周菲,胡榮,劉晨杰,張婉瑩,陳廷貴,張立偉

(山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,山西 太原 030006)

0 引言

隨著人們生活水平的提高,肥胖已經(jīng)成為一個(gè)全球性公共健康問題。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前全球已有15億超重患者和5億肥胖患者,且肥胖所帶來的負(fù)面影響已經(jīng)超過酗酒和吸煙[1]。2013年6月,美國醫(yī)學(xué)協(xié)會正式將肥胖視作一種疾病[2]。過度肥胖會導(dǎo)致許多相關(guān)疾病,如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、膽囊疾病、骨關(guān)節(jié)炎、阻塞性睡眠呼吸暫停以及癌癥[3]。

胰脂肪酶(pancreatic lipase,PL)是由胰腺合成并分泌,是水解膳食脂肪最主要的酶,它負(fù)責(zé)50%～70%膳食脂肪的分解和消化[4],食物中的脂肪被PL水解為單酰甘油和游離脂肪酸后,在腸道被吸收,然后在體內(nèi)重新合成脂肪,造成脂肪堆積,最終可導(dǎo)致肥胖[5]。如果有有效物質(zhì)阻斷PL對脂肪的分解,機(jī)體對脂肪的吸收就會減少,從而可以預(yù)防肥胖或減輕肥胖患者體重。近年來,由于天然產(chǎn)物具有來源廣、成本低、副作用小等特點(diǎn),得到人們越來越多的關(guān)注。對天然產(chǎn)物中PL抑制劑的研究也甚為廣泛,如荷葉[6]、黃芩[7]、蕎麥[8]等。

連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)為木犀科連翹屬植物,分布于中國、韓國和日本等國[9]。我國山西、河南、陜西、河北等地均有分布。在民間,人們常采集連翹嫩葉加工為保健茶飲用。連翹果實(shí)為一年一結(jié),易受氣候等因素影響,而連翹葉資源豐富,且受氣候等條件影響較小,因而越來越多的學(xué)者開始注重連翹葉研究。連翹葉主要成分與連翹相似,都包含苷類、黃酮類、苯乙醇類、木脂素類等[10],具有保肝、護(hù)心、抑菌、抗氧化及抗衰老等作用[9-14]。2004年,侯改霞等發(fā)現(xiàn)連翹葉提取物具有降血脂作用[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,連翹葉中含有多種抑制PL活性成分,具有減肥可能性[15]。

中草藥通過炮制可消除或降低藥物毒副作用、改變藥性、提高療效。連翹葉進(jìn)行炮制,可使連翹葉中植物酶失活,使其有效成分不被水解,從而大大提高其藥用價(jià)值,但何種炮制方法可使連翹葉抑制PL活性更高呢?本實(shí)驗(yàn)采用4種不同方法對連翹葉進(jìn)行炮制,然后經(jīng)40%乙醇提取后比較粗提物抑制PL活性大小,再經(jīng)HPLC檢測、混合標(biāo)品比對、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制,對其粗提物進(jìn)行定性和定量分析,并通過相關(guān)分析,最終確定不同連翹葉炮制品抑酶活性差異產(chǎn)生原因。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

連翹葉,采于山西大學(xué)校園內(nèi),經(jīng)鑒定為木樨科植物連翹的葉子;PL、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自北京Solarbio;2,4-二硝基苯酚丁酸酯(PNPB)購自Sigma-Aldrich;二甲基亞砜(DMSO)購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、蘆丁、橙皮苷、牛蒡子苷元、連翹苷、山柰酚3-O-蕓香糖苷、連翹脂素均購自上海源葉生物科技有限公司;甲醇為色譜純,水為純凈水,其他試劑均為分析純。

GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SENCO R50旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申生科技儀器有限公司;SHZ-C 型循環(huán)水式多用真空泵,鞏義市英峪予華儀器廠;Scientz-12N 真空冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;SpectraMax190 酶標(biāo)儀,美國 Molecular Devices 公司;DELTA 320 pH 計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司;Agilent 1200 型高效液相色譜儀,美國 Agilent 公司;C18 色譜柱(4.6mm×250mm, 5μm),Thermo Scientific 科技中國公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 四種連翹葉炮制品的制備

前期研究表明,連翹葉無水乙醇提取物抑制PL活性最高,但鑒于大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的成本,以及無水乙醇提取時(shí)相應(yīng)葉綠素含量也增多,進(jìn)而需用石油醚去除葉綠素等帶來的繁瑣工藝,本文選用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇進(jìn)行提取。具體流程見下:

2.2 抑酶活性測定

2.2.1 Tris-HCl緩沖溶液的配制

精確稱取6.057 g Tris-HCl,再用HCl將溶液調(diào)到pH=8.0,用蒸餾水定容至500 mL。

2.2.2 連翹葉粗提取物溶液的配制

準(zhǔn)確稱取干燥連翹葉提取物0.1 g于1.5 mL離心管中,溶于1 mL DMSO溶液中,充分溶解后得1 mL 0.1 g/mL連翹提取物的母液,實(shí)驗(yàn)時(shí)在反應(yīng)體系中加入20μL連翹葉提取物溶液,得濃度為2 000 μg/mL粗提物溶液。

