夏方山，董秋麗，毛培勝，王明亞，陳玲玲，程航

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西 晉中 030801；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，草業(yè)科學北京市重點實驗室，北京 100193；3.山西農(nóng)業(yè)大學林學院，山西 晉中 030801)

種子是植物種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要原料及其有效保存體，也是農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)成敗的先決條件。然而，種子在儲藏過程中總會不同程度地發(fā)生老化現(xiàn)象，并導致其萌發(fā)及幼苗生長能力下降，從而造成植物產(chǎn)量及品質(zhì)的大幅降低，給農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。貯藏種子的含水量越大，其活力的下降速度也就越快[3]。超干貯藏由于保持了種子的生理功能及其膜結構的完整性，從而最大限度地延長種子的貯藏壽命，因而成為保護植物種質(zhì)資源、維持其遺傳穩(wěn)定性的重要方法，并越來越受人們的關注[4-5]。然而，種子不僅在超干處理過程會受到損傷，還會在萌發(fā)過程發(fā)生吸脹損傷，導致其萌發(fā)及幼苗生長能力下降[6]。因此，種子引發(fā)稱為當今種子科學領域的一個研究熱點。聚乙二醇(PEG)是最常用的引發(fā)劑，可降低萌發(fā)過程中水分進入種子的速度，從而修復種子的老化損傷[7-8]。PEG引發(fā)已應用于穿心蓮(Andrographispaniculata)[9]、莖瘤芥(Brassicajuncea)[10]及蔓性千斤拔(Moghaniaphilippinensis)[11]等植物老化種子的研究。目前，已報道了PEG引發(fā)對超干燕麥(Avenasativa)種子老化后種子萌發(fā)、幼苗生長及其細胞結構和抗氧化性能的影響[5,12-14]。然而，尚未有關于PEG引發(fā)影響超干種子老化后種胚細胞與線粒體結構和抗氧化性能關系的報道。

燕麥是具有耐瘠薄，耐鹽堿，抗旱及耐寒等優(yōu)良特性的傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)糧飼兼用作物[15-16]。燕麥秸稈含有較高的粗蛋白、粗脂肪以及無氮浸出物等營養(yǎng)成分，而其難消化的粗纖維含量卻較低[17]。燕麥籽實則富含均衡蛋白質(zhì)、可溶性膳食纖維β-葡聚糖、不飽和脂肪酸、維生素及礦物質(zhì)等對人類健康至關重要的營養(yǎng)成分[18]。燕麥籽實含有較高的油脂，含量為3.1%～11.6%，其中不飽和脂肪酸達80%以上[19-20]。然而，由于脂肪衍生物容易酸敗或劣變，所以燕麥籽實的高脂肪含量會導致其更容易發(fā)生劣變，從而限制了燕麥籽實在食物及種子方面的廣泛應用[21]。因此，研究燕麥種子的老化對其種子資源的保存與利用具有重要意義。試驗以老化的超干燕麥種子為材料，分析PEG和水引發(fā)對其活力影響的細胞與線粒體協(xié)同作用機理，為預防超干種子萌發(fā)過程的吸脹損傷，以及老化種子的修復機理研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試燕麥(品種：三冠王)種子由中國農(nóng)業(yè)大學牧草種子實驗室提供，2009年收集于河北省張家口市沽源牧場，在-20 ℃保存至2014年12月進行試驗。種子自然含水量為9.8%，正常種苗數(shù)為89%，不正常種苗數(shù)為5%，含油量為5.0%。

1.2 超干處理

稱量種子初始重量，并將其放置于裝有變色硅膠的干燥器內(nèi)，反復稱重，當種子達到所需重量時(種子含水量為4%，鮮重)，立即密封于12 cm×17 cm的錫箔袋中，每袋20 g種子，放入4 ℃冰箱備用。含水量的測定方法參照文獻[5]進行。

1.3 老化及PEG引發(fā)處理

將種子放于45 ℃恒溫水浴箱內(nèi)劣變48 d，然后用水勢為0(蒸餾水，DW)和-1.2 MPa的PEG-6000在20 ℃黑暗條件引發(fā)處理12 h，PEG濃度及引發(fā)時間的篩選結果見文獻[5]。蒸餾水沖洗2次，用濾紙吸干表層水分后， 25 ℃室內(nèi)風干。以未引發(fā)的老化燕麥種子為對照(CK)。重復4次。

