4]。

‘桂葡6號’是經馴化篩選出的豐產、抗病性好的釀造葡萄品種，源于廣西地區(qū)收集的野生資源，2015年經審定后命名。在南寧地區(qū)避雨栽培條件下，‘桂葡6號’第1茬果萌芽期3月上旬至中旬，開花期4月上旬，果實成熟期7月上、中旬，從萌芽至漿果成熟120 d左右；第2茬果萌芽期9月上旬，開花期10月上旬，果實成熟期12月下旬，從萌芽至漿果成熟120 d左右，屬中、晚熟品種。該品種抗葡萄黑痘病、霜霉病和白粉病的能力較強，花芽分化優(yōu)良，豐產性能強。在南方地區(qū)，棚、籬架栽培均可，露地和避雨栽培均可，但避雨栽培效果更好。‘桂葡6號’冬果釀酒品質優(yōu)良，可溶性固形物可達18%以上，果實中酚類物質含量較高[5-6]，是廣西當地頗具潛力的釀酒品種。近年來，‘桂葡6號’種苗在廣西地區(qū)陸續(xù)得到推廣。今后將在廣西葡萄及葡萄酒產業(yè)布局中占據重要地位，是實現當地農民脫貧致富、推動地區(qū)經濟發(fā)展的重要農業(yè)資源。

‘桂葡6號’釀造的葡萄酒酒體呈寶石紅色，澄清透明，果香醇正，酒體平衡，余味綿長。目前，已經對‘桂葡6號’果實發(fā)育過程中花色苷成分、含量變化以及相關基因表達規(guī)律進行了研究[6]。然而‘桂葡6號’葡萄酒的花色苷組分特征仍不清楚。本研究采用高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用技術測定乙醇發(fā)酵結束和瓶儲3 個月的‘桂葡6號’葡萄酒中花色苷成分及其含量的變化，并與歐亞種葡萄‘赤霞珠’進行對比，進一步完善‘桂葡6號’品質評價體系，為打造具有地方特色的葡萄酒品牌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗地位于廣西農業(yè)科院葡萄與葡萄酒研究所科研基地（22°50′59′ N，108°14′35′ E）。供試葡萄（Vitis L.）品種為2014年定植的‘桂葡6號’（Vitis sp.）和2007年定植的‘赤霞珠’（Vitis vinifera L.），2 個品種的整形方式分別為一字型和單干雙臂型，栽植密度2.5 m×1.5 m，南北行向，一年兩收模式下避雨栽培，灌溉方式均為滴灌。2 個葡萄品種冬果達到技術成熟度（糖酸比≥20）時進行人工采收。

二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標準品 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、甲酸和乙腈（均為色譜級） 美國Fisher公司；Lalvin 71B活性干酵母 法國Lallemand公司。

1.2 儀器與設備

UV-1801紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；5804R低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司；R206 1100系列液相色譜-離子阱質譜聯用儀（包括G1379A真空溶劑脫氣機、G1311A四元高壓梯度泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器和Zorbax SB C18柱） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 單品種釀酒實驗

于2015年12月16日人工采收葡萄，除梗破碎后入罐，每個品種3 罐（20 L/罐）作為3 次重復。隨后每罐按照20 g/t和30 mg/L的劑量加入果膠酶和H2SO3（在葡萄醪中加糖，預設葡萄酒乙醇體積分數為12.5%）。放置在15 ℃恒溫冷庫中，24 h后按照200 mg/L劑量加入Lalvin 71B活性干酵母。乙醇發(fā)酵過程控制在25 ℃直到殘?zhí)切∮? g/L。每天進行壓帽、測定溫度和比重。乙醇發(fā)酵結束后取樣，測定酒樣基本理化指標，包括：乙醇體積分數、殘?zhí)牵ㄒ云咸烟怯嫞?、總酸（以酒石酸計）、揮發(fā)酸、單寧、總酚和pH值，檢測方法參照《葡萄與葡萄酒實驗技術操作規(guī)范》[7]，其余樣品放－20 ℃保存待測。CIELab法測定酒樣色度色調。CIELab參數（L*、a*、b*、C*、H*）利用1 mm光程條件下440、530 nm和600 nm酒樣吸光度計算[8]。乙醇發(fā)酵結束后每個品種3 次重復酒樣分別裝瓶放置在15 ℃保存，瓶儲3 個月后取樣，－20 ℃保存待測。

