孫秋瑾，呂燕燕，韓云華，王彥榮

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

種皮的通透性可控制種胚與外界環(huán)境間水分、氣體和養(yǎng)分的交換，對(duì)種子的萌發(fā)、休眠和貯藏等具有重要的作用[1]。以往研究表明大多數(shù)植物種由于半透層的存在，胚包被物顯示出特殊的通透性[2]。半透層(semipermeable layer)是指種胚包被物中存在的一層具有半透性的組織，它允許種子內(nèi)外水分和氣體的自由交換，而限制或阻止某些溶質(zhì)的通透[3]。種皮一旦阻礙物質(zhì)的滲漏，基于滲漏差異的種子質(zhì)量測(cè)定方法將無(wú)法檢測(cè)出不同活力種子之間的差異。

Thornton[4]在測(cè)定種子生活力時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于半透層的存在,常用的四唑鹽測(cè)定法并不適用于西瓜(Citrulluslanatus)種子的測(cè)定。Beresniewicz等[3]對(duì)蔬菜種子種皮透性的研究表明，完整番茄(Lycopersiconesculentum)和辣椒(Capsicumannuum)種子種胚四唑鹽(TTC)染色率低，但刺破種皮后種胚四唑鹽染色率和氨基酸滲漏量均顯著增加，認(rèn)為種子半透層的存在限制了種皮對(duì)四唑鹽的吸收和氨基酸的滲漏，并且不同物種由于種子半透層的存在，種皮透性差異明顯，可根據(jù)半透性差異將其分為高透性、中透性和低透性3種類型。在種子活力測(cè)定研究中，Hill等[5]的研究表明具有完整種皮的老化和未老化萵苣(Lactucasativa)種子的電解液測(cè)定值之間無(wú)顯著差異，電導(dǎo)率法也不適用于甜瓜(Cucumismelo)[6]、辣椒[7]及大多數(shù)禾草如多年生黑麥草(Loliumperenne)[8]、雀麥(Bromusjaponicus)[9]和老芒麥(Elymussibiricus)[10]等種子活力水平的評(píng)價(jià)。2003年，王彥榮[11]研究發(fā)現(xiàn)蘇丹草(Sorghumsudanense)種皮存在半透層，該組織具有阻礙種子內(nèi)部電解質(zhì)外滲和四唑鹽滲入的作用，認(rèn)為半透層的存在可能是引起電導(dǎo)率法不適用于一些禾草種子活力測(cè)定的主要原因。然而迄今為止，關(guān)于禾本科牧草高丹草種子半透特性的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

高丹草(Sorghumbicolor×Sorghumsudanense)是高粱(Sorghumbicolor)與蘇丹草種間雜交產(chǎn)生的雜種類型。具有分蘗能力強(qiáng)，抗逆性高，適口性好等優(yōu)良特性，為綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的一年生禾本科飼料作物[12]。本研究以3個(gè)高丹草品種冀草2號(hào)，冀草8號(hào)和冀草008號(hào)種子為材料，研究高丹草種子是否存在半透層以及品種間種皮半透性差異，探討種子半透特性與種子活力測(cè)定的關(guān)系，為種子質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試高丹草品種為：冀草2號(hào)、冀草8號(hào)和冀草008號(hào)，由河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所李源副研究員提供。供試品種收獲于2015年，均貯藏于室溫條件下，初始質(zhì)量詳見(jiàn)表1。試驗(yàn)于2016年7月至2017年1月在蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(蘭州)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子老化處理 采用12 cm×12 cm×6.5 cm種子老化盒，盒內(nèi)加水250 mL，精確稱重后將種子放入盒內(nèi)支架上，種子距水面約2.5 cm，置于45 ℃，100%相對(duì)濕度(老化環(huán)境由預(yù)試驗(yàn)確定)培養(yǎng)箱老化。設(shè)置9個(gè)老化時(shí)間梯度，分別為24、36、48、60、72、84、96、108和120 h。嚴(yán)格按照老化后的相應(yīng)時(shí)間梯度取出種樣，室溫?cái)偭朗蛊浠謴?fù)原重。獲得不同質(zhì)量的種子用于如下發(fā)芽率和電導(dǎo)率試驗(yàn)。以未老化種樣為對(duì)照。

表1 供試種初始質(zhì)量Table 1 Primary quality of testing seeds

1.2.2吸水率測(cè)定 參照王彥榮等[13]的方法測(cè)定種子吸水率。每品種數(shù)取50粒種子，3次重復(fù)，將種子放在三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，置于20 ℃恒溫條件下，用稱重法測(cè)定種子在24 h內(nèi)的吸水量。種子吸水率以種子吸水量占種子初始重量的百分比表示。

