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靈武長棗果實(shí)多糖中單糖組成分析

2018-05-17 04:15:15章英才柴雅紅曹金霞
關(guān)鍵詞:阿拉伯糖靈武鼠李糖

章英才,柴雅紅,曹金霞

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 寧夏 銀川 750021)

靈武長棗(ZiziphusjujubaMill cv. Lingwuchangzao)為鼠李科棗屬落葉果樹,中國獨(dú)有,寧夏特產(chǎn),原產(chǎn)于寧夏回族自治區(qū)靈武市,已有800年的栽培歷史,是棗(ZiziphusjujubaMill.)中一個較優(yōu)良的、經(jīng)過多年自然篩選、具有寧夏地方特色的藥食同源鮮果品種,抗寒、耐鹽堿、耐高溫和干旱[1]。具有較高的食用價值、藥用價值[2],含有多種礦物質(zhì)元素以及維生素、萜類和糖類[3],被譽(yù)為“果中瑰寶”。棗果素以含糖量高著稱,其中長棗多糖是靈武長棗中最重要的藥用生物活性成分之一,靈武長棗多糖具有抗氧化,抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)有機(jī)體免疫力等的生物活性[4-6]。糖分高低對靈武長棗品質(zhì)有重要的影響,長棗多糖含量越高,藥用品質(zhì)越好。因此,果實(shí)多糖在靈武長棗綜合品質(zhì)形成中占有十分重要的地位,明確果實(shí)多糖含量變化規(guī)律及其單糖組成成分顯得尤為重要。據(jù)文獻(xiàn)報道,棗中糖類的含量極為豐富,棗果中的糖包括葡萄糖、果糖、低聚糖、多糖等[7]。功能性多糖和低聚糖因具有多種生理活性,成為當(dāng)前糖類研究的熱點(diǎn)。多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等多種生物學(xué)功效[8],其積累程度對果實(shí)品質(zhì)具有重要的影響[9],因而多糖結(jié)構(gòu)的研究一直是多糖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)[10]。而多糖糖鏈的一級結(jié)構(gòu)與其活性密切相關(guān),一級結(jié)構(gòu)的研究主要體現(xiàn)在組成多糖的單糖種類及各單糖的組成比例,因此,明確多糖的單糖組成對控制多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及研究棗多糖活性具有重要意義[11]。

靈武長棗不僅是鹽堿地和沙荒地種植的先鋒樹種,同時又是一種高效的藥用植物資源,特殊的生長環(huán)境孕育了靈武長棗優(yōu)良的品質(zhì)。近年來,在靈武長棗鮮果保鮮、生理變化、栽培技術(shù)、品種選育等領(lǐng)域已有深入的研究[12-14],而有關(guān)靈武長棗多糖的研究僅限于棗果實(shí)中多糖的分離提取[6]、理化性質(zhì)分析[15],多糖含量及變化規(guī)律[16-17]等方面,有關(guān)靈武長棗果實(shí)多糖中單糖成分分析方面尚缺乏系統(tǒng)研究,而揭示多糖的單糖組成對控制多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及研究棗多糖活性等都具有重要意義。因此,本研究以寧夏地區(qū)特色鮮果品種靈武長棗為材料,應(yīng)用熱水浸提法、分光光度法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等,分別對不同發(fā)育時期的靈武長棗果實(shí)進(jìn)行多糖提取及單糖成分分析研究,系統(tǒng)分析不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)多糖中單糖的成分,為進(jìn)一步提高靈武長棗有效成分含量等生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù),為科學(xué)調(diào)控果實(shí)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

在寧夏紅棗工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地選擇生長發(fā)育良好、樹勢健壯、長勢相似和花期相近、栽培管理水平一致的6年生普通型靈武長棗為供試材料,隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計,3次重復(fù),于6月10日選擇同期開放的花朵分別用4種不同顏色的毛線標(biāo)記。