2.2.3 PL溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5 mg PL,溶于10 mLTris-HCl(pH=8.0)緩沖液,振蕩,充分溶解,即得0.5 mg/mL PL溶液。現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.4 PNPB溶液的配制

準(zhǔn)確移取PNPB 11 μL,加5 mL乙腈,即得濃度為12 mmol PNPB溶液,作為底物。

2.2.5 PL活力檢測

準(zhǔn)確移取100 μL PL溶液于1.5 mL離心管中,加入20 μL連翹葉粗提物溶液,用Tris-HCl緩沖液定容至900 μL,充分搖勻。反應(yīng)體系中以不加入酶溶液作為空白,以不加入粗提物作為正常組。分別點(diǎn)入96孔板,每個(gè)溶液設(shè)4個(gè)復(fù)孔,37℃下孵育15 min,立即加入20 μL PNPB溶液,用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。檢測波長為400 nm,每3 min 測定一個(gè)點(diǎn),測定15 min,記錄數(shù)據(jù),計(jì)算吸光度隨時(shí)間的變化率K。根據(jù)如下公式計(jì)算抑制率。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次。

抑制率(%)=(K正常組-K實(shí)驗(yàn)組)/K正常組×100%

2.2.6 各炮制品醇提物HPLC分析

取50 mg連翹葉粗提物于1.5 mL離心管中,加入1 mL 40% 乙醇溶液振蕩混勻,用針筒式濾膜過濾器將溶液過濾到玻璃瓶中,進(jìn)行HPLC分析。

HPLC檢測條件:用C18色譜柱進(jìn)行分離,檢測波長270 nm柱溫25℃,流速0.8 mL/min,流動相為甲醇(A)和0.3%醋酸水溶液(B),梯度洗脫:0～8 min,30%～33%A;8～24 min,33%～40% A;24～39 min,40%～48%A;3 955 min,48%～64% A。

3 結(jié)果與討論

3.1 連翹葉不同炮制品重量變化與40%乙醇提取結(jié)果

結(jié)果見表1。從表中可看出,自然陰干后炮制品干重最大,這主要是由于陰干不會使任何成分丟失,而烘干可使葉表面蠟質(zhì)受熱而減少,葉內(nèi)揮發(fā)性成分減少,煮和蒸時(shí),由于葉與水接觸,可使葉中部分成分流失(包括親水性的次級代謝產(chǎn)物、蛋白及糖類等)。從表中還可看出,自然陰干炮制品提取率也最高,這主要是本實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間較長,且提取兩次,凡可提取出的成分大多已提取完畢,而煮、蒸和烘干在炮制過程中的成分損失,造成該三種炮制品在提取時(shí)提取率降低。

表1 連翹葉不同炮制品重量變化與40%乙醇提取結(jié)果Table 1 Weight changes of different processed F. suspensa leaves and results after 40% ethanol extraction

3.2 不同炮制品提取物抑制PL活性測定

結(jié)果見圖1。可以看出,不同炮制品抑制PL活性從高到低依次為烘干炮制品、煮后陰干炮制品、蒸后陰干炮制品和自然陰干炮制品。這是由于烘干時(shí)植物酶完全失活,抑制PL活性成分不被分解,使得抑制PL活性最高。煮后陰干時(shí),連翹葉受熱均勻,植物酶也完全失活,有效成分未被降解,雖然有較多有效成分會隨水分流失,但抑制PL活性仍較高。蒸后陰干時(shí)上、中和下層連翹葉受熱不勻,連翹葉植物酶部分失活,進(jìn)而造成抑制PL活性成分有所降解,同時(shí)還有少量有效成分會隨水分流失,而陰干炮制品雖成分未流失,但由于植物酶完全未失活,有效成分降解較多,最終導(dǎo)致自然陰干和蒸后陰干生物活性接近,抑酶活性都較低?？傊?植物酶失活與否影響最大,有效成分揮發(fā)或隨水分流失影響次之。

Fig.1 Comparison of inhibitive rateof alcohol extracts from different processed products of F. suspensa leaves on PL圖1 連翹葉不同炮制品乙醇提取物抑制PL活性比較

3.3 各炮制品醇提物HPLC分析

3.3.1 HPLC定性分析

與混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對,不同炮制品醇提物中各成分指紋圖譜見圖2。

1.chlorogenic acid; 2. caffeic acid; 3. forsythiaside A; 4. rutin; 5. hesperidin;6. kaempferol-3-O-rutinoside; 7. phillyrin; 8. arctigenin; 9.phillygenin;Fig.2 HPLC chromatograms of different processed samples and standard mixture圖2 不同炮制品醇提物以及混合標(biāo)品指紋圖譜

從圖2可看出:連翹葉各炮制品中包含有綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、盧丁、橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、連翹苷和連翹脂素,未檢測到牛蒡子苷元。

3.3.2 HPLC定量分析

以各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),HPLC峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如表2所示。

