李繼偉，悅飛雪，王艷芳，張亞梅，倪瑞景，王發(fā)園，付國占，劉領(lǐng)

(河南科技大學農(nóng)學院，河南 洛陽 471023)

鎘(cadmium，Cd)是對植物毒性很強的土壤重金屬污染元素之一[1]，土壤中的鎘一旦過量就很難將其從土壤中排除，其被植物吸收后會破壞植物葉綠體結(jié)構(gòu)和功能，從而導致植物光合作用受到抑制和抗氧化系統(tǒng)的損傷[2-3]。另外，土壤重金屬鎘過量會導致農(nóng)作物生長緩慢、產(chǎn)量和品質(zhì)下降，并可通過食物鏈富集給人類健康帶來巨大的危害[4]。近年來，由于人類含鎘工業(yè)活動增加，過度施肥、污水灌溉等導致農(nóng)田土壤中重金屬鎘污染日趨嚴重[5]。因此，如何修復重金屬鎘污染土壤是需要迫切解決的重要環(huán)境問題。

土壤微生物是修復重金屬污染土壤的重要途徑之一，其中叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一種能夠和80%的植物根系互惠共生的根系微生物，不僅能夠為宿主植物提供更多的營養(yǎng)和水分，還能夠提高宿主植物對重金屬鎘的耐性[6-7]。另外，AM真菌不僅能夠通過侵染宿主植物形成根外菌絲和分泌球囊霉素等直接固定重金屬鎘，還能改善宿主植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和物理、化學性質(zhì)從而降低重金屬的有效性，減輕重金屬鎘脅迫[8]。研究表明不同的AM真菌種類、土壤環(huán)境和污染程度也會導致AM真菌的作用效果差異巨大[9]。生物炭是以作物秸稈等為材料在低溫厭氧條件下炭化產(chǎn)生的一種含碳量高、性質(zhì)穩(wěn)定的有機物質(zhì)[10]。生物炭具有有機碳高、多孔結(jié)構(gòu)、大的表面積和堿性的性質(zhì)，不僅能夠改善土壤質(zhì)量，保水保肥，提高作物產(chǎn)量，還能夠吸附和固定重金屬，減輕植物重金屬脅迫[11-12]。另外，由于生物炭孔隙能夠貯存水分和養(yǎng)分，為微生物棲息生活提供優(yōu)越的天然微環(huán)境，因此生物炭施入土壤能夠顯著增加土壤微生物的數(shù)量與活性，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[12-13]。

研究表明生物炭[14-15]和AM真菌[16]單獨施用均能夠改善土壤性質(zhì)，促進植物生長，但同時施用生物炭和接種AM真菌對促進植物生長，提高重金屬的耐性的效果還鮮有報道。有研究表明，施用生物炭可以促進AM真菌孢子萌發(fā)和菌絲的分支、增長[17-18]，玉米(Zeamays)是我國廣泛種植的重要糧食作物之一，其易被AM真菌侵染，且對重金屬有一定的耐性[19-20]。那么施用生物炭和接種AM真菌復合處理是否依然能夠促進玉米生長，提高玉米對重金屬鎘的耐性。本研究以玉米為宿主植物，施加生物炭和接種AM真菌，比較不同鎘污染水平下玉米生長，光合特性、抗氧化酶活性及土壤根際pH的變化規(guī)律，為評價重金屬污染土壤中生物炭對AM真菌的菌根效應以及其復合應用對植物生長的影響提供理論依據(jù)，也為土壤重金屬污染修復提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗土壤取自河南科技大學周山校區(qū)農(nóng)場小麥田0～20 cm耕層，質(zhì)地為粘壤土；土壤過2 mm篩后風干備用。供試土壤pH 7.6，有機質(zhì)12.62 g·kg-1，總氮0.54 g·kg-1，堿解氮46.66 mg·kg-1，有效磷17.13 mg·kg-1，有效鉀106.50 mg·kg-1，總鎘0.072 mg·kg-1。供試玉米，品種為“弘單897”。

試驗菌劑由河南科技大學環(huán)境監(jiān)測實驗室惠贈的AM真菌(GlomusintraradicesBEG 141)。菌根菌劑使用前以蘇丹草(Sorghumsudanese)為宿主擴繁，基質(zhì)為河沙。供試生物炭材料為購買于河南商丘三利新能源有限公司的小麥秸稈生物炭(于450 ℃條件下小麥秸稈限氧熱解制成)，基本理化性質(zhì)為：pH值10.4，比表面積為8.92 m2·g-1, 有機碳為52.2%，全氮為5.9 g·kg-1，全磷為0.89 g·kg-1，全鉀為23.2 g·kg-1。