在靈武長棗開花坐果到果實(shí)成熟的發(fā)育過程中共取樣4次,具體分別在果實(shí)膨大前期(7月10日)、果實(shí)快速膨大期(8月9日)、果實(shí)著色期(9月8日)、果實(shí)完熟期(9月28日),每次采樣時間均設(shè)定于上午9∶00—11∶00進(jìn)行,按所標(biāo)記植株從樹冠的東、西、南、北四個方向以及上、中、下、里、外各個方向采取無病蟲害的果實(shí)各500 g,所采樣品放入取樣箱帶回實(shí)驗(yàn)室,45℃烘干至恒重,粉碎,過60目篩,備用。

2 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

索氏提取器、TGL-16G臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、SBS-Z100數(shù)控計滴自動部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)、YZ1515X恒流泵(保定蘭格恒流泵有限公司)、色譜柱(上海琪特儀器有限公司)、722N可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、DZF-6021真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、FD-4中型冷凍干燥器(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司GCMS-QP2010)、紫外可見分光光度計(日本島津公司UV-2450)。

2.2 實(shí)驗(yàn)藥品

三甲基氯硅烷為色譜純,其它均試劑為分析純。DEAE-52纖維素產(chǎn)自Whatman公司、TOYOPEARL HW-55S凝膠樹脂產(chǎn)自日本TOSOH公司。標(biāo)準(zhǔn)單糖:葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖均為高級純,鼠李糖、甘露糖、木糖均為生化試劑,本實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)粗多糖的提取

參照何進(jìn)[18]等的方法,略有改動。具體步驟:精確稱取15 g棗粉放入濾紙筒中,將濾紙筒置于索氏提取器中,加入100 mL石油醚, 80℃回流脫脂8 h。將殘?jiān)糜谇蛐卫淠苤?,?0%乙醇85℃冷凝回流2次,75 mL每次,每次2 h,除去小分子糖。然后將過濾后的殘?jiān)儆梅兴崛?次,每次加水50 mL,第一次1.5 h,后兩次分別1 h,每次提取后3 000 r·min-1離心10 min,合并上清液,上清液經(jīng)40℃真空濃縮至體積約為50 mL,加入1/4濃縮液體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4∶1),渦旋混合30 min,再3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,除去蛋白質(zhì),此步驟重復(fù)8次;除去蛋白后的濃縮液加入4倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉,置于4℃冰箱中過夜,濾紙過濾,再依次用50 mL 95%的乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀,最后將其置于50℃鼓風(fēng)恒溫干燥箱干燥,得粗多糖。

3.2 不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)粗多糖的分離純化

3.2.1 靈武長棗果實(shí)粗多糖分級 將DEAE-52纖維素預(yù)處理、裝柱,然后取粗多糖60 mg,配成濃度為6 mg·mL-1的多糖溶液,過濾后,加樣至DEAE-52纖維素柱床,分別用超純水、0.1、0.2、0.3 mol·L-1NaCl洗脫各級分,流速1.0 mL·min-1,自動部分收集器收集洗脫液,5 mL·管-1,苯酚-硫酸法檢測多糖中多糖含量,以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),作DEAE-52纖維素色譜柱洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線分別合并各主峰收集管液,定容至200 mL,檢測每一個級分的多糖含量,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃真空濃縮,濃縮液經(jīng)超純水流水透析48 h,再改用靜置透析24 h,每4 h更換一次超純水,透析完成后收集透析袋內(nèi)的多糖溶液,真空濃縮,冷凍干燥,得到各多糖級分。

3.2.2 靈武長棗果實(shí)多糖級分純化 將TOYOPEARL HW-55S填料進(jìn)行預(yù)處理后裝柱與平衡。然后將上述冷凍干燥的多糖各級分分別溶于2 mL超純水中,用一次性滴管把多糖溶液加到HW-55S柱床表面,用0.2 mol·L-1NaCl溶液洗脫,流速0.5 mL·min-1,收集洗脫液,4 mL·管-1,苯酚-硫酸法檢測每管多糖中多糖含量,以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),作HW-55S色譜柱洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線收集主峰管液,定容至50 mL,檢測多糖含量,按3.2.1中方法,濃縮、透析、冷凍干燥,得到果實(shí)精制多糖。

