張江萍,尹衛(wèi)東,劉和*

(1.山西林業(yè)職業(yè)技術學院,山西 太原 030003;2.山西省林業(yè)廳,山西 太原 030012)

0 引言

森林是陸地上最重要的碳儲存庫,儲存著全球陸地地上植被碳庫及地下土壤碳庫80%以上的碳資源[1]。森林資源的合理利用對于促進經濟增長,開發(fā)新資源有著舉足輕重的重要作用[2-3]。隨著林業(yè)資源需求量的增加,森林資源逐年減少,合理地保護森林資源已迫在眉睫[4]。透光撫育是合理利用和保護森林資源的一種重要方法。通過撫育調整群落結構和林分密度,改善林木生長和生態(tài)環(huán)境,不僅可以達到合理保留樹種,促進林下經濟作物生長,而且能夠保障群落結構的合理性,使其形成良好的層次結構和各種林分結構,提高物種的豐富度和增強林下栽培資源的合理利用[5-7]。

靈芝(Ganodermalucidum)是傳統(tǒng)的扶正固本,滋補強壯的珍貴藥材,具有“安神,保神”,“人心生血,助心充脈”,“益肺氣,益肝氣,益脾氣”等功效[8-9]。在我國,靈芝作為藥用已有兩千多年的歷史[10]。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明,靈芝在免疫系統(tǒng)的調節(jié)[11]、抗腫瘤[12]、抗病毒、清除體內自由基[13-14]、降血脂等方面具有極其重要的作用[15]。目前,已經從靈芝子實體中分離到400多種活性成分,其中包括糖類(多糖和低聚糖)、三萜類、核苷類、甾醇類、多肽、生物堿、呋喃衍生物、脂肪酸、揮發(fā)油、微量元素等[16-18]。其中多糖、三萜、甾醇等是最主要的活性成分,也是目前靈芝次生代謝產物研究的熱點[19]。

隨著靈芝栽培產業(yè)的不斷發(fā)展,傳統(tǒng)的靈芝栽培模式因不注重產品品質、產品結構單一、有效成分含量低等缺點而逐漸在市場中失去競爭力。開發(fā)新的靈芝栽培模式,尋找與野生靈芝品質相同的靈芝單品,提高靈芝藥效成分含量是近幾年人們關注的重點[20]。本研究通過不用撫育方式形成3種不同的撫育樣地(即強度透光H-L、中度透光M-L和弱度透光L-L),在各樣地內擺放靈芝菌袋并進行常規(guī)出菇管理,采收成熟靈芝后測定靈芝子實體主要活性成分的含量變化。以期開發(fā)新的栽培模式,提高藥效含量為靈芝產品的深度開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和林下真菌的栽培管理提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

靈芝由山西林業(yè)職業(yè)技術學院食用菌項目組提供,保藏于山西農業(yè)大學食用菌中心。

1.2 樣地概況

研究樣地設置為山西關帝山林局森林生態(tài)實驗站。該地區(qū)地處呂梁山脈中段,地理位置為N37°54′26″ N,E111°31′36″E,海拔283 m,屬溫帶大陸性季風氣候,具有水熱同季、濕潤多雨等特點,夏季均溫27.6℃,年均降水量822.6 mm。樣地位于實驗站海拔1 600 m處,以闊葉楊樺林為主。

1.3 樣地設置與靈芝栽培管理

本研究于4月中旬(生長季前)按照采伐闊葉樹的程度(分強、中、弱度)共設置9塊10 m×15 m標準地(各3次重復),不同標準地間距約20 m左右;強度撫育樣地(H-L)通過伐除喬木層喬木側枝和下方所有樹種,形成直徑約10 m的直射透光樣地;中度透光撫育樣地(M-L)通過伐除上方未達到林冠層的部分亞喬木及灌木,形成直徑約10 m的半透光樣地;弱度撫育樣地(L-L) 未進行任何伐除的直徑10 m的弱度透光樣地。利用網(wǎng)格法在每塊標準地設置6個5 m×5 m的小樣方,對每個小樣方進行編號,于5月上旬在每個小樣方內擺放50個進入出菇管理期的靈芝菌袋(菌袋原料以木屑為主,規(guī)格為18 cm×40 cm×3 cm),并覆土栽培,按照常規(guī)出菇管理方式管理出菇,于10月份收集所有成熟的靈芝子實體,去除靈芝子實體表面的靈芝孢子粉,低溫冷凍干燥后,粉碎過80目篩。