1.4 測定指標

1.4.1發(fā)芽試驗及指標測定 參照國際種子檢驗協(xié)會(International Seed Testing Association，ISTA)的種子檢驗規(guī)程(2013)[22]進行。選取均勻飽滿的種子100粒放入培養(yǎng)皿(11.5 cm×11.5 cm)，20 ℃恒溫條件培養(yǎng)，4次重復。每天統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)(胚根突破種皮2 mm)，末次計數(shù)第10天，最終統(tǒng)計正常種苗數(shù)，并測定全部正常種苗的平均苗長及苗鮮重，種子發(fā)芽率參照ISTA的種子檢驗規(guī)程(2013)[22]進行，發(fā)芽指數(shù)及幼苗活力指數(shù)參照Abdul-Baki等[23]的方法進行，平均發(fā)芽時間參照Ellis等[24]的方法進行。

1.4.2細胞及線粒體超微結構觀察 參照Xia等[3]的方法進行。隨機選取待測燕麥種子，在蒸餾水中吸脹4 h后，用解剖針在體視鏡下快速取出種胚，浸泡于4%的戊二醛固定液。經(jīng)過脫水、包埋、染色處理后，用透射電鏡(日立H-7500)在10000倍范圍內(nèi)觀察樣品切片，并拍攝其細胞及線粒體照片。

1.4.3粗酶液及線粒體的提取 酶的提?。簠⒄誎ibinza等[25]的方法進行。剝?nèi)?0個種胚于預冷的研缽，用3.5 mL提取液研磨至勻漿，24188 r·min-1離心15 min。上清液在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有操作均?～4 ℃進行。

線粒體的提取與純化：參照Yin等[26]的方法進行。剝?nèi)?00個燕麥種胚于預冷的研缽，加入20 mL預冷的提取緩沖溶液，冰浴研磨5 min，4層紗布過濾后，反復離心洗滌獲得線粒體懸浮液，最后用1∶2的Percoll梯度分離液純化。所有操作均在1～4 ℃進行。

1.4.4抗氧化酶活性測定 酶活性所需可溶性蛋白含量按照考馬斯亮藍測定試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所-南京建成科技有限公司)進行。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的測定：參照Rao等[27]的方法進行。1 mL反應體系中加入0.5 mL酶液或10 μL線粒體(約含20 μg蛋白)，SOD的活性以每mg酶液或線粒體蛋白抑制氮藍四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)光化還原的50%作為一個酶活性單位。

抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性的測定：參照Nakano等[28]的方法進行。1 mL反應體系中加入0.5 mL酶液或10 μL線粒體(約含20 μg蛋白)，利用抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)在290 nm處吸光值的減少來表示APX的酶活性。

谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)活性的測定：參照Madamanchi等[29]的方法進行。1 mL反應體系中加入0.5 mL酶液或10 μL線粒體(約含20 μg蛋白)，通過測定由于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的氧化導致的340 nm處吸光值的降低來表示GR的活性。

1.4.5丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量測定 參照Bailly等[30]的方法進行，1 mL反應體系中加入0.5 mL酶液或10 μL線粒體(約含20 μg蛋白)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2010和SAS 8.0統(tǒng)計分析軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用Duncan’s法進行多重比較，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 PEG引發(fā)對老化燕麥種子萌發(fā)的影響

PEG引發(fā)后老化燕麥種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著(P<0.05)高于CK(表1)，而其平均發(fā)芽時間顯著(P<0.05)低于CK；DW引發(fā)后其發(fā)芽指數(shù)顯著(P<0.05)高于CK，但其發(fā)芽率卻顯著(P<0.05)低于CK，而DW引發(fā)后其平均發(fā)芽時間與CK差異不顯著(P>0.05)。

2.2 PEG引發(fā)對老化燕麥種子幼苗生長的影響

PEG引發(fā)后老化燕麥種子的苗長顯著(P<0.05)低于CK(表2)，其幼苗活力指數(shù)顯著(P<0.05)高于CK，而其苗鮮重與CK差異不顯著(P>0.05)；DW引發(fā)后其苗長與CK差異不顯著(P>0.05)，而其苗鮮重和幼苗活力指數(shù)顯著(P<0.05)低于CK。

表1 不同引發(fā)條件下老化燕麥種子萌發(fā)的變化Table 1 Changes in germination of aged oatseeds with different priming

表2 不同引發(fā)條件下老化燕麥種子幼苗生長的變化Table 2 Changes in germination of aged oat seeds with different priming

2.3 PEG引發(fā)對老化燕麥種胚細胞及線粒體超微結構的影響

CK老化燕麥種胚細胞及其細胞核維持正常形狀，并有大量的線粒體和液泡狀結構，細胞發(fā)生了明顯的質(zhì)壁分離，線粒體膜清晰可見，其基質(zhì)稠密(圖1A和D)。DW引發(fā)后老化燕麥種胚細胞核和線粒體膜模糊，且細胞核膜出現(xiàn)褶皺，線粒體基質(zhì)變稀(圖1B和E)。PEG 引發(fā)后老化燕麥種胚細胞及其核結構正常，有大量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及液泡狀結構存在，其細胞核及線粒體雙層膜結構清晰可見，線粒體嵴也清晰可見(圖1C和F)。