1.2 試驗設計

設置3個鎘脅迫水平：0，3，6 mg Cd·kg-1。設計4個處理：對照(CK)，添加生物炭(B)，接種AM真菌(M)，添加生物炭和接種AM真菌(BM)，共計12個處理，每個處理4個重復，共48盆。

試驗于2016年5-9月在河南科技大學周山校區(qū)隔雨棚中進行。將經(jīng)生物炭或AM真菌處理的土壤混合均勻裝入塑料桶中(盆口直徑22 cm，高24 cm)，每盆凈重5 kg，生物炭、菌劑添加量均為20 g·kg-1，對照、生物炭和AM真菌處理分別添加相應質(zhì)量的滅菌土壤，保持各處理每盆重量一致。鎘添加以CdSO4水溶液的形式與土壤充分混合。土壤經(jīng)吸附沉淀2個月左右后，于2016年5月10日播種玉米種子，每盆預先播種2粒，待出苗后每盆定苗1株，玉米植株定期定量以去離子水平衡水分，期間不進行肥料投入。玉米播種后60 d選擇各處理中的4個重復，測定鎘脅迫下玉米葉片的葉綠素含量、光合特性和生理指標。100 d收獲前測定株高。玉米植株收獲后植物樣品地上部和根系分開取樣，洗凈，擦干。玉米須根用于測定菌根侵染率。采集植物根際的土壤樣品0.5 kg，自然風干、過篩，用于測定土壤pH。

1.3 測定項目和方法

株高和生物量測定：玉米株高于收獲前用刻度尺測定。植物樣品地上部和根系洗凈后用濾紙吸干, 稱取整株鮮重，然后放入烘箱中，先在105 ℃殺青30 min，再在80 ℃烘干48 h至樣品恒重，分別稱取干物質(zhì)生物量，計算干重。

光合色素含量的測定：玉米葉光合色素含量測定采用80%丙酮浸提法，參照文獻[21]測定提取液葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。

光合指標測定：于晴天上午9: 00-11: 00采用LI-6400XT便攜式光合測定系統(tǒng)(LI-COR，美國)，選取功能盛期葉片測定光合指標, 包括凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)、蒸騰速率(transpiration rate,Tr)、氣孔導度(stomatal conductance,Gs)和胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration,Ci)。每張葉片測定10次，取其平均值。測定光照強度為1200 μmol·m-2·s-1。

丙二醛(malondiadehyde，MDA)和抗氧化酶活性的測定：取0.5 g葉片組織, 加液氮充分研磨后, 用2 mL 10%三氯乙酸溶液提取丙二醛。加入2 mL含1%聚乙烯吡咯烷酮，(polyvinyl pyrrolidone, PVP)的0.1 mol·mL-1磷酸緩沖液(pH 5.5～8.8)，于4 ℃下13000 r·min-1離心20 min，所得上清液即為酶粗提液[22]。

MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[21]，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定采用氮藍四唑還原法[23]，過氧化物酶(peroxidase，POD)測定采用愈創(chuàng)木酚法[24]，過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定參照陳建勛等[25]的方法，采用紫外吸收法測定。

菌根侵染率測定：取新鮮須根，剪成1 cm 根段，使用10% KOH消煮后用酸性品紅染色，在顯微鏡(100×)下觀察叢枝菌根侵染狀況，用方格十字交叉法計算菌根侵染率[26]。

pH值測定：采用pH計(上海精密科學儀器有限公司，雷磁pHS-3C)進行測定，水土比為5∶1。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel 2007 軟件進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 19.0軟件進行方差分析。選擇LSD 法進行多重比較，作圖采用Origin 9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米株高和生物量的影響

由圖1可知，隨著鎘水平的升高，各處理的玉米株高和生物量逐漸下降，尤其是在6 mg Cd·kg-1水平下，對照處理的株高和生物量比0 mg Cd·kg-1水平下分別降低20.96% 和 21.50%；在所有Cd水平下，B、M、BM處理均顯著促進玉米生長(P<0.05)，表現(xiàn)為：BM>M>B>CK，平均株高分別比對照提高10%，24%，31%(圖1A)，平均生物量分別比對照增加28%，52%，70%(圖1B)。施用生物炭和接種AM真菌復合處理對玉米生長的促進效應最佳，0 mg Cd·kg-1水平下，施用生物炭和接種AM真菌對玉米生長的效應無顯著性差異(P>0.05)，在其他鎘水平下接種AM真菌處理促生效果顯著高于施用生物炭(P<0.05)，在6 mg Cd·kg-1水平下施用生物炭和接種AM真菌對玉米生長和菌根侵染情況如圖2所示。