3.3 靈武長棗精制多糖純度鑒定

3.3.1 紫外-可見分光光度法監(jiān)測 將上述精制多糖配成濃度為0.1 mg·mL-1的多糖溶液,用紫外可見分光光度計于190~900 nm波長區(qū)間內(nèi)進(jìn)行全波段掃描,觀察在260 nm、280 nm處有無吸收峰。

3.3.2 凝膠色譜純度鑒定 將每個多糖級分經(jīng)HW-55S柱純化,作洗脫曲線,觀察峰型。

3.4 不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)精制多糖中單糖組成分析

3.4.1 精制多糖的GC-MS分析

(1) 果實(shí)精制多糖的水解

精確稱取果實(shí)精制多糖4 mg于反應(yīng)釜中,加入0.4 mL 2 mol·L-1的三氟乙酸(TFA),置于烘箱內(nèi)110℃水解3 h,冷卻至室溫,放入真空干燥箱中70℃減壓干燥。

(2) 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定方法及條件

將水解干燥后的靈武長棗果實(shí)精制多糖加入0.4 mL吡啶,迅速加入0.08 mL三甲基氯硅烷和0.16 mL六甲基二硅胺烷,注意操作要迅速,防止空氣中水分的進(jìn)入。振蕩待其充分溶解后,于50℃恒溫干燥箱中反應(yīng)40 min,冷卻至室溫,用0.45 μm微孔濾膜過濾后,濾液4 000 r·min-1離心10 min,取上清液稀釋后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定,進(jìn)樣量為0.1 μL。

氣相色譜條件:色譜柱DB-5MS(3 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度250℃,接口溫度250℃,載氣為氦氣,柱壓73.0 kPa,柱流量1.00 mL·min-1,分流比50∶1,程序升溫從100℃保持2 min,以10 ℃·min-1升至260℃,保留10 min。

質(zhì)譜條件:離子源溫度200℃,M/Z范圍35~800。

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制不同質(zhì)量濃度的各標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液,衍生及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定方法同3.4.1。以標(biāo)準(zhǔn)單糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.4.3 精制多糖中單糖組成的定性與定量 通過將多糖各級分中單糖的出峰時間與各種標(biāo)準(zhǔn)單糖的出峰時間對照,及NIST譜庫對照,對多糖各級分組成進(jìn)行定性分析。本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法對多糖各組分中的阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖進(jìn)行定量分析,根據(jù)各單糖的回歸方程計算出多糖中單糖的含量。

外標(biāo)法定量計算公式如下:

W=C×V

式中,W為單糖質(zhì)量,C為帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的單糖濃度,V為稀釋后體積。

由于單糖標(biāo)品種類的限制,根據(jù)NIST譜庫對照,對核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸進(jìn)行初步定性分析。

4 結(jié)果與分析

4.1 粗多糖的提取

不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)粗多糖的提取得率分別為:膨大前期0.778%,快速膨大期0.865%,著色期0.983%,完熟期1.795%。

4.2 不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)粗多糖的分離純化

4.2.1 果實(shí)粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析的分級結(jié)果 由圖1知,不同時期果實(shí)多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析時,洗脫效果都比較好,Ju-0、Ju-1、Ju-2、Ju-3得到較好的分離。

將各時期的4個組分分別標(biāo)記為Ju-0、Ju-1、Ju-2、Ju-3:膨大前期(EB-Ju-0、EB-Ju-1、EB-Ju-2、EB-Ju-3)、快速膨大期(RE-Ju-0、RE-Ju-1、RE-Ju-2、RE-Ju-3)、著色期(C-Ju-0、C-Ju-1、C-Ju-2、C-Ju-3)、完熟期(M-Ju-0、M-Ju-1、M-Ju-2、M-Ju-3)。

由表1可知,不同時期靈武長棗果實(shí)4個多糖組分中Ju-2經(jīng)DEAE-52纖維素色譜柱分離純化后的得率均為最高,Ju-0組分在快速膨大期的得率最高,Ju-1和Ju-3組分在著色期的得率最高,Ju-2組分在完熟期的得率最高。