1.4 靈芝有效成分含量的測定

1.4.1 靈芝子實體蛋白質含量測定

用Folin-酚蛋白定量試劑盒(Solarbio)測定蛋白質含量。制作牛血清蛋白標準曲線,計算蛋白含量。

1.4.2 靈芝子實體多糖含量測定

采用硫酸蒽酮法測定多糖含量,參照郭曉蕾等[21]并略有改進。取2 g干粉加入 90 mL水加熱回流提取2 h,提取液抽濾后定容至100 mL,取10 mL加入150 mL無水乙醇,4℃放置12 h沉淀多糖,離心,棄上清,沉淀加水溶解定容至50 mL,取2 mL樣品加入6 mL硫酸蒽酮溶液,水浴加熱15 min,625 nm處測定吸光度值。

1.4.3 靈芝子實體總三萜化合物含量測定

稱取1 g樣品,加入20 mL 70%(V/V)的乙醇溶液進行超聲處理(超聲溫度40℃;超聲功率250 W;時間30 min),定容至50 mL,搖勻,過濾。吸取1 mL濾液于試管中,以70%的乙醇為參照,按照標準曲線法在560 nm處測定吸光度值,以公式1計算樣品的總三萜含量(以熊果酸計)[22]。

(1)

式中:m為樣品質量mg,v為吸取的濾液mL,Y為靈芝三萜的含量μg。

1.4.4 靈芝子實體麥角甾醇含量測定

參照邢增濤等[23]的方法,采用HPLC方法測定子實體中麥角甾醇含量。

1.4.5 子實體礦物質元素測定

準確稱取靈芝樣品2 g于石英坩堝中,用小火加熱至樣品不冒煙,然后大火燒至樣品成灰白色,轉移至550℃馬福爐,灰化6 h至灰化完全為止。收集樣品于試管中加入5 mL HNO3,加熱溶解殘渣,待溶液蒸至約1 mL時,轉移至100 mL容量瓶中,用去離子水定容,搖勻,采用原子吸收分光光度計測定含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL2013和SPSS 17軟件對不同透光條件各樣地的透光孔隙度、靈芝子實體中有效成分含量進行方差分析(ANOVA),數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示,顯著性差異采用 Duncan多重比較法進行比較。

2 結果與分析

2.1 不同撫育條件下林分孔隙度的差異

不同撫育條件下,林分孔隙度差異較為明顯(圖1)。每年4-6月份,林冠層闊葉樹葉片尚未完全展開,各樣地林分孔隙度均最大;6-8月份,林冠層闊葉樹枝葉量增加且葉片完全展開,強光撫育和中度撫育孔隙度的差異顯著較小,弱光撫育減少不顯著;8-10月份,林分孔隙度隨著闊葉樹枝葉量的增加開始減小,而后部分枝葉成熟,孔隙度增加。

Fig.1 Canopy openness of each plot in different tends of woods圖1 不同撫育條件下林分透光孔隙度

2.2 不同撫育條件下靈芝子實體中蛋白含量變化

不同撫育條件下靈芝子實體中蛋白質含量不同(圖2)。M-L和H-L條件下顯著高于L-L(P<0.05),M-L和H-L條件下差異顯著。M-L條件下,子實體中蛋白質含量最高,達到19.71 mg·g-1,其中M-L條件比L-L蛋白質含量高42.9%,相對H-L條件僅高5.3%。強光和弱光都不利于蛋白質的積累,可能是由于強光條件下代謝旺盛,導致蛋白質消耗增加,弱光條件下子實體合成蛋白質較少所致。

Fig.2 Protein contents in G. lucidum(mg·g-1)圖2 靈芝子實體蛋白質含量(mg·g-1)

2.3 不同撫育條件下靈芝子實體中多糖含量變化

由圖3可知,不同條件下靈芝子實體中有效成分多糖含量不同。在M-L條件下,多糖含量顯著高于H-L和L-L(P<0.05),H-L顯著高于L-L(P<0.05)。M-L條件下多糖含量為1.88%,較H-L和L-L分別高11.2%和27.9%。強光和弱光都影響子實體多糖的合成。

Fig.3 Changes of polysaccharide in different tends of woods圖3 不同撫育條件下多糖含量變化

2.4 不同撫育條件下靈芝子實體中三萜含量變化

由圖4可知,不同撫育條件下靈芝子實體中三萜含量變化不同。M-L條件下,三萜含量為8.53%顯著高于H-L和L-L(P<0.05),較H-L和L-L分別高1.2%和20.5%。H-L顯著高于L-L(P<0.05)。光照影響三萜合成通路的代謝,進而影響三萜含量,強光照條件子實體啟動自身抵御光照的應激反應,造成三萜合成降低。

