張芳 楊博 杜莉 姜學(xué)鈞

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院耳鼻咽喉科（沈陽110032）；2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（沈陽110001）

喉癌是人類頭頸部常見的惡性腫瘤［1］，臨床治療方式主要包括放療和化療［2?3］，但治療產(chǎn)生的毒副作用嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量且預(yù)后不佳，目前缺乏針對(duì)喉癌的有效靶向藥物。因此，有必要研究喉癌發(fā)生過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。蛋白激酶2（CK2）是真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶，全酶為一異構(gòu)四聚體，是由2個(gè)催化亞基（α或α′）和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基（β）構(gòu)成，現(xiàn)已明確的底物有300余種［4］。在頭頸部惡性腫瘤、肺癌、消化系統(tǒng)腫瘤、男性泌尿生殖系瘤、女性生殖系統(tǒng)腫瘤、惡性黑色素瘤、血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，CK2的表達(dá)水平和活性明顯增高，不僅與腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散能力、癌癥預(yù)后相關(guān)，還反映其病理生理學(xué)特征［5］。然而，CK2α對(duì)人類喉癌發(fā)展的相關(guān)精確調(diào)節(jié)機(jī)制仍未明確。

研究顯示，上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial mes?enchymal transition，EMT）過程的發(fā)生在腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤中扮演了重要角色。ZOU等［6］的研究表明在大腸癌組織中CK2α的表達(dá)升高，可以通過調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，筆者通過短發(fā)卡RNA（shRNA）介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，利用Hep?2細(xì)胞研究CK2α在喉癌發(fā)病機(jī)制中的角色，以探討CK2α對(duì)喉癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人喉癌Hep?2細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所（ACTT，Manassas，VA，USA）。

1.1.2 主要儀器及試劑 Transwell小室（美國Corning公司）；Matrigel膠（美國BD公司）；Eagle培養(yǎng)基和胎牛血清（美國GIBCO公司）；G418、Lipo?fectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；RNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；IX71光學(xué)顯微鏡和DP70數(shù)字照相機(jī)（日本Olympus公司）；西式蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)（美國Millipore公司）；NP?40裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）β?actin，CK2α，上皮鈣黏蛋白E?cadherin，snail，slug，vimentin，twist抗體均來自圣克魯斯生物技術(shù)，pGCsi?H1?CK2α、pGCsi?H1?control質(zhì)粒由沈陽萬類生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人喉癌Hep?2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素經(jīng)Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 根據(jù)GenBank報(bào)道的蛋白激酶CK2α的核苷酸序列（No.NM 177560.2）和shRNA設(shè)計(jì)原則，HindIII和BamHI酶切pGCsi?H1 質(zhì)粒載體（pGCsi?H1?CK2α），其序列信息如下：正義鏈：gatccccACT?GCTGCGATATGAC?CACttcaagagaGTGGTCATATCGCAGCAGTttttt；反 義鏈：agctaaaaaACTGCTGCGATATGACCACtctcttgaaGT GGT?CATATCGCAGCAGTggg。亂序shRNA也被合成并亞克隆進(jìn)入pGCsi?H1載體，構(gòu)建陰性對(duì)照質(zhì)粒（pGCsi?H1?control）。重組體載體的準(zhǔn)確性通過嚴(yán)格的酶分析法及測(cè)序來確定。

為獲取喉癌細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)CK2α shRNA，將Hep?2細(xì)胞接種于6孔板中，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×105，培養(yǎng)24 h，其融合達(dá)70%時(shí)用Lipo?fectamineTM2000?分別轉(zhuǎn)染 pGCsi?H1?CK2α、pGCsi?H1?control質(zhì)粒，具體操作按說明書進(jìn)行。用G418（600 g/mL）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將獲得的克隆細(xì)胞保存于含G418（350 g/mL）的介質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)分為3組：未轉(zhuǎn)染組（parental）、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（pGCsi?H1?control）和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（pGCsi?H1?CK2α）。