圖1 不同時期果實(shí)粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素洗脫曲線

4.2.2 HW-55S分子排阻柱層析 HW-55S分子排阻柱層析洗脫曲線如圖2所示。由于膨大前期多糖含量較少,故沒有過層析柱??梢钥闯?,不同時期靈武長棗果實(shí)多糖各組分經(jīng)HW-55S洗脫的曲線峰形單一且較對稱。

4.3 靈武長棗精制多糖純度鑒定結(jié)果

4.3.1 紫外-可見分光光度法監(jiān)測 對各單糖組分分別進(jìn)行紫外-可見分光光度法監(jiān)測,分別得到如圖3所示光譜圖,可知,各多糖溶液在260 nm和280 nm處無吸收峰,表明各多糖組分中無核酸和蛋白質(zhì)成分存在,為典型多糖吸收曲線。

圖2 不同時期果實(shí)多糖各組分經(jīng)HW-55S洗脫曲線

圖3精制多糖的紫外-可見光譜圖

Fig.3 The UV spectra of refined polysaccharides

4.3.2 凝膠色譜純度鑒定 洗脫曲線均為單一對稱峰形,表明各多糖組分為均一組分。

4.4 不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)精制多糖的單糖組成分析

4.4.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 由表2可以看出,6種標(biāo)準(zhǔn)單糖均具有良好的線性關(guān)系。

4.4.2 不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)精制多糖的單糖組成分析 將不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)精制多糖各多糖級分水解,甲基硅烷化衍生后進(jìn)行GC-MS分析,得到的圖譜如圖4所示。由圖可知,不同時期靈武長棗果實(shí)精制多糖各組分的單糖已被成功分離。

不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)精制多糖各組分的單糖組成及質(zhì)量如表3所示。

表2 6種單糖的回歸方程

注:X為質(zhì)量濃度(mg·mL-1);Y為峰面積。

Note:X, mass concentration (mg·mL-1);Y, peak area.

① 不同時期靈武長棗果實(shí)精制多糖各多糖級分中阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖含量較高,葡萄糖含量次之,甘露糖、木糖含量較低,均不含有果糖。其中膨大前期的Ju-0、Ju-1,快速膨大期的Ju-1、Ju-2、Ju-3,著色期的Ju-0、Ju-1、Ju-3及完熟期Ju-1,均含有阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和木糖,其中膨大前期的Ju-0、Ju-1,快速膨大期的Ju-0、Ju-1,著色期的Ju-0及完熟期Ju-0、Ju-1中各單糖含量大小均為阿拉伯糖>半乳糖>鼠李糖>葡萄糖>甘露糖>木糖,但快速膨大期Ju-0、完熟期Ju-0無木糖;膨大前期Ju-2、Ju-3,快速膨大期Ju-2、Ju-3,單糖含量大小為鼠李糖>阿拉伯糖>半乳糖>葡萄糖>甘露糖>木糖,但膨大前期Ju-2、Ju-3無甘露糖;著色期的Ju-1、Ju-2單糖含量大小為半乳糖>阿拉伯糖>鼠李糖>葡萄糖>甘露糖>木糖,但著色期Ju-2不含甘露糖和木糖;著色期Ju-3單糖含量大小為阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖>葡萄糖>木糖>甘露糖;完熟期Ju-2和完熟期Ju-3單糖含量大小分別為阿拉伯糖>半乳糖>葡萄糖>甘露糖和阿拉伯糖>鼠李糖>葡萄糖。