1.3.2 葡萄酒中花色苷類物質的檢測

參照文獻[9]方法測定。采用Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器的LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質譜聯用儀進行樣品定性定量分析。系統(tǒng)檢測包括電噴霧離子源和離子阱質譜檢測器。所有部件由安捷倫v.5.2化學工作站控制完成檢測。HPLC條件：Zorbax Eclipse SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：含2%甲酸-6%乙腈溶液，流動相B：含2%甲酸-54%乙腈溶液。洗脫程序：1～18 min，10%～25% B；18～20 min，25% B；20～30 min，25%～40% B；30～35 min，40%～70% B；35～40 min，70%～100% B。流速1.0 mL/min；柱溫50 ℃；檢測波長525 nm；波長掃描范圍200～900 nm；進樣量30 μL。MS條件：電噴霧離子源，正離子模式；霧化器壓力35 psi；干燥氣流速12 L/min；干燥氣溫度300 ℃；質量掃描范圍m/z 100～1 500。每個樣品重復進樣3 次。

1.3.3 葡萄酒中花色苷類物質的定性與定量

花色苷定性工作對照中國農業(yè)大學葡萄酒研究中心建立的“葡萄與葡萄酒花色苷HPLC-UV-MS指紋譜庫”完成[9]。建立5～500 mg/L之間、9 個水平、3 個重復的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標準曲線，相關系數在0.999以上，其他花色苷以相當于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計。

1.4 數據處理

利用獨立樣本t檢驗在P值小于0.05水平下進行顯著性分析。利用主成分分析（principal component analysis，PCA）更加直觀反映2 個品種酒樣花色苷組成及含量差異。PCA和數據處理采用SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago,IL, USA）。聚類分析利用MetaboAnalyst 3.0進行。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒基本化學指標與顏色參數

表1 ‘桂葡6號’和‘赤霞珠’葡萄酒化學指標與CIELab參數Table 1 Chemical indicators and CIELab color parameters of ‘Guipu 6’and Cabernet Sauvignon wines

如表1所示，‘桂葡6號’葡萄酒乙醇體積分數、揮發(fā)酸、單寧含量和pH值顯著低于‘赤霞珠’，而殘?zhí)?、可滴定酸和總酚含量顯著高于‘赤霞珠’。與乙醇發(fā)酵結束‘赤霞珠’酒樣相比，‘桂葡6號’葡萄酒紅-綠色調值（a*）和色度值（C*）顯著增強，亮度值（L*）無顯著差異，而黃-藍色調值（b*）和色調角值（H*）顯著減弱。結果表明，‘桂葡6號’葡萄酒的顏色更深、紅色色調和藍色色調更強。

2.2 葡萄酒中花色苷類物質檢測

表2 ‘桂葡6號’和‘赤霞珠’乙醇發(fā)酵結束和瓶儲3 個月葡萄酒中花色苷HPLC-MS的分子離子與碎片離子信息Table 2 Molecular ions and fragment ions of anthocyanins in ‘Guipu 6’and Cabernet Sauvignon wines

續(xù)表2

如表2所示，乙醇發(fā)酵結束‘桂葡6號’葡萄酒中共檢測到25 種花色苷，而‘赤霞珠’葡萄酒中檢測到16 種。另外，瓶儲3 個月之后的‘桂葡6號’和‘赤霞珠’葡萄酒中的花色苷組成與乙醇發(fā)酵結束相比發(fā)生變化。‘桂葡6號’葡萄酒中共檢測到19 種花色苷，而‘赤霞珠’葡萄酒中檢測到17 種。與‘赤霞珠’相比，‘桂葡6號’酒樣中未檢測到：花翠素-3-O-（6-O-乙酰化）-單糖苷、二甲花翠素-3-O-單糖苷-丙酮酸、花青素-3-O-（6-O-乙?；?單糖苷、二甲花翠素-3-O-（6-O-乙?；?單糖苷-丙酮酸、二甲花翠素-3-O-（6-O-乙?；?單糖苷-乙醛、二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆?；?單糖苷-丙酮酸、二甲花翠素-3-O-（6-O-咖啡?；?單糖苷、甲基花翠素-3-O-（順式-6-O-香豆?；?單糖苷、二甲花翠素-3-O-（反式-6-O-香豆?；?單糖苷、二甲花翠素-3-O-單糖苷-4-乙烯基苯酚。由此可見，2 個單品種酒花色苷組成差異明顯，與歐亞種‘赤霞珠’相比，野生資源‘桂葡6號’花色苷種類多，但缺乏?；惢ù渌貑翁擒占氨峄?、乙醛化及乙烯基酚化的吡喃型花色苷。