Fig.4 Change of triterpenoids contents in different tends of woods圖4 不同撫育條件下三萜含量變化

2.5 不同撫育條件下靈芝子實體中麥角甾醇含量變化

圖5給出了靈芝子實體中麥角甾醇測定的HPLC圖，由圖6可知，不同撫育條件對子實體中麥角甾醇含量影響較大。三種撫育條件下麥角甾醇含量差異顯著(P<0.05),L-L條件下,麥角甾醇含量極顯著高于M-L和H-L,M-L和H-L之間也存在極顯著差異(P<0.05)。L-L條件下麥角甾醇含量為0.75 mg·g-1,較M-L和H-L高出102.7%和141.9%。弱光條件下,細胞膜的流動性較差,細胞質間信號分子之間的傳遞減慢,造成細胞膜中麥角甾醇含量增加。

A. Comparison products,B. G.lucidum,1. ergosterolFig.5 HPLC patterns of ergosterol in G.lucidum圖5 靈芝子實體中麥角甾醇測定HPLC圖

Fig.6 Ergosterol contents in G.lucidum(mg·g-1)圖6 靈芝子實體麥角甾醇含量(mg·g-1)

2.6 不同撫育條件下靈芝子實體中礦物質元素變化

由表1可知,不同撫育條件下靈芝子實體中礦物質元素含量有所變化,變化幅度不同。分析的12種元素中,H-L條件下4種元素含量較高,M-L條件下5種元素含量較高。其中大量元素K、Ca、Na在不同撫育之間存在顯著差異(P<0.05),K和Na元素含量變化較大。L-L條件下Na含量最高,H-L條件下K含量最高。微量元素中Cu、Fe、Sr、Zn在不同撫育條件下都存在極顯著差異,H-L條件下,Fe、Sr含量較高;M-L條件下僅Cu元素含量較高;L-L條件下Pb、Zn、Cd這三種微量元素含量較高。光照強度的不同靈芝子實體對元素的吸收不同,光照可能促進了K、Fe、Sr、As等元素的吸收。

表1 不同撫育條件下礦物質元素含量變化Table 1 Change of mineral elements in different tends of woods

3 討論

光是天然林更新中最重要的因素。光照對林下群落形態(tài)、植被的生長、森林環(huán)境的異質性等有重要的影響[24]。透光撫育是促進林業(yè)更替,保持持續(xù)發(fā)展的關鍵之舉,同時也是減少病蟲害和防止森林火災的重要手段[25]。林下作物的有效價值是檢測撫育質量的重要指標,靈芝作為代表性的藥用真菌,在本實驗中作為檢測森林透光撫育質量的最佳材料。靈芝生長對光照極為敏感,自然條件下靈芝子實體中有效成分與光照有直接關系,合理的透光撫育對于野生靈芝的栽培和生長具有重要的作用。

從4月到10月不同月份中透光孔隙度不同,導致了林內光環(huán)境的時空異質性。本實驗測定了不同撫育條件下靈芝有效成分的變化。其中M-L條件下靈芝多糖、三萜化合物和甾醇這三種有效成分的含量均最高,說明光照對靈芝子實體這三種成分的影響較大。靈芝蛋白質是除了靈芝多糖和三萜外,另一類重要的活性物質。靈芝蛋白具有獨特的免疫原性,在免疫調節(jié)和抗腫瘤病等方面效果顯著[26]。通過林下栽培的靈芝子實體中蛋白質含量高達19.52 mg·g-1,王紅梅等[27]對不同栽培品種的靈芝蛋白質進行測定發(fā)現(xiàn)蛋白含量最高14.09 mg·g-1,林下栽培的靈芝子實體中蛋白含量較人工栽培的最高菌株高5.43 mg·g-1。麥角甾醇是重要的生產黃體酮、氫化可的松、VD2等的前體物質,存在于絕大多數(shù)真菌細胞膜中,據(jù)研究麥角甾醇含量與真菌生物量存在相關關系,是真菌生物量的重要標志[28]。麥角甾醇作為靈芝子實體中主要的甾醇類成分對于研究靈芝中小分子酸性成分有著重要的研究意義[29]。據(jù)測定靈芝子實體中麥角甾醇含量與其他物質相比含量較少,但與其他食藥用菌相比,靈芝中麥角甾醇含量高很多。本研究中,隨著撫育程度的增加,靈芝子實體中麥角甾醇含量呈下降趨勢,弱度撫育條件下,麥角甾醇含量達到0.75 mg·g-1,較中度和強度撫育增加了0.4 mg·g-1。光照可能促進了麥角甾醇合成同時也促進了麥角甾醇作為前體物質合成黃體酮、氫化可的松、VD2等,致使子實體中麥角甾醇含量下降[30]。靈芝中礦物元素的含量對食療效果及中藥藥效影響很大,微量元素是人體機體的重要組成成分,可維持細胞的滲透壓與機體的酸堿平衡,參與體內的新陳代謝、生理、生化反應、能量轉換等多個過程[31]。不同人群可以根據(jù)不同癥狀適當采用靈芝補充所需元素,從而調節(jié)體內微量元素的平衡、緩解癥狀,達到食補或藥補的功效。不同撫育條件下,大量元素和微量元素的分布不同,光照促進了子實體吸收K元素,排出Na元素,同時促進了對微量元素Fe、Sr、As等的吸收,K元素可舒張血管,預防血管方面疾病,Fe具有良好的補血功能。強光撫育條件下的靈芝子實體礦物質元素分布可能更有利于人體對礦物質元素的吸收。