② 針對Ju-0,鼠李糖、半乳糖、葡萄糖的含量隨果實(shí)的生長發(fā)育而不斷降低,即膨大前期>快速膨大期>著色期>完熟期;阿拉伯糖含量為膨大前期>著色期>快速膨大期>完熟期;甘露糖含量為膨大前期>著色期>快速膨大期=完熟期;木糖在快速膨大期和完熟期沒有,膨大前期含量高于著色期。針對Ju-1,阿拉伯含量為著色期>膨大前期>完熟期>快速膨大期;鼠李糖含量為著色期>完熟期>快速膨大期>膨大前期;木糖和甘露糖含量均為膨大前期>著色期>完熟期>快速膨大期;半乳糖和葡萄糖含量均為著色期>完熟期>膨大前期>快速膨大期。針對Ju-2,阿拉伯糖和鼠李糖的含量隨果實(shí)的生長發(fā)育而不斷降低,即膨大前期>快速膨大期>著色期>完熟期,但鼠李糖在完熟期沒有檢測到;半乳糖含量為快速膨大期>著色期>膨大前期>完熟期;葡萄糖含量為快速膨大期>膨大前期>著色期=完熟期;木糖含量為快速膨大期>膨大前期,在著色期和完熟期沒有木糖;甘露糖含量為快速膨大期>完熟期,而在膨大前期和著色期沒有甘露糖。針對Ju-3,阿拉伯糖和葡萄糖含量均為完熟期>快速膨大期>膨大前期>著色期;鼠李糖含量為膨大前期>完熟期>快速膨大期>著色期;半乳糖和木糖在完熟期均沒有被檢測到,其含量分別為快速膨大期>膨大前期>著色期和快速膨大期>著色期>膨大前期;甘露糖在膨大前期和完熟期均沒有,快速膨大期和著色期含量大小為快速膨大期>著色期。

注:圖中1~10依次為阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸。

Note: In figure 1~10 : Arabinose, Rhamnose, Xylose, Mannose, Galactose. Glucose, Ribose, Fucose, Glucuronic acid, Galacturonic acid

圖4 不同時期靈武長棗果實(shí)精制多糖各組分總離子流圖

注:“—”表示單糖存在但未進(jìn)行定量。Note:“—”Indicates the existence of monosaccharide but not quantitative.

③ 針對膨大前期,阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖含量大小均為Ju-0>Ju-1>Ju-2>Ju-3;鼠李糖含量大小為Ju-3>Ju-2>Ju-0>Ju-1;甘露糖含量大小為Ju-0>Ju-1,Ju-2和Ju-3中沒有甘露糖。針對快速膨大期,阿拉伯糖含量大小為Ju-0>Ju-2>Ju-1>Ju-3;半乳糖含量大小為Ju-2>Ju-1>Ju-0>Ju-3;鼠李糖和木糖含量大小均為Ju-2>Ju-3>Ju-1>Ju-0,但快速膨大期Ju-0沒有木糖;葡萄糖含量大小為Ju-2>Ju-3>Ju-0>Ju-1;甘露糖含量大小為Ju-2>Ju-1>Ju-3>Ju-0。針對著色期,阿拉伯糖和葡萄糖含量大小均為Ju-1>Ju-0>Ju-2>Ju-3;半乳糖和鼠李糖含量大小均為Ju-1>Ju-2>Ju-0>Ju-3;木糖和甘露糖含量大小均為Ju-1>Ju-0>Ju-3,Ju-2時沒有木糖和甘露糖。針對完熟期,阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖含量大小均為Ju-3>Ju-1>Ju-0>Ju-2,但Ju-2沒有鼠李糖;半乳糖和甘露糖含量大小均為Ju-1>Ju-2>Ju-0,Ju-3不含有半乳糖和甘露糖;木糖只在Ju-1中存在且含量很小。

由于部分單糖標(biāo)品種類的限制,根據(jù)NIST譜庫對照對多糖中其他單糖進(jìn)行初步定性,不同發(fā)育時期靈武長棗果實(shí)精制多糖中,中性多糖組分Ju-0中均含有核糖和巖藻糖。酸性多糖組分中,著色期Ju-1中含有核糖、巖藻糖和半乳糖醛酸;著色期Ju-2和完熟期Ju-3中均含有核糖和巖藻糖,完熟期Ju-2中僅含有核糖;膨大前期Ju-1、Ju-2、Ju-3,快速膨大期Ju-1、Ju-2、Ju-3,著色期Ju-3及完熟期Ju-1中均含有核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。