圖1 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米株高和生物量的影響Fig.1 Effects of biochar and AM fungi on plant height and biomass of maize under Cd stress

圖2 施用生物炭和AM真菌對Cd(6 mg·kg-1)脅迫下玉米生長和菌根侵染情況Fig.2 Effects of biochar and AM fungi on maize growth and AM colonization in maize root under Cd (6 mg·kg-1) stress

2.2 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米葉片中光合色素含量的影響

由表1可知，隨著鎘水平的升高，各處理的玉米葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均逐漸下降，尤其是在6 mg Cd·kg-1水平下，對照處理的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素比0 mg Cd·kg-1水平下分別降低29.8%，61.4%和44.6%，說明Cd脅迫下玉米葉片光合色素含量下降，抑制光合作用的正常進行。在所有Cd水平下，B、M、BM處理均顯著提高玉米葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量(P<0.05)，平均葉綠素a含量分別比對照提高5.6%，8.5%，12.9%，平均葉綠素b含量分別比對照增加11.01%，19.02%，31.48%，平均類胡蘿卜素含量分別比對照增加12.95%，15.22%，21.65%。在所有Cd水平下，B和M處理對類胡蘿卜素含量的增加沒有顯著性差異(P>0.05)，總體看，接種AM真菌處理(M)對葉綠素a和葉綠素b含量增加優(yōu)于施加生物炭處理(B)，說明施用生物炭和接種AM真菌均能不同程度促進Cd脅迫下玉米葉片光合色素合成，提高玉米葉片光合色素含量，施用生物炭和接種AM真菌復合處理(BM)對玉米Cd脅迫下玉米葉片中光合色素含量增加效果最佳。

表1 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米葉片中光合色素含量的影響Table 1 Effects of biochar and AM fungi on photosynthetic pigment contents of maize leaves under Cd stress (mg·kg-1 FW)

2.3 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

由圖3可知，隨著鎘水平的升高，各處理的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)均逐漸下降，胞間CO2濃度(Ci)逐漸上升。尤其是在6 mg Cd·kg-1水平下，對照處理的Pn、Tr、Gs比0 mg Cd·kg-1水平下分別降低44.65%，53.38%和48.20%，Ci升高109.82%。表明Cd脅迫下，植物光合作用降低，CO2作用被抑制，導致CO2大量積累。在所有Cd水平下，施用生物炭、接種AM真菌、復合處理對玉米的光合特性有顯著影響，B、M、BM處理均顯著提高玉米葉片Pn、Tr、Gs(P<0.05)，顯著降低Ci(P<0.05)，平均Pn分別比對照提高9.82%，15.33%，23.94%(圖3A)，平均Tr分別比對照提高13.68%，22.74%，31.98%(圖3B)，平均Gs分別比對照提高8.85%，18.15%，28.30%(圖3C)，平均Ci分別比對照降低7.93%，13.12%，23.46%(圖3D)。總體看，在所有Cd水平下， B、M、BM處理對光合作用和CO2的同化均有不同程度的恢復作用，以施用生物炭和接種AM真菌復合處理(BM)效應最佳，接種AM真菌(M)處理對光合作用和CO2的同化恢復能力優(yōu)于施加生物炭處理(B)。

2.4 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米葉片中MDA含量和抗氧化酶活性的影響

由圖4可知，隨著鎘水平的升高，MDA含量逐漸上升，而各處理的SOD、POD、CAT含量均先升高后降低，但均高于對照，說明鎘脅迫下細胞膜損傷，MDA含量大量積累，SOD、POD、CAT活性增加來清除葉片細胞的活性氧。在所有Cd水平下，B，M，BM處理明顯影響玉米葉片中MDA含量和抗氧化酶活性，B、M、BM處理均顯著降低MDA含量(P<0.05)，提高玉米葉片SOD、POD、CAT活性(P<0.05)，平均MDA含量分別比對照降低32.8%，49.9%和69.1%(圖4A)，平均SOD活性分別比對照提高19.8%，37.0%和54.3%(圖4B)，平均POD活性分別比對照提高32.4%，43.1%和83.4%(圖4C)，平均CAT活性分別比對照提高22.9%，29.4%和52.0%(圖4D)?？傮w看，在所有Cd水平下，B、M、BM處理均提高Cd脅迫下玉米葉片的抗氧化酶活性，以施用生物炭和接種AM真菌復合處理(BM)效應最佳，接種AM真菌(M)處理對Cd脅迫下抗氧化酶活性的提高效果優(yōu)于施加生物炭處理(B)。