林下菌類作物的栽培作為一種新型栽培方式,不僅可以合理地利用林下富?？臻g而且菌類作物生長與植物根系形成互惠共生關系,有利于植物生長。在合理利用森林資源的同時,應注重科學發(fā)展、科學規(guī)劃,各系統(tǒng)同步發(fā)展,在保障森林健康持續(xù)發(fā)展前提下,充分配置森林相關系統(tǒng)資源,從而促進森林資源的可持續(xù)利用和菌類資源的仿野生化栽培,促進生態(tài)和諧。

參考文獻：

[1] Addo-Danso S D,Prescott.E,Smith A R.Methods for Estimating Root Biomass and Production in Forest and Woodl and Ecosystem Carbon Studies A Review [J].ForestEcologyandManagement,2016,359:332-351.DOI:.org/10.1016/j.foreco.2015.08.015.

[2] 李國棟,張俊華,陳聰,等.氣候變化背景下中國陸地生態(tài)系統(tǒng)碳儲量及碳通量研究進展[J].生態(tài)環(huán)境學報,2013,22(5):873-878.DOI:10.16258/j.cnki.1674-5906.2013.05.007.

[3] 李玉瓊.加快森林培育提高森林質量的對策[J].綠色科技,2017,1(5):78-79.DOI:10.16663/j.cnki.lskj. 2017. 05.036.

[4] Pan Y,Birdsey R A,Phillips O L,etal.The Structure,Distribution,and Biomass of the World’s Forests[J].AnnualReviewofEcologyEvolution&Systematics,2013,44(44):593.DOI:10.1146/annurev-ecolsys-110512-135914.

[5] Fenno L,Yizhar O,Deisseroth K.The Development and Application of Optogenetics.[J].AnnualReviewofNeuroscience,2011,34(January):389-412.DOI: 10.1146/annurev-neuro-061010-113817.

[6] 何先進.馬尾松人工林撫育間伐對林分生長及地力的影響[D].長沙：中南林業(yè)科技大學,2017.

[7] 李春義,馬履一,徐昕.撫育間伐對森林生物多樣性影響研究進展[J].世界林業(yè)研究,2006,19(6):27-32.DOI:10.13348/j.cnki.sjlyyj.2006.06.006.

[8] Fenno L,Yizhar O,Deisseroth K.The Development and Application of Optogenetics.[J].AnnualReviewofNeuroscience,2011,34(January):389-412.DOI: 10.1146/annurev-neuro-061010-113817.

[9] Gao Y,Zhou S,Jiang W,etal.Effects of Ganopoly?(A Ganodermalucidum Polysaccharide Extract) on the Immune Functions in Advanced Stage Cancer Patients[J].ImmunologicalInvestigations,2003,32(3):201-215.DOI:.org/10.1081/IMM-120022979.

[10] 楊錦生.靈芝主要化學成分及其藥理作用研究述評[J].中華中醫(yī)藥學刊,2012,4:906-907.DOI:10.13193/j.archtcm.2012.04.236.yangjsh.068.

[11] 劉高強,王曉玲.靈芝免疫調節(jié)和抗腫瘤作用的研究進展[J].菌物學報,2010,29(1):152-158.DOI:10.13346/j.mycosystema.2010.01.023.

[12] Castanedaacosta J,Cain A W,Fischer N H,etal.Extraction of Bioactive Sesquiterpene Lactones from Magnolia Grandiflora using Supercritical Carbon Dioxide and Near-critical Propane.[J].JAgricFoodChem,1995,43(1):63-68.DOI:10.1021/jf00049a013.