5 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)用熱水浸提法提取不同時期粗多糖,發(fā)現(xiàn)粗多糖得率和含量隨著果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)上升趨勢,在完熟期達(dá)到最高值。采用DEAE-52纖維素層析柱對粗多糖進(jìn)行分離純化,得到1種中性多糖和3種酸性多糖,表明靈武長棗多糖的主要形式為酸性多糖,各時期均以酸性組分2得率最高,Ju-0組分在快速膨大期的得率最高,Ju-1和Ju-3組分在著色期的得率最高,Ju-2組分在完熟期的得率最高。GC-MS分析結(jié)果表明,不同時期靈武長棗多糖的單糖組分共有10種,其中以阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖為主,葡萄糖,甘露糖、木糖次之,還含有核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸,均不含果糖。且各時期的單糖含量各不相同,Ju-0和Ju-1各單糖含量組成在果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程中變化不大,四個時期均是以阿拉伯糖>半乳糖為主,主要差異在于Ju-2和Ju-3,在膨大前期和快速膨大期,Ju-2和Ju-3是以鼠李糖>阿拉伯糖>半乳糖為主,隨著果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程,在著色期,Ju-2以半乳糖>阿拉伯糖>鼠李糖為主,完熟期Ju-2以阿拉伯糖>半乳糖為主;在著色期,Ju-3以阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖為主,完熟期Ju-3以阿拉伯糖>鼠李糖為主。另外,從核糖、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸定性來看,主要差別也是在于著色期和完熟期。

采用DEAE-52纖維素層析柱對粗多糖進(jìn)行分離純化,得到1種中性多糖和3種酸性多糖,這與羅莉[19]、戴艷[20]分離純化棗多糖結(jié)果在組分?jǐn)?shù)量上有所差異,可能是填料或洗脫溶液濃度不同及棗果實(shí)品種不同造成的。柳楊[21]研究結(jié)果表明靈武長棗各多糖組分分子量最大為1.60×105,最小為7.61×104,實(shí)驗(yàn)采用適用分離多糖分子量范圍為1000-2×105的HW-55S填料,得到的洗脫峰為對稱的單一峰,效果較好,證明多糖為均一組分,且紫外檢測證明多糖中不含有核酸和蛋白質(zhì)。用GC-MS分析單糖組成,以標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的出峰時間和樣品單糖衍生物的出峰時間相對照,并結(jié)合NIST譜庫對照進(jìn)行定性定量分析,使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

王東營[22]研究灘棗多糖時,發(fā)現(xiàn)灘棗多糖是一種由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10種單糖組成的多糖,且阿拉伯糖含量最高,與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。林勤保[23]等用高效液相色譜法測得大棗中性多糖由L-阿拉伯糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成,酸性多糖由L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸組成,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異。友田正司等[24]發(fā)現(xiàn)日本大棗中性多糖單糖組成為D-半乳糖和L-阿拉伯糖,酸性多糖單糖組成為D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和D-半乳糖醛酸,也與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不同。上述多糖中均不含有果糖,但彭艷芳[25]研究金絲小棗和冬棗時發(fā)現(xiàn)多糖中含有果糖,且果糖含量在各發(fā)育時期均高于其他單糖,這可能是棗種類不同、多糖的提取、分離純化方法不同、單糖組成測定方法不同等因素造成的。靈武長棗果實(shí)多糖在不同時期中單糖組成種類幾乎一樣,而彭艷芳[25]等研究發(fā)現(xiàn),隨金絲小棗和冬棗果實(shí)的發(fā)育,多糖的單糖種類呈遞增趨勢,這可能是由于提取溶劑不同,及該實(shí)驗(yàn)用HPLC測多糖單糖組成時,未對單糖進(jìn)行衍生,導(dǎo)致監(jiān)測靈敏度低,未將棗果半紅期多糖中含量較低的甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖檢測出有關(guān)。由此可見,多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,多糖中單糖組成差異大,合理選擇實(shí)驗(yàn)條件及測定方法尤為重要,這對后續(xù)研究多糖結(jié)構(gòu)及生物活性具有重大的意義。

本試驗(yàn)為棗多糖組成GC-MS分析提供了快速、有效的檢測手段。首次闡明靈武長棗果實(shí)多糖發(fā)育進(jìn)程中的單糖組成變化特征,為靈武長棗的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)研究。

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