圖3 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米葉片光合氣體交換參數(shù)的影響Fig.3 Effects of biochar and AM fungi on photosynthetic gas exchange parameter of maize leaves under Cd stress

圖4 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米葉片MDA含量和抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of biochar and AM fungi on MDA concent and autioxidant enzyme activity of maize leaves under Cd stress

2.5 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米菌根侵染率和根際土壤pH的影響

由圖5可知，隨著鎘水平的升高，各處理的菌根侵染率和根際土壤pH均逐漸下降，但根際土壤pH下降不明顯。對玉米菌根侵染率而言，在6 mg Cd·kg-1水平下，對照處理玉米的菌根侵染率比0 mg Cd·kg-1水平下降低26.89%。在所有Cd水平下，M、BM處理均顯著提高菌根侵染率(P<0.05)，平均菌根侵染率分別提高121%和150%，B處理與對照無顯著性差異(P>0.05)(圖5A)。在所有Cd水平下，B、BM處理均顯著提高玉米根際土壤pH(P<0.05)，平均根際土壤pH值分別比對照提高8%和6%，M處理與對照無顯著性差異(P>0.05)(圖5B)。表明生物炭不僅能夠提高土壤pH，而且能夠促進菌根侵染玉米根系，AM真菌對改變土壤pH效果不明顯。

圖5 生物炭和AM真菌對Cd脅迫下玉米菌根侵染率和根際pH的影響Fig.5 Effects of biochar and AM fungi on colonization rate and soil pH of maize root under Cd stress

3 討論

Cd脅迫對玉米的生理和生化特性變化有很大影響。有研究表明AM真菌[27-28]或生物炭[29-30]單獨施用均能促進Cd脅迫下玉米的生長。本研究也表明在所有Cd脅迫下，施用生物炭和接種AM真菌均促進玉米生長，有助于光合作用，但生物炭和接種AM真菌復合處理對玉米株高、生物量、光合色素和光合特性的提高效果優(yōu)于單獨施用生物炭或AM真菌。而株高、生物量是玉米生長的表觀特征，葉片光合色素的含量與組成直接影響著植株的光合能力，光合作用是植物有機物合成的主要途徑，是影響玉米生長的關(guān)鍵因素之一[31]。Cd脅迫誘導植物產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，導致植物葉片細胞過氧化，從而引起葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，光合色素合成受到影響，阻礙電子傳遞，影響類囊體的蛋白質(zhì)合成和參與Calvin循環(huán)的酶活性，從而導致玉米葉片氣孔導度下降、CO2進入氣孔受阻，導致葉片蒸騰速率和光合速率下降，使光合作用等生理過程發(fā)生紊亂，從而降低植物器官的株高和生物量，抑制植株的生長[19,32]。施用生物炭和接種AM真菌復合處理對促進Cd脅迫下玉米生長和光合特性的提高效應最佳，這可能是因為生物炭的多孔結(jié)構(gòu)和富有的礦質(zhì)營養(yǎng)不僅能夠為玉米保水保肥，提供良好的土壤環(huán)境[33]，還能夠促進AM真菌繁殖[18]，而且AM真菌能夠改善土壤環(huán)境，吸收植物可吸收利用的礦質(zhì)營養(yǎng)(特別是磷，P)轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，緩解葉綠素的分解[34]。本研究表明生物炭與AM真菌在植物生長和光合特性方面具有協(xié)同效應，這與Hu等[35]的研究中生物炭和AM真菌促進Cd脅迫下空心菜(Ipomoeaaquatica)和東南景天(Sedumalfredii)間作系統(tǒng)中植物生長，劉先良等[36]的研究中生物炭和AM真菌促進烤煙(Nicotiana)生長研究結(jié)果一致。