圖1 不同引發(fā)條件下超干燕麥種子老化后種胚細胞及線粒體結構的變化Fig.1 Changes of different priming in cellular and mitochondrial structure of ultra-dried oat seeds after ageing

2.4 PEG引發(fā)對老化燕麥種胚細胞及線粒體抗氧化酶的影響

老化燕麥種胚細胞內(nèi)SOD、APX和GR活性顯著(P<0.05)低于其線粒體(表3)。PEG引發(fā)后老化燕麥種胚細胞及線粒體內(nèi)SOD、APX和GR活性均顯著(P<0.05)高于CK，其種胚細胞內(nèi)SOD、APX和GR活性分別提高了26.7%、20.9%和26.9%，其線粒體內(nèi)SOD、APX和GR活性分別提高了19.2%、19.4%和17.1%；而DW引發(fā)后其細胞及線粒體內(nèi)SOD、APX和GR活性均顯著(P<0.05)低于CK，其種胚細胞內(nèi)SOD、APX和GR活性分別降低了11.8%、8.3%和18.3%，其線粒體內(nèi)SOD、APX和GR活性分別降低了17.8%、21.9%和28.8%。

表3 不同引發(fā)條件下老化燕麥種胚線粒體抗氧化酶的變化Table 3 Changes in mitochondrial antioxidant enzymes activity of aged oat seeds with different priming

2.5 PEG引發(fā)對老化燕麥種胚細胞及線粒體MDA含量的影響

老化燕麥種胚細胞內(nèi)MDA含量顯著(P<0.05)高于其線粒體內(nèi)(表4)。PEG引發(fā)后燕麥種胚細胞及線粒體MDA含量均顯著(P<0.05)低于CK，其種胚細胞內(nèi)MDA含量降低了28.3%，其線粒體內(nèi)MDA含量降低了13.7%；然而，DW引發(fā)后其細胞及線粒體MDA含量均顯著(P<0.05)高于CK，其種胚細胞內(nèi)MDA含量提高了29.1%，其線粒體內(nèi)MDA含量提高了40.4%。

3 討論

種子萌發(fā)及幼苗建成是植物生命周期的關鍵時期，此時對外界環(huán)境因子反應最敏感。而PEG引發(fā)可修復種子的老化損傷并顯著提高其活力水平[31]。Bailly等[7]研究發(fā)現(xiàn)，濃度為-2.0 MPa 的PEG在15 ℃引發(fā)7 d提高了老化向日葵(Helianthusannuus)種子的萌發(fā)速度，并恢復其最初的發(fā)芽能力。Sharanappa等[32]研究發(fā)現(xiàn)，濃度為-1.0 MPa的PEG引發(fā)72 h能提高老化向日葵種子的發(fā)芽率、發(fā)芽速度及幼苗活力指數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK相比，濃度為-1.2 MPa的PEG引發(fā)12 h后顯著(P<0.05)提高了老化燕麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，并顯著(P<0.05)降低了其平均發(fā)芽時間，這說明濃度為-1.2 MPa的PEG引發(fā)12 h能有效修復超干燕麥種子的老化損傷。PEG引發(fā)顯著提高了老化燕麥種子的幼苗活力指數(shù)，但對其苗鮮重影響不顯著(P>0.05)，并顯著(P<0.05)降低了其苗長，這說明PEG引發(fā)抑制了老化燕麥種子的幼苗生長。PEG引發(fā)促進了老化燕麥種子幼苗根的伸長生長，但降低了其幼苗根和芽的鮮重及芽長[12]。

表4 不同引發(fā)條件下老化燕麥種胚細胞及線粒體MDA含量的變化Table 4 Changes in cellular and mitochondrial MDA contents of aged oat seeds with different priming (μmol·mg-1 protein)