1.2.3 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)CK2α表達(dá) 使用總RNA試劑盒提取總RNA，并溶解于無RNA酶的水中。純化RNA的A260/A280比值在1.6～1.8之間。使用超級(jí)M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（BioTeke，Beijing，China）將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用ExicyclerTM 96檢測(cè)CK2α的蛋白表達(dá)及 mRNA 表達(dá)水平并利用 2?ΔΔCT（Livak and Schmittgen，2001）分析相應(yīng)的數(shù)據(jù)，以β?actin（肌動(dòng)蛋白）為內(nèi)參照。定量實(shí)時(shí)PCR所用引物如下：CK2α正義鏈：5?CCTGGATTATTGTCACAGCA?3；反義鏈：5?AAGTATCGGGAAGCAACTCG?3；β?actin正義鏈：5?CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG?3；反義鏈：CTGTCACCTTCAC?CGTTCCAGTTT。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 將轉(zhuǎn)染后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系及對(duì)照細(xì)胞系調(diào)整細(xì)胞密度接種于孔板內(nèi)，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞孔板取出，置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞遷移和侵襲評(píng)估 采用包含8 μm細(xì)孔的聚碳酸酯濾器Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲。在遷移分析中，上室平鋪1×104懸浮于200 μL無DMEM介質(zhì)血清中的細(xì)胞，下室填滿完全培養(yǎng)基。侵襲實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞加入上室鋪20 μL Matrigel膠（1 mg/mL）并在37℃下孵育2 h。24 h后，輕柔吸出室內(nèi)的介質(zhì)，使用棉拭子去掉過濾器上層面的細(xì)胞或Matrigel。過濾器下層的細(xì)胞固定于4%的多聚甲醛中20 min并用蘇木精染色3 min。用IX71光學(xué)顯微鏡（200×）計(jì)數(shù)小室中5個(gè)隨機(jī)區(qū)域內(nèi)遷移及侵襲的細(xì)胞數(shù)目，使用DP70數(shù)字照相機(jī)照相，并記錄平均值。

1.2.6 免疫蛋白印跡（Western blot）檢測(cè)E?cad?herin、vimentin及轉(zhuǎn)錄因子slug、snail的表達(dá) 使用NP?40裂解液從細(xì)胞中提取蛋白，將等量的蛋白標(biāo)本溶解于十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）分離并且遷移至氟聚偏乙烯（PVDF）膜，加適當(dāng)?shù)目贵w（β?actin，CK2α，上皮鈣黏蛋白 E?cadherin，snail，slug，vimentin，twist）、4℃過夜。然后清洗并加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育。使用西式蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用±s表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用t檢驗(yàn)分析兩組間差異，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA介導(dǎo)的Hep?2細(xì)胞中穩(wěn)定敲低了CK2α 與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CK2α蛋白表達(dá)顯著下降了77%（圖1A，P＜0.001）；CK2α mRNA的表達(dá)下降了78%（P＜0.001，圖1B）。這些結(jié)果說明，針對(duì)CK2α的干擾質(zhì)粒能夠有效抑制Hep?2細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄控制及翻譯水平CK2α的表達(dá)。

2.2 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的上皮極性未喪失 相差顯微鏡下觀察顯示與parental組相比，轉(zhuǎn)染pGC?si?H1?control與pGCsi?H1?CK2α后的細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生明顯的變化。細(xì)胞排列緊密，形態(tài)主要為三角形以及多邊形的上皮細(xì)胞形態(tài)，僅有少數(shù)變得狹長，細(xì)胞的上皮極性并未大量喪失（圖2）。

圖1 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中CK2α的表達(dá)抑制Fig.1 Inhibition of CK2α expression in plasmid transfection group（n=3）

圖2 顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)Fig.2 Microscopic observation of cell morphology

2.3 穩(wěn)定抑制了CK2α減弱了Hep?2細(xì)胞的遷移和侵襲 用Transwell試驗(yàn)檢測(cè)Hep?2細(xì)胞的遷移和侵襲能力，如圖3A所示，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，抑制內(nèi)源性CK2α的表達(dá)，遷移的細(xì)胞幾乎減半（P＜0.001）。在干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，也觀測(cè)到了侵襲相似細(xì)胞數(shù)目的下降（P＜0.001，圖3B，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比）。以上結(jié)果說明，敲除CK2α降低了試管內(nèi)人喉癌的遷移和侵襲能力。Transwell實(shí)驗(yàn)分別使用無膠包被和有matrigel膠（基質(zhì)膠）包被的小室，以測(cè)量CK2α抑制對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。在干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的喉癌細(xì)胞中，Hep?2細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)目均顯著下降（n=5，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，P＜0.001。圖中刻度條 =100 μmol/L）。