[13] Shiao M S.Natural Products of the Medicinal Fungus Ganoderma Lucidum:Occurrence,Biological Activities,and Pharmacological Functions[J].ChemicalRecord,2003,3(3):172-180.DOI:10.1002/tcr.10058.

[14] Feng J,Zhang J S,Jia W,etal.An Unstructured Kinetic Model for the Improvement of Triterpenes Production by Ganoderma Lucidum,G0119 based on Nitrogen Source Effect[J].Biotechnology&BioprocessEngineering,2014,19(4):727-732.DOI: 10.1007/s12257-014-0049-x.

[15] 衣艷君,徐承水.靈芝降血脂作用的實驗研究[J].安徽師范大學學報(自科版),2001,24(1):52-53.DOI:10.14182/j.cnki.1001-2443.2001.01.015.

[16] Chuan Q I,Zhou H,Jin-Ping S I,etal.Analysis of the Main Active Ingredients from Different Varieties of Ganodermalucidum[J].ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae,2012,2(1):92-95DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.17.054.

[17] Xue-Feng X U,Gui-Juan L I,Yan H,etal.Study on Isolation and Antioxidant Activity of the Polysaccharide from Ganoderma Lucidum[J].Food&Machinery,2017,33(1):143-147.DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.033.

[18] 龍飛躍,鐘軍華.靈芝成分及功能的研究現(xiàn)狀[J].中外交流,2016,2(34):101-108 DOI:10.3969/j.issn.1672-4321.2016.02.003.

[19] 李國華,李曄,梅錫玲,等.靈芝三萜類化合物研究進展[J].中草藥,2015,46(12):1858-1862.DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2015.12.028.

[20] 唐傳紅.中國栽培靈芝資源的遺傳多樣性評價[D].南京：南京農業(yè)大學,2004.

[21] 郭曉蕾,朱思潮,翟旭峰,等.硫酸蒽酮法與硫酸苯酚法測定靈芝多糖含量比較[J].中華中醫(yī)藥學刊,2010(9):2000-2002.DOI:10.13193/j.archtcm.2010.09.210.guoxl.062.

[22] 侯敏娜,劉劍.靈芝三萜的提取分離及總三萜的含量測定[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2010,24(5):70-71.DOI:10.13728/j.1673-6427.2010.05.032.

[23] 邢增濤,郁瓊花,張勁松,等.不同品種靈芝中三萜類化合物的比較研究[J].中藥材,2004,27(8):575-576.DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2004.08.014.

[24] 李永杰,李永泉,林隙透光撫育對紅松林結構穩(wěn)定性的影響[J].林業(yè)科技,2014,1(3):19-21.DOI:10.3969/j.issn.1001-9499.2014.03.006.

[25] 張?zhí)?朱玉杰,董希斌.撫育間伐對小興安嶺天然針闊混交次生林生境的影響[J].北京林業(yè)大學學報,2017,1(10):1-12.DOI:10.13332/j.1000-1522.20170187.

[26] Weng Y,Lu J,Xiang L,etal.Ganodermasides c and d,Two New Anti-aging Ergosterols from Spores of the Medicinal Mushroom Ganodermalucidum.Bioscience[J].Biotechnology&Biochemistry,2011,75(4):800-803.DOI:10.1271/bbb.100918.

[27] 王紅梅,王晨光,張圣龍,等.靈芝不同菌株子實體中蛋白質和多糖等化學組分含量的比較研究[J].上海農業(yè)學報,2013,29(3):10-13.DOI:10.3969/j.issn.1000-3924.2013.03.003.

[28] Yuan J P,Wang J H,Liu X,etal.Determination of Ergosterol in Ganoderma Spore Lipid from the Germinating Spores of Ganodermalucidum by High-performance Liquid Chromatography[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2006,54(17): 6172-6176.DOI: 10.1021/jf0617059.

[29] Weng Y,Xiang L,Matsuura,etal.Ganodermasides a and b,Two Novel Anti-aging Ergosterols from Spores of a Medicinal Mushroom Ganodermalucidum,on Yeast Via uth1[J].gene.Bioorganic&MedicinalChemistry,2010,18(3):999-1002.DOI: 10.1016/j.bmc.2009.12.070.

[30] Kalaras M D,Beelman R B,Holick M F,etal.Generation of Potentially Bioactive Ergosterol-derived Products Following Pulsed Ultraviolet Light Exposure of Mushrooms (Agaricusbisporus) [J].FoodChemistry,2012,135(2):396.DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.04.132.

[31] Fraga C G,Oteiza P I,Keen C L.Trace Elements and Human Health.Molecular[J].AspectsofMedicine,2005,26(4-5):233-234.DOI: 10.1016/j.mam.2005.07.014.