從表2可看出,各標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。依據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線,不同月份連翹葉中各成分含量見表3。

從表中可看出,四種炮制品中含量差異最大的為連翹苷和連翹酯素,連翹苷最高含量是最低含量的3.55倍,連翹酯素為3.81倍。這主要是由于連翹苷易被氧化[16],在采用電熱鼓風(fēng)烘箱烘干連翹葉時(shí),連翹苷更是損失最大,而連翹苷對PL起促進(jìn)作用,連翹苷的減少意味著烘干連翹葉炮制品抑制PL活性的增加。連翹酯素雖對PL活性幾乎無影響,但含量變化原因有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。

表2 各標(biāo)準(zhǔn)品含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of each standard substance

表3 連翹葉不同炮制品中各成分含量Table 3 Component contents of different processed products of F. suspensaleaves

3.4 各標(biāo)準(zhǔn)品對PL的IC50測定

各標(biāo)準(zhǔn)品IC50測定結(jié)果見圖3。

Fig.3 IC50 of five standard substances on pancreatic lipase圖3 各標(biāo)準(zhǔn)品對PL抑制的IC50曲線

從圖中可看出,各成分對PL抑制活性依次為:山柰酚-3-O-蕓香糖苷>橙皮苷>蘆丁>咖啡酸>連翹酯苷A。連翹苷對PL表現(xiàn)為促進(jìn)作用,而連翹脂素對PL幾乎沒有抑制作用,圖略。

各炮制品提取物抑酶活性與指認(rèn)的各成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見表4。

從表中可看出,咖啡酸、蘆丁和連翹苷含量與各炮制品醇提物抑制PL活性相關(guān)系數(shù)絕對值均在0.9以上,表明該三種成分的含量對連翹葉炮制品抑酶活性有較大影響。其中,咖啡酸和蘆丁相關(guān)系數(shù)為正值,表明炮制品中咖啡酸和蘆丁含量越大,炮制品抑酶活性越大;相反,連翹苷相關(guān)系數(shù)為負(fù),表明炮制品中連翹苷含量越大,炮制品對PL抑制作用越小。連翹脂素相關(guān)系數(shù)最小,表明連翹脂素含量與炮制品抑酶活性無明顯相關(guān)性,這與連翹脂素幾乎沒有抑制PL活性相吻合。

總之,炮制方式影響中草藥各成分含量及藥效機(jī)制非常復(fù)雜,本文綜合上述各實(shí)驗(yàn)結(jié)果,淺析如下:陰干和蒸后陰干時(shí),由于植物酶未失活或未完全失活,連翹葉中主要抑制PL活性成分咖啡酸和蘆丁含量較低,而促進(jìn)PL活性的連翹苷含量較高,因此,兩種炮制品抑制PL活性均較低。煮后陰干連翹葉中由于連翹苷在高溫時(shí)較穩(wěn)定[16],其含量與前兩種炮制品相近,但植物酶完全失活,咖啡酸和蘆丁含量有所增多,因此該炮制品抑制PL活性較陰干和蒸后陰干炮制品有所升高。烘干炮制品中,植物酶完全失活,咖啡酸和蘆丁含量較高,又由于促PL作用連翹苷易氧化,含量大幅降低,兩因素共同導(dǎo)致烘干炮制品抑制PL活性最高。

4 結(jié)論

本論文以連翹葉為研究對象,經(jīng)不同方法進(jìn)行炮制后,比較其抑制PL活性,然后通過定性、定量和相關(guān)性分析分析產(chǎn)生差異的原因。

(1)各炮制品中,自然陰干干重最大,水煮后陰干干重最小。

(2)各炮制品中,陰干炮制品40%乙醇提取率最高,烘干最低。

(3)各炮制品中,烘干連翹葉抑制PL活性>煮后陰干>蒸后陰干>自然陰干。

(4)各炮制品中,都包含有綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、蘆丁、橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、連翹苷、連翹脂素八種成分。

(5)各炮制品中,連翹酯苷A和連翹苷含量最高,蘆丁次之,咖啡酸、綠原酸、橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、連翹脂素含量相對較低。

(6)各成分中,山柰酚-3-O-蕓香糖苷抑酶活性最高,連翹酯苷A活性最低,連翹脂素基本無抑酶活性,而連翹苷對PL有促進(jìn)作用。

(7)連翹葉炮制品中,對其抑制PL活性影響最大成分為咖啡酸、蘆丁和連翹苷。其中咖啡酸和蘆丁含量與抑酶活性呈正相關(guān),而連翹苷含量與抑酶活性呈負(fù)相關(guān)。

(8)總之,四種炮制品抑制PL活性差異是由植物酶失活與否和連翹苷氧化與否兩因素共同決定。烘干時(shí)植物酶完全失活,該炮制品較其他三種炮制品,抑PL成分咖啡酸、蘆丁含量較多,而促PL成分連翹苷60℃且鼓風(fēng)烘干時(shí)易氧化而使含量顯著降低,兩因素共同導(dǎo)致烘干連翹葉炮制品具有最高抑酶活性。

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