1.2.3發(fā)芽率測(cè)定 參照《牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 2930.4-2001)[14]測(cè)定高丹草種子發(fā)芽率。選取均勻飽滿一致的種子50粒，設(shè)4次重復(fù)。采用紙上發(fā)芽法，放置光照培養(yǎng)箱中，在20 ℃/30 ℃變溫條件下培養(yǎng)。初次計(jì)數(shù)為第4天，末次計(jì)數(shù)為第10天，最終統(tǒng)計(jì)正常種苗數(shù)、不正常種苗數(shù)、新鮮未發(fā)芽種子數(shù)及死種子數(shù)。按以下公式計(jì)算種子發(fā)芽率：

發(fā)芽率=發(fā)芽終期全部正常種苗數(shù)/供試種子數(shù)×100%

1.2.4四唑鹽染色率的測(cè)定 隨機(jī)數(shù)取100粒種子，3次重復(fù)。將種子置于蒸餾水中30 ℃預(yù)浸泡3 h后取出。預(yù)濕后的種子參照《牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 2930.5-2001)[15]，用0.1%的氮紅四唑溶液(TTC)在35 ℃黑暗條件下染色1 h，然后在立體解剖鏡下進(jìn)行觀察鑒定，以胚完全染成紅色的種子確定為具有生活力的種子。染色結(jié)果分為重度染色、輕度染色和未染色。對(duì)各種樣用解剖針進(jìn)行刺破種皮處理，測(cè)定刺破種皮種子四唑鹽染色率，測(cè)定方法同完整種子。

1.2.5電導(dǎo)率測(cè)定 自未老化和老化84 h的種樣中隨機(jī)數(shù)取50粒種子，每種樣3次重復(fù)，精確稱重至0.01 g。將已知重量的種子倒入150 mL三角瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水100 mL，充分搖蕩，用保鮮膜封住瓶口，以僅盛100 mL蒸餾水的瓶子為對(duì)照。將各種樣置于20 ℃培養(yǎng)箱，24 h后取出在20 ℃條件下用DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀測(cè)定浸種液的電導(dǎo)率。根據(jù)ISTA活力測(cè)定方法[16]，按下式計(jì)算各種樣的電導(dǎo)率：

1.2.6熒光染色劑示蹤及觀察 參考Salanenka等[17]熒光染料處理種子的方法。隨機(jī)數(shù)取40粒種子，用熒光染料干粉包埋種子，避免水分接觸。處理過(guò)的種子置于濕沙中20 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，于胚根伸出前取出，用蒸餾水沖洗種子，濾紙吸干表面水分。將種子用雙面刀片沿胚縱切，用熒光體式顯微鏡(Leica MZ16FA)在藍(lán)光(495 nm)下進(jìn)行觀察并拍照，以未經(jīng)熒光染料處理的種子為對(duì)照。熒光染色劑理化性質(zhì)見(jiàn)表2。

表2 熒光染色劑理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of fluorescent tracers

1.2.7種子半透層X(jué)射線能量色散分析 參考Beresniewicz等[3]硝酸鑭示蹤和X射線能量色散分析的方法，隨機(jī)數(shù)取50粒種子，去稃，浸泡于雙蒸水中，20 ℃孵育24 h，去除表皮破裂的種子，將剩余種子于4%硝酸鑭溶液(去除CO2的雙蒸水配制)浸泡24 h，室溫晾干。用雙面刀片將種子沿胚縱切，用掃描電鏡(JSM5600LV，日本JEOL)結(jié)合X射線能量色散分析儀(EDAX，美國(guó)KEVE2)進(jìn)行鑭元素微區(qū)定點(diǎn)分析。

1.2.8種皮透性與種子質(zhì)量測(cè)定的關(guān)系 對(duì)各種樣進(jìn)行刺破種皮處理，依據(jù)1.2.5方法測(cè)定電導(dǎo)率值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel錄入數(shù)據(jù)，并作圖。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高丹草種子吸水率的變化

供試高丹草種子的吸水率均符合典型的吸水動(dòng)態(tài)曲線(圖1)。在0～6 h為種子吸脹階段，之后在最初吸脹的基礎(chǔ)上，進(jìn)入吸水滯緩期，16～24 h種子吸水率逐漸平穩(wěn)。24 h時(shí)種子吸水率達(dá)34.7%(冀草8號(hào))至42.2%(冀草2號(hào))，說(shuō)明高丹草種皮對(duì)水分的通透性良好。20～24 h種子胚根伸出，進(jìn)一步說(shuō)明高丹草種皮不影響水分和氣體的交換。