Cd脅迫下植物體內(nèi)自由基的增多造成細胞膜系統(tǒng)的損傷而造成氧化脅迫，MDA作為細胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量多少常用作評價細胞膜損傷程度的標準[3,22]。植物在逆境下會產(chǎn)生一系列的應對機制，SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)ROS清除系統(tǒng)的保護酶，它們協(xié)同作用可以防御活性氧自由基對細胞膜的傷害，抑制膜脂過氧化，減輕脅迫對植物細胞造成的傷害[37]。本研究表明，隨著Cd水平的升高，MDA含量逐漸升高，SOD、POD和CAT活性先升高后降低，但均高于0 Cd mg·kg-1水平下。這與王芳等[3]的研究在鎘脅迫下玉米抗氧化酶活性低于對照的研究結(jié)果不同，可能是因為施加的Cd濃度水平不同，本研究中Cd濃度較低，玉米受到脅迫后，植物體的應激反應導致抗氧化酶活性升高來清除活性氧保持一個較低水平，隨著Cd脅迫的增加，抗氧化酶活性會降低。施用生物炭和接種AM真菌均能緩解Cd脅迫，降低MDA含量，提高SOD、POD和CAT活性，但施用生物炭和接種AM真菌復合處理對提高玉米的抗氧化能力效果優(yōu)于單獨施用生物炭或AM真菌。這可能是因為AM真菌的根外菌絲、孢子，根內(nèi)菌絲、囊泡結(jié)構(gòu)[38]和生物炭的堿化作用、陽離子交換能力、多孔結(jié)構(gòu)[39]都能夠降低重金屬的有效性，提高植物的抗性，而生物炭的多孔結(jié)構(gòu)還能夠為AM真菌定植提供良好的條件，改善AM真菌的群落結(jié)構(gòu)，而AM真菌又可能促進生物炭固持的養(yǎng)分釋放[40]。生物炭能夠促進AM真菌生長,可能是因為生物炭改善土壤物理特性來促進AM真菌生長，同時促進微生物(如P增溶細菌)與AM真菌相互作用，誘導植物與真菌之間的化合物信號反應，從而影響孢子萌發(fā)和菌絲的分支[41-42]。因此，在Cd脅迫下同時施加AM真菌和生物炭能夠使植物生長和抵抗重金屬脅迫效果最佳。

本研究中施用生物炭和接種AM真菌對玉米生長、光合特性和抗氧化性的影響效應不同?？傮w來看，AM真菌對促進植物的生長和提高抗氧化能力的效果優(yōu)于生物炭，這可能是因為生物炭本身的礦質(zhì)營養(yǎng)較少，而主要通過堿化土壤降低重金屬活性和其特殊結(jié)構(gòu)吸附重金屬Cd，改善土壤理化性質(zhì)，從而提高植物的生長和抗氧化能力[43]，而AM真菌不僅能夠固持重金屬，提高植物的耐性，減少植物對重金屬的吸收，還能夠促進植物對營養(yǎng)元素的吸收，產(chǎn)生“稀釋”效應，降低Cd濃度[34,44]。另外，AM真菌分泌物，多磷酸，有機酸和球囊霉素等不僅能夠在植物-菌絲界面與Cd離子結(jié)合來固定重金屬，而且球囊霉素能夠提高土壤團聚體穩(wěn)定性，改善土壤理化性質(zhì)，從而促進植物生長[38,45]。本研究也發(fā)現(xiàn)施加生物炭能夠提高土壤pH，接種AM真菌能夠顯著提高玉米根侵染率(圖5)，進一步證明了生物炭能夠改變土壤pH來降低重金屬活性，AM真菌能夠提高植物耐性，促進植物生長。而施用生物炭和接種AM真菌結(jié)合對植物抵抗重金屬脅迫具有協(xié)同作用，對植物生長、光合特性和抗氧化活性的提高效應最佳。

4 結(jié)論

綜上所述，Cd脅迫使玉米的株高、生物量、光合色素、凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)降低，胞間CO2濃度(Ci)、MDA含量增加，而抗氧化酶活性先升高后降低，表明Cd脅迫干擾玉米的正常發(fā)育。施用生物炭和AM真菌均能提高玉米的株高、生物量、光合色素、凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、抗氧化酶活性，降低胞間CO2濃度(Ci)、MDA含量。施用生物炭和接種AM真菌結(jié)合能夠?qū)χ参锷L、光合特性、抗氧化酶活性和菌根侵染率、土壤pH的提高效應最佳。然而，施用生物炭和接種AM真菌對玉米植株Cd含量效應及其機理和在田間生產(chǎn)修復的效應，仍需要進一步探究。

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