2 個品種酒樣自乙醇發(fā)酵結束到瓶儲3 個月后，花色苷的組成發(fā)生變化。與乙醇發(fā)酵結束酒樣相比，瓶儲3 個月的‘桂葡6號’酒樣中未檢測到：花青素-3,5-O-雙糖苷、花翠素-3-O-（6-O-香豆?；?雙糖苷、甲基花青素-3-O-（反式-6-O-香豆?；?雙糖苷、花青素-3-O-（6-O-香豆?；?單糖苷和甲基花翠素-3-O-（反式-6-O-香豆?；?單糖苷和二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆?；?單糖苷-乙醛。與乙醇發(fā)酵結束酒樣相比，瓶儲3 個月的‘赤霞珠’酒樣中測到更多的吡喃型花色苷。

2.3 葡萄酒中花色苷聚類分析

為更加清晰探究‘桂葡6號’葡萄酒花色苷組分特征，利用乙醇發(fā)酵結束和瓶儲3 個月酒樣中各類花色苷含量進行K-means聚類分析，如圖1所示。乙醇發(fā)酵結束和瓶儲3 個月的‘桂葡6號’酒樣中含量最高的花色苷是甲基花青素-3,5-O-雙糖苷。與2 個時期‘赤霞珠’酒樣的比較結果不同，‘桂葡6號’乙醇發(fā)酵結束酒樣中的大多數花色苷含量高于瓶儲3 個月酒樣，其中P27甲基花青素-3-O-（反式-6-O-香豆?；?雙糖苷、P26甲基花青素-3-O-（反式-6-O-香豆?；?雙糖苷、P33二甲花翠素-3-O-（順式-6-O-香豆?；?單糖苷、P23甲基花青素-3-O-（順式-6-O-香豆?；?單糖苷、P2花青素-3,5-O-雙糖苷、P22花翠素-3-O-（反式-6-O-香豆酰化）-單糖苷含量降低幅度明顯?！鹌?號’瓶儲3 個月酒樣中，P1花翠素-3,5-O-雙糖苷、P9二甲花翠素-3-O-單糖苷、P17甲基花翠素-3-O-（6-O-乙?；?單糖苷含量高于乙醇發(fā)酵結束酒樣。除P31二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆?；?單糖苷-乙醛以外，‘赤霞珠’瓶儲3 個月酒樣中吡喃型花色苷種類和含量較乙醇發(fā)酵結束時均增加。

圖1 ‘桂葡6號’和‘赤霞珠’葡萄酒中各類花色苷含量聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of anthocyanins in ‘Guipu 6’ and Cabernet Sauvignon wines

2.4 葡萄酒中花色苷PCA

圖2 ‘桂葡6號’和‘赤霞珠’葡萄酒中花色苷PCAFig. 2 Principal component analysis of total and individual anthocyanins in ‘Guipu 6’ and Cabernet Sauvignon wines

利用乙醇發(fā)酵結束和瓶儲3 個月‘桂葡6號’和‘赤霞珠’酒樣中花色苷總量及各花色苷含量進行PCA，以期更好區(qū)分品種間差異。如圖2所示，PC1解釋了總變量的47.69%，‘桂葡6號’全都位于X軸的正半軸，‘赤霞珠’則位于X軸負半軸。PC1能夠將不同時期2 個品種的酒樣區(qū)分開。PC2解釋了總變量的23.64%，瓶儲3 個月的‘赤霞珠’和乙醇發(fā)酵結束的‘桂葡6號’酒樣位于Y軸正半軸，而瓶儲3 個月的‘桂葡6號’和乙醇發(fā)酵結束的‘赤霞珠’酒樣位于Y軸負半軸?！鹌?號’2 個時期酒樣花色苷組分和含量間的差異小于‘赤霞珠’。

表3 不同酒樣中各修飾類型花色苷所占總量比例及花色苷總量Table 3 Proportions of different modified anthocyanins and total anthocyanin contents in different wine samples