2.4 穩(wěn)定敲除了CK2α的表達(dá)增加了Hep?2細(xì)胞中E?cadherin的表達(dá)但是減低了vimentin的表達(dá) 癌在發(fā)生、進(jìn)展過程中失去了絕大部分的上皮特征，而且不同癌癥細(xì)胞系在試管內(nèi)經(jīng)歷了部分或完全的EMT。因此，我們通過檢測(cè)EMT相關(guān)因子的表達(dá)來測(cè)試CK2α在Hep?2細(xì)胞EMT過程中的作用。結(jié)果說明，在CK2α耗盡的細(xì)胞中，E?cadherin、上皮標(biāo)記物蛋白表達(dá)顯著增加（圖4，P＜0.01，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比）；反之，snail、slug和E?cadherin特異性轉(zhuǎn)錄抑制體的表達(dá)下降（圖4，P＜0.001，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比）。當(dāng)CK2α下調(diào)時(shí)，vimentin蛋白（間葉細(xì)胞特征性蛋白）水平在下降（圖4，P＜0.05，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比）。以上結(jié)果說明，穩(wěn)定敲除CK2α的表達(dá)通過調(diào)節(jié)EMT過程相關(guān)因子的表達(dá)來抑制人喉癌EMT的發(fā)生。

圖3 穩(wěn)定敲除CK2α減低了Hep?2細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.3 Stable knockout of CK2α reduces Hep?2 cell migration and invasion

圖4 各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化Fig.4 Changes of EMT related protein expression in each group of cells

3 討論

本研究通過使用shRNA介導(dǎo)的RNA干擾作用，探討了CK2α對(duì)人喉癌的影響。首先確定CK2α特異干擾質(zhì)粒能夠有效抑制Hep?2細(xì)胞中內(nèi)源性CK2α在轉(zhuǎn)錄控制及翻譯水平的表達(dá)，提供了進(jìn)一步研究的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Transwell實(shí)驗(yàn)研究顯示，CK2α干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能顯著抑制喉癌細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移。

EMT是指上皮細(xì)胞在特定的情況下通過特定程序向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，在腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲過程中扮演著重要的角色，是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要因素之一。在癌癥發(fā)展過程中，EMT促使上皮細(xì)胞失去其顯型并導(dǎo)致間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且可以從原發(fā)瘤播散［7?10］。因此，研究EMT 過程的發(fā)生機(jī)制可以對(duì)惡性浸潤腫瘤治療提供新的治療靶點(diǎn)。

CK2α過表達(dá)能活化小鼠乳腺的EMT，因此導(dǎo)致雌性乳腺的數(shù)目增生及發(fā)育障礙［5］。另一方面，CK2α抑制劑CX?4945阻止了轉(zhuǎn)化生長因子be?ta?1（TGF?β1）誘發(fā)人肺腺癌細(xì)胞的EMT［11］。以上兩點(diǎn)說明，CK2α可能通過調(diào)整EMT進(jìn)程促進(jìn)癌癥發(fā)生。然而CK2α是否通過調(diào)節(jié)EMT而參與喉癌仍未明確。為了進(jìn)一步檢測(cè)RNAi表達(dá)載體介導(dǎo)的CK2α沉默對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移能力的影響，筆者檢測(cè)了普通Hep?2細(xì)胞和針對(duì)CK2α的干擾質(zhì)粒作用后的EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，包括E?cadherin、slug、snail和vimentin。E?cadherin是存在于正常上皮細(xì)胞中的一種鈣依賴性細(xì)胞黏附分子，有利于維持細(xì)胞上皮極性和完整性［12?13］。E?cadherin的減少使細(xì)胞間的黏附性減弱，癌細(xì)胞易發(fā)生脫落而發(fā)生癌轉(zhuǎn)移［14］。E?cadherin表達(dá)的降低是EMT過程發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Vimentin首次發(fā)現(xiàn)于間充質(zhì)細(xì)胞中，具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)與組織完整的作用，與癌癥的侵襲表型顯著相關(guān)［15］。Snail能與 E?cad?herin結(jié)合，下調(diào)E?cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT過程的發(fā)生與腫瘤轉(zhuǎn)移［16］。Slug作為Snail家族中的一員，含有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，同樣能夠通過下調(diào)E?cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT過程的發(fā)生［17］。本研究中，在Hep?2細(xì)胞中抑制CK2α，增加了E?cadherin的表達(dá)，然而卻降低了slug、snail和vimentin的表達(dá)，這表明敲除CK2α通過抑制EMT過程來減低體外實(shí)驗(yàn)中喉癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

本研究提供的證據(jù)說明，穩(wěn)定敲低CK2α抑制了人喉癌細(xì)胞的遷移和侵襲。CK2α可以考慮作為喉癌發(fā)生過程中一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)的候選靶點(diǎn)。

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