Dorna等[33]研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，DW引發(fā)(500 μL DW·g-1種子在20 ℃黑暗條件下48 h)后老化(20 ℃貯藏12個月)洋蔥(Alliumcepa)種子(20 ℃和45%的相對空氣濕度干燥48 h)的發(fā)芽率沒有變化。Sharanappa等[32]研究發(fā)現(xiàn)，DW引發(fā)(25 ℃浸泡18 h)能夠有效提高老化[在(40±1) ℃和90%相對空氣濕度下0、24和48 h]向日葵種子的活力水平。然而，本試驗發(fā)現(xiàn)，DW引發(fā)后雖顯著(P<0.05)提高了老化燕麥種子發(fā)芽指數(shù)，但對其平均發(fā)芽時間與苗長影響不顯著(P>0.05)，并顯著(P<0.05)降低了其發(fā)芽率、幼苗活力指數(shù)和苗鮮重，DW引發(fā)后其苗長與CK差異不顯著(P>0.05)，這說明DW引發(fā)造成了老化的超干燕麥種子萌發(fā)的吸脹損傷。本試驗結果與老化向日葵[32]和洋蔥[33]種子的研究結果之間存在的差異，而這可能主要是由于種子含水量不同引起的。種子含水量高低是影響引發(fā)成敗的關鍵[34]。本試驗以超干燕麥種子(含水量為4%)為材料，這是造成不同于前人以安全含水量植物種子為材料報道的主要原因[32-33]。

超干種子通過提高抗氧化酶系統(tǒng)的活力來減輕老化過程產(chǎn)生的細胞損傷。超干種子通過提高細胞SOD、POD、CAT、APX和GR活性來緩解老化過程的脂質(zhì)過氧化損傷，降低其MDA含量，從而延緩其活力水平的下降速度[35-36]。因此，抗氧化酶的變化是評價PEG引發(fā)后超干種子活力的早期快速預警系統(tǒng)[13]。PEG引發(fā)能提高老化種子細胞SOD、CAT、POD、DHAR和GR等抗氧化酶的活性，并降低其MDA的產(chǎn)生[7,37]。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為-1.2 MPa的PEG引發(fā)12 h后顯著提高了老化燕麥種胚細胞及線粒體SOD、APX和GR活性(P<0.05)，從而顯著(P<0.05)降低了其細胞及線粒體的MDA含量，使其細胞保持正常結構，表現(xiàn)為細胞核膜清晰可見，并有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及液泡存在，其線粒體數(shù)量增多，基質(zhì)稠密，雙層膜和嵴清晰可見。這說明PEG引發(fā)通過提高超干燕麥種胚細胞及線粒體SOD、APX和GR活性來緩解脂質(zhì)過氧化損傷，以修復細胞及線粒體的結構與功能，從而使老化種子的活力水平得到提高。然而，DW引發(fā)顯著(P<0.05)降低了其種胚細胞及線粒體SOD、APX和GR活性，從而顯著(P<0.05)增加了其細胞及線粒體MDA含量，致使其細胞結構異常，表現(xiàn)為細胞核膜出現(xiàn)褶皺，線粒體數(shù)量較少，基質(zhì)稀薄，雙層膜模糊，嵴消失。這說明DW引發(fā)不僅加劇了其老化損傷，還導致了超干燕麥種子的吸脹損傷。高水勢使超干種子快速吸脹，加劇了老化種子細胞膜完整性的喪失，從而不可逆地傷害細胞，形成吸脹損傷，表現(xiàn)為種子活力下降[6]。適當濃度的PEG引發(fā)主要通過提高超干燕麥種子的抗氧化能力來修復其老化損傷，并避免其吸脹損傷[13-14]。

本試驗中，老化的超干燕麥種子經(jīng)PEG引發(fā)后，其種胚細胞及線粒體SOD、APX和GR活性均顯著(P<0.05)高于DW引發(fā)，而其細胞及線粒體MDA含量均顯著(P<0.05)低于DW引發(fā)，這說明PEG引發(fā)不僅能修復其老化損傷，還能避免其萌發(fā)過程的吸脹損傷。老化的超干燕麥種子經(jīng)PEG和DW引發(fā)后，其細胞及線粒體內(nèi)SOD、APX和GR活性，以及MDA含量的變化規(guī)律相同，說明細胞及其線粒體在維持老化超干燕麥種子的活力方面具有協(xié)同作用。然而，燕麥種胚線粒體是其種子老化及修復最敏感的細胞器[14,38]。本試驗發(fā)現(xiàn)，老化的超干燕麥種胚線粒體SOD、APX、GR活性顯著(P<0.05)高于細胞，而其線粒體MDA含量顯著(P<0.05)低于細胞，這說明線粒體是超干燕麥種子老化后清除脂質(zhì)過氧化損傷的主要部位，因此，線粒體是對PEG引發(fā)最敏感的細胞器。

4 結論

PEG引發(fā)通過提高超干燕麥老化種胚細胞及線粒體的SOD、APX及GR活性，以緩解其脂質(zhì)過氧化損傷，并修復其細胞及線粒體超微結構，從而促進其萌發(fā)。然而，蒸餾水引發(fā)與此相反。在老化的超干燕麥種子的引發(fā)過程中，其種胚細胞與線粒體協(xié)同發(fā)揮作用，但線粒體是其發(fā)揮作用的最主要部位。

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