如表3所示，‘桂葡6號’酒樣中花色苷總量顯著高于同期‘赤霞珠’?！嘞贾椤茦又袃H檢測到單糖苷，瓶儲3 個月‘桂葡6號’酒樣中雙糖苷比例增加單糖苷比例顯著降低。瓶儲3 個月‘桂葡6號’酒樣中3’,5’-羥基取代花色苷比例較乙醇發(fā)酵結束時增加，而‘赤霞珠’瓶儲3 個月后該類花色苷比例則顯著降低。另外，‘赤霞珠’酒樣中乙酰化、香豆?；?、甲基化和吡喃型花色苷比例顯著高于同期‘桂葡6號’。與乙醇發(fā)酵結束酒樣相比，瓶儲3 個月‘桂葡6號’中香豆?；⒓谆瓦拎突ㄉ毡壤档?。

3 討論與結論

不同種、相同種的不同品種葡萄酒之間花色苷的種類及含量差異很大[10-11]，相同品種葡萄酒的花色苷組分受到年份、產區(qū)、釀造工藝等因素的影響[12-15]。張軍翔等[10]建立了9 個不同釀造品種葡萄酒的花色苷HPLC指紋圖譜數據庫，使不同種/品種能夠很好地區(qū)分。González-Neves等[16]研究‘丹娜’、‘赤霞珠’和‘美樂’3 個品種葡萄酒花色苷組分差異，結果發(fā)現葡萄酒中花色苷的組成與葡萄果實類似，且受到年份影響。二甲花翠素-3,5-O-雙糖苷是山葡萄花色苷的主要成分，有無花色素雙糖苷是歐亞種葡萄和其他葡萄之間最重要的區(qū)別之一[11]。圓葉葡萄（V. rotundifolia）僅含有5 種花色素的雙糖苷[17]。Li Jinchen等[18]對山歐雜種‘北冰紅’葡萄酒酚類物質組成特點的研究結果表明，二甲花翠素-3,5-O-雙糖苷是含量最高的一類花色苷。本研究中，利用酒樣中不同類型花色苷組成及含量能夠很好地區(qū)分2 個品種，這說明‘桂葡6號’酒樣花色苷組成與歐亞種‘赤霞珠’差異較大。‘桂葡6號’乙醇發(fā)酵結束和瓶儲3 個月酒樣中雙糖苷比例大于50%，含量最高的花色苷是甲基花青素-3,5-O-雙糖苷，這說明雙糖苷是該品種主要的花色苷類型，與葡萄果實中的研究結果一致[6]。

葡萄酒的花色苷含量取決于葡萄漿果中的花色苷含量和釀造工藝。與此同時，花色苷在發(fā)酵過程中會被葡萄皮渣吸附隨之和酒石酸鹽而沉淀。葡萄酒中花色苷含量的降低主要因為氧化和水解[15]。雙糖苷比同類型的單糖苷穩(wěn)定，但顏色淺[19]。本研究中，‘桂葡6號’酒樣中花色苷總量顯著高于‘赤霞珠’，符合我國野生葡萄資源花色苷含量普遍高于歐亞種釀酒品種的特征[20]。2 個品種乙醇發(fā)酵結束酒樣花色苷含量均高于瓶儲3 個月，但‘赤霞珠’的降低幅度大于‘桂葡6號’，這與‘桂葡6號’中含有較多的花色素雙糖苷有關。

王宏等[8]的研究結果表明，花色苷是影響葡萄酒顏色最重要的因素之一，花色苷總量與色度值（C*）及紅-綠色調值（a*）呈正相關關系。本研究中，與乙醇發(fā)酵結束‘赤霞珠’酒樣相比，‘桂葡6號’葡萄酒紅-綠色調值（a*）和色度值（C*）顯著增加，這與其花色苷總量較高有關。‘桂葡6號’葡萄酒色調角值（H*）顯著低于同期‘赤霞珠’，這與其他研究結果中紅-綠色調值（a*）與色調角值（H*）存在的負相關關系結果一致[8]。