圖1 高丹草種子吸水率的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of imbibition rate of seeds for Sorghum bicolor×Sorghum sudanense

2.2 高丹草種子對(duì)四唑鹽的吸收

完整高丹草種子對(duì)四唑鹽的通透性較差，種胚重度染色率冀草2號(hào)為5%，冀草8號(hào)為0%，冀草008號(hào)為2%，其余種子輕度染色或未染色(表3)。刺破種皮處理后3個(gè)品種的高丹草種子種胚四唑鹽重度染色率均為100%，與完整種子差異顯著(P<0.01)。

表3 高丹草種子四唑鹽染色率Table 3 Percentage of seeds stained with TTC for Sorghum bicolor×Sorghum sudanense (%)

2.3 不同發(fā)芽率種子電導(dǎo)率的比較

圖2 不同發(fā)芽率種子電導(dǎo)率比較Fig.2 Comparison of electrical conductivity (EC) of Sorghum bicolor×Sorghum sudanense under different germination rates

老化84 h后獲得發(fā)芽率分別為23.0%(冀草2號(hào))，34.7%(冀草8號(hào))和35.3%(冀草008號(hào))的種子。結(jié)果顯示，高發(fā)芽率種子(未老化)與低發(fā)芽率種子的電導(dǎo)率值無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2)，如發(fā)芽率為92%(未老化)和23%(老化)的冀草2號(hào)種子電導(dǎo)率分別為11.93和11.70 μs·cm-1·g-1。表明高丹草種子浸泡液的電導(dǎo)率不隨種子生活力或活力的下降而改變。

2.4 高丹草種子對(duì)熒光化合物的吸收

熒光素鈉和鈣黃綠素均能滲透供試3種高丹草種皮(表4)。熒光素(綠色熒光)能滲透冀草2號(hào)高丹草種皮，進(jìn)入種子內(nèi)部被種胚所吸收，并在種胚部位檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)；卻被冀草8號(hào)和冀草008號(hào)高丹草種皮所阻擋，僅在種皮部位出現(xiàn)少量熒光(圖3)。

2.5 高丹草種子半透層的X射線能量色散分析

對(duì)照種子內(nèi)部主要含有C、O、K、Ca元素，無(wú)鑭元素(圖片未展示)。圖4A，B和C為經(jīng)硝酸鑭處理后高丹草種子微區(qū)元素的面分布， 種子內(nèi)部均含有La、C、O、K、Ca元素，其中C、O、K、Ca呈均勻分布。 圖4a， b和c分別為圖4A，B和C相對(duì)應(yīng)部位鑭元素的分布，由此(圖4a，b和c)可見(jiàn)，鑭元素(綠色)均呈條帶狀分布于高丹草種皮靠近胚乳處，未滲入到種子內(nèi)部。證明高丹草種子存在阻擋鑭鹽滲入的半透層結(jié)構(gòu)。

2.6 高丹草種子發(fā)芽率與電導(dǎo)率的相關(guān)性分析

完整高丹草種子發(fā)芽率與電導(dǎo)率相關(guān)性不顯著(P>0.05)(圖5)，相關(guān)系數(shù)冀草2號(hào)為0.103，冀草8號(hào)為-0.398，冀草008號(hào)為-0.036。刺破種皮處理后，3個(gè)品種的高丹草種子發(fā)芽率(x)與電導(dǎo)率值(y)均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，可用如下回歸方程表示：

表4 高丹草種子對(duì)熒光化合物的吸收Table 4 Seed coat permeability of Sorghum bicolor×Sorghum sudanense to applied fluorescent compounds

冀草2號(hào)：y=-0.1897x+41.76(r=-0.976**)

冀草8號(hào)：y=-0.29x+52.961(r=-0.951**)

冀草008號(hào)：y=-0.2378x+107.52(r=-0.902**)

圖3 高丹草種子對(duì)熒光素的吸收Fig.3 Uptake of fluorescein by seeds of Sorghum bicolor×Sorghum sudanense

圖4 鑭示蹤下高丹草種子縱切面微區(qū)元素面分布Fig.4 Surface distribution of elements in micro-area under lanthanum tracer

3 討論

圖5 高丹草種子發(fā)芽率與電導(dǎo)率的相關(guān)性 Fig.5 Correlation between germination and electrical conductivity for Sorghum bicolor×Sorghum sudanense

