戴知寧，陳明堂，劉 穎，吳紀(jì)中*

（1.江蘇省溧水高級(jí)中學(xué)，江蘇南京211200；2.江蘇省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司弶港分公司，江蘇東臺(tái)224236；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇南京210014）

江蘇是我國(guó)稻茬小麥的主產(chǎn)區(qū)，稻茬小麥播種面積占小麥播種面積的80%以上。近年來(lái)，隨著偏遲熟粳稻品種的應(yīng)用，水稻騰茬較晚，小麥播種期推遲，嚴(yán)重影響了稻茬小麥的播種質(zhì)量和幼苗素質(zhì)的提高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年江蘇小麥播種面積為218萬(wàn)hm2，其中遲播（較適播期晚10 d以上）面積為145萬(wàn)hm2，遲播面積占66.4%，有30%以上的稻茬小麥播種期推遲1個(gè)月以上。遲播小麥由于受低溫的影響，種子萌發(fā)慢、活力低、出苗率下降、幼苗生長(zhǎng)緩慢，難以在冬前形成壯苗，幼苗的抗凍能力也顯著降低，極易造成凍害，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)形成。因此，明確低溫脅迫對(duì)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響及其機(jī)理，探求緩解低溫脅迫的調(diào)控途徑，是當(dāng)前小麥生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題。

前人研究表明，低溫脅迫降低種子內(nèi)淀粉酶活性、誘導(dǎo)種子活性氧產(chǎn)生、降低抗氧化酶系統(tǒng)清除效率、影響種子呼吸，從而導(dǎo)致腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量下降，進(jìn)而抑制小麥種子萌發(fā)[1-3]。低溫脅迫對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響主要通過(guò)抑制小麥幼苗根系分生組織的分裂能力，降低生長(zhǎng)素（IAA）積累，從而抑制根系生長(zhǎng)，同時(shí)，地上部蔗糖合成降低、光合電子傳遞受阻，導(dǎo)致光合作用降低[3-5]。一氧化氮（NO）作為植物信號(hào)分子，在種子萌發(fā)過(guò)程中起著重要的作用[6]。Bethke等研究發(fā)現(xiàn)NO可能參與打破種子休眠的過(guò)程，外源NO供體硝普鈉（SNP）處理可顯著提高逆境和正常條件下植物種子的萌發(fā)[7-8]。使用SNP噴灑小麥幼苗葉片后，低溫環(huán)境下的植株存活率提高，低溫傷害后植株的康復(fù)能力也有所提高[9]。然而，關(guān)于SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響及其機(jī)理尚不明確。因此，本試驗(yàn)采用光照培養(yǎng)箱模擬低溫的方法研究了SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥種子萌發(fā)過(guò)程中胚根和胚芽鞘生長(zhǎng)進(jìn)程、淀粉代謝及相關(guān)酶活性、幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響，以期探尋低溫條件下促進(jìn)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的有效途徑，為遲播小麥的高產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 種子萌發(fā)試驗(yàn)。以長(zhǎng)江流域大面積推廣的小麥品種揚(yáng)麥16為試驗(yàn)材料，選取籽粒飽滿、大小一致的種子，經(jīng)1%NaClO消毒10～15 min，蒸餾水沖洗干凈。將種子分別在（26±1）℃條件下用蒸餾水（S0）、0.1 mmol/L SNP（S1）浸種 12 h 催芽。催芽后，挑選一致的種子，置于直徑為9 cm鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)處理。設(shè)置晝 /夜溫度為 20/10℃（T0，對(duì)照）、15/8℃（T1）和10/4℃（T2）3個(gè)溫度處理，以分別模擬小麥適播期、遲播10 d和遲播20 d的晝夜溫度。每處理6次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子，保持培養(yǎng)皿水分充足。于發(fā)芽第7天取樣，分別測(cè)定胚根長(zhǎng)和胚芽鞘長(zhǎng)，部分樣品分為胚芽鞘、根系和剩余種子3部分，在105℃下殺青30 min，70℃烘干至恒質(zhì)量并測(cè)定干質(zhì)量，樣品用于測(cè)定種子淀粉、可溶性糖和游離氨基酸含量；部分樣品液氮冷凍后保存于-80℃冰箱，用于測(cè)定α-淀粉酶和β-淀粉酶活性。

1.1.2 幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)材料、浸種處理和溫度設(shè)置與種子萌發(fā)試驗(yàn)相同，浸種后將種子擺進(jìn)含有塑料紗網(wǎng)的特制的培養(yǎng)周轉(zhuǎn)箱（長(zhǎng)×寬×高為310 mm×210 mm×110 mm），萌發(fā)期周轉(zhuǎn)箱內(nèi)供給清水使種子保持濕潤(rùn)，待種子長(zhǎng)至1葉1心時(shí)周轉(zhuǎn)箱內(nèi)供給Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每箱保持60株。苗期每天提供12 h的光照，光照強(qiáng)度為360 μmol/（m2·s）。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，設(shè)6次重復(fù)。于2葉1心時(shí)收獲，分別測(cè)定株高、根長(zhǎng)和葉綠素含量。樣品分為根系和地上部（葉片），部分樣品液氮冷凍后保存于-80℃冰箱，用于測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）活性以及丙二醛（MDA）、可溶性蛋白含量；部分樣品用于測(cè)定地上部和根系干質(zhì)量、可溶性糖和游離氨基酸含量。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 種子發(fā)芽指標(biāo)。以種子的胚根和胚芽鞘的長(zhǎng)度分別達(dá)到種子的全長(zhǎng)和半長(zhǎng)作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)芽率（GR）為萌發(fā)后7 d培養(yǎng)皿中已發(fā)芽種子占發(fā)芽種子總數(shù)的百分比。平均發(fā)芽時(shí)間（MGT）根據(jù)Ellis等的方法[10]計(jì)算，即 MGT=∑(f× x)/∑f，其中，f是每天萌發(fā)的種子數(shù)，x是計(jì)算的天數(shù)。發(fā)芽指數(shù)（GI）參考 Wang等的方法[11]計(jì)算，即 GI=∑(Gi/Ti)，其中Gi是第i天的發(fā)芽率，Ti是萌發(fā)試驗(yàn)天數(shù)。

1.2.2 根長(zhǎng)。根長(zhǎng)測(cè)定采用根系掃描儀（Epson 1680，Indonesia），并通過(guò)專用分析軟件（WinRhizo ProVision 5.0）進(jìn)行分析，計(jì)算單株總長(zhǎng)度。

1.2.3 貯藏物質(zhì)含量?？扇苄蕴呛繙y(cè)定采用蒽酮法[12]；游離氨基酸含量測(cè)定采用Moore等的方法[13]；總淀粉含量和可溶性蛋白含量測(cè)定分別采用茚三酮比色法和考馬斯亮藍(lán)法[12]測(cè)定。

1.2.4 葉綠素含量。采用乙醇-丙酮混合法[12]測(cè)定。

1.2.5 淀粉酶活性和活性氧代謝。α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法[13]；丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定分別采用TBA比色法、NBT比色法和愈創(chuàng)木酚比色法[14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS10.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性測(cè)驗(yàn)，采用SigmaPlot 10.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥種子萌發(fā)的影響

小麥種子發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)、胚芽鞘長(zhǎng)、胚根和胚芽鞘干質(zhì)量均隨溫度的降低而降低，而剩余種子干質(zhì)量（種子余質(zhì)量）顯著增加（表1）。與T0處理相比，T1、T2處理的平均發(fā)芽率均顯著下降，但T1達(dá)到95%以上