在酸性條件下，花色苷的顏色在很大程度上取決于B環(huán)上的取代基，羥基增加導致顏色變紅，甲氧基增加導致顏色變紫，穩(wěn)定性增加[21]。3’,5’-羥基取代花色苷包括：花翠素、甲基花翠素、二甲花翠素以及它們的衍生物；3’-羥基取代花色苷包括：花青素、甲基花青素以及他們的衍生物[22]。類黃酮結構骨架中B環(huán)經過甲基化取代會降低酚羥基的化學活性，在結構上更加穩(wěn)定，甲基化花色苷主要包括：甲基花青素、甲基花翠素和二甲花翠素[23]。本研究中，乙醇發(fā)酵結束‘桂葡6號’酒樣中3′,5′-羥基取代花色苷比例顯著低于‘赤霞珠’，而瓶儲3 個月之后該類花色苷比例顯著高于‘赤霞珠’，這對于‘桂葡6號’葡萄酒顏色的穩(wěn)定起到積極作用。另外，瓶儲3 個月2 個品種酒樣甲基化花色苷比例均低于乙醇發(fā)酵結束，這說明在瓶儲過程中葡萄酒紫色色調變弱，花色苷穩(wěn)定性降低?；ㄉ盏孽；绞街饕譃橐阴；腿夤瘐；òㄏ愣辊；涂Х弱；?，花色苷經酰基化修飾可增加其在酸性和中性條件下的穩(wěn)定性[9]。與‘赤霞珠’相比，‘桂葡6號’葡萄酒中缺乏5 種?；惖膯翁擒?，且‘桂葡6號’酒樣中的酰基化花色苷比例顯著低于‘赤霞珠’。這與‘桂葡6號’果實中?；ㄉ盏谋壤^低有關[6]。有報道指出，通過控制產量，調節(jié)成熟期果實的曝光程度能夠改變葡萄及葡萄酒中?；ㄉ张c不同程度?；ㄉ盏谋壤齕24-26]。因此，通過栽培手段改變‘桂葡6號’果皮中酰化花色苷比例，對于研究葡萄酒顏色的穩(wěn)定性提升具有重要意義。

吡喃花色苷是葡萄酒中重要呈色物質中的一種新型花色苷衍生物，它的基本結構是在原花色苷結構的基礎上，在花色苷的C4位與C5位的羥基之間經環(huán)加合反應形成另外的第4個吡喃環(huán)[27-28]。葡萄酒發(fā)酵過程中檢測到的吡喃型花色苷一般是由花色苷單體與丙酮酸（屬于Vitisin A類吡喃花色苷）、乙醛（屬于Vitisin B類吡喃花色苷）、乙烯基苯酚（屬于Vitisin C類吡喃花色苷）和乙烯基-黃烷醇反應生成[29]。與單體花色苷相比，吡喃型花色苷能夠更好適應pH值變化和抵御亞硫酸鹽的褪色效應[29]。與‘赤霞珠’相比，‘桂葡6號’葡萄酒中缺乏5 種吡喃型花色苷，且‘桂葡6號’酒樣中的吡喃型花色苷比例顯著低于‘赤霞珠’。這是由于‘桂葡6號’果實中雙糖苷比例較高，C4和C5位無法進行成環(huán)加合反應。

葡萄酒中的衍生色素（吡喃型花色苷、羥苯基吡喃型花色苷和花色苷-黃烷醇二聚體）對外界環(huán)境不如非衍生色素（直接從葡萄果實中提取的花色苷）那么敏感，所以它們對陳年的歐亞種葡萄酒色素穩(wěn)定性起著關鍵作用，而雙糖苷在葡萄酒中更容易發(fā)生褐變[30-31]。因此，今后研究添加不同類型的輔色劑對雙糖苷花色苷含量高而衍生色素含量低的‘桂葡6號’葡萄酒的色素穩(wěn)定性和陳年潛力的影響，對提升廣西葡萄酒品質具有重要意義。

‘桂葡6號’乙醇發(fā)酵結束和瓶儲3 個月酒樣中分別檢測到25 種和19 種花色苷，雙糖苷是其中最主要的花色苷類型，含量最高的是甲基花青素-3,5-O-雙葡萄糖苷。與歐亞種‘赤霞珠’相比，瓶儲3 個月‘桂葡6號’酒樣中3’,5’-羥基取代花色苷比例較高，而?；?、甲基化和吡喃型花色苷比例較低?！鹌?號’花色苷組成與歐亞種‘赤霞珠’差異明顯，這由其品種特性決定?！鹌?號’葡萄酒體色深，紅色和藍色色調強，酚類物質含量高，是廣西地區(qū)頗具發(fā)展?jié)摿Φ奶厣劸破贩N之一。

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