本研究對(duì)高丹草種皮通透性的測(cè)定結(jié)果表明，高丹草種皮不阻礙水分的吸收(圖1)，未老化種子均能正常發(fā)芽表明種皮也不限制氣體的通透，但具有阻礙四唑鹽(表3)、部分熒光染色劑滲入(表4和圖3)和內(nèi)部電解質(zhì)滲出(圖2)的作用。通過(guò)硝酸鑭示蹤結(jié)合X射線能量色散分析證明高丹草種子種胚包被物中存在阻擋鑭鹽滲入的半透層(圖4)，該組織的存在解釋了高丹草種皮顯示特殊通透性的原因。以往對(duì)蔬菜種子和禾草種子的研究也表明，半透層具有限制氨基酸[18]等種子內(nèi)含物滲出、四唑鹽[3-4,11]和鑭鹽[3,19]等大分子物質(zhì)滲入的作用。

本研究中，鈣黃綠素和熒光素鈉均能滲透3種高丹草種皮(表4)，進(jìn)入種子內(nèi)部被種胚所吸收。熒光素能滲透冀草2號(hào)高丹草種皮，卻被冀草8號(hào)和冀草008號(hào)高丹草種皮所阻擋(圖3)。鈣黃綠素能夠滲透高丹草種皮，證明分子量不是限制物質(zhì)通透的唯一因素，這和Salanenka等[20]對(duì)萵苣(Lactucasativa)種子的研究結(jié)果一致。熒光素不能滲透冀草8號(hào)和冀草008號(hào)高丹草種皮，這可能和熒光素相對(duì)較高的親脂性有關(guān)，較高親脂性的化合物具有有限的親水性，在通過(guò)植物組織時(shí)會(huì)被脂質(zhì)類物質(zhì)所阻擋。這一結(jié)論似可揭示高丹草種子脂質(zhì)化的半透層限制了熒光素的通透。以往主要基于對(duì)黃瓜(Cucumissativus)[17]、番茄和萵苣[20]等蔬菜種子以及少量牧草種子[21]種皮透性的研究也表明，存在半透層的種子對(duì)不同理化性質(zhì)熒光化合物的滲透特性不同，其半透性差異可能與種皮結(jié)構(gòu)、成分及化合物理化性質(zhì)等有關(guān)。

種皮對(duì)電解質(zhì)滲漏的限制使得基于滲漏差異的種子質(zhì)量評(píng)價(jià)方法無(wú)法檢測(cè)出不同活力種子之間的差異[6-8]。本研究中，完整高丹草種子隨活力下降，電導(dǎo)率與發(fā)芽率不相關(guān)(圖5)，證明電導(dǎo)率法不適用于高丹草種子活力測(cè)定。以往學(xué)者對(duì)雀麥(Bromusjaponicus)[9]、新麥草(Psathyrostachysjuncea)[22]等禾本科牧草的研究也發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率與發(fā)芽率不相關(guān)的結(jié)果。一些學(xué)者認(rèn)為可能由于禾草種子胚乳淀粉含量高[23]，不溶性物質(zhì)較多[24]，有研究表明這可能與種子代謝強(qiáng)度[25]和內(nèi)在物質(zhì)濃度[26]有關(guān)而非膜透性變化所致，但也有研究者認(rèn)為這可能與種皮透性[11]、結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成有關(guān)[27-28]。刺破種皮處理后，高丹草種子電導(dǎo)率與發(fā)芽率均呈極顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證明高丹草種子種胚包被物中半透層的存在阻擋了種子內(nèi)部電解質(zhì)的滲出，從種皮結(jié)構(gòu)和半透性角度揭示了電導(dǎo)率法不能用于高丹草種子活力評(píng)價(jià)的原因，為其他禾本科牧草種子的透性和基于物質(zhì)滲漏差異的種子活力測(cè)定方法的研究提供參考。

電導(dǎo)率法是評(píng)價(jià)種子質(zhì)量和預(yù)測(cè)田間出苗的有效方法[25,29]，該法已被國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)推薦為大粒豆類種子活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法[16]。但是許多禾草種子質(zhì)量下降并非可通過(guò)電導(dǎo)率進(jìn)行檢測(cè)[10,13,28]。本研究中，刺破種皮處理后，可用電導(dǎo)率法測(cè)定高丹草種子劣變程度，這為確定電導(dǎo)率法的適用范圍提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)具有半透層種子活力適宜測(cè)定方法的研究奠定了基礎(chǔ)。但刺破種皮后電導(dǎo)率值能否準(zhǔn)確預(yù)測(cè)種子的田間出苗率和耐貯藏性還需要進(jìn)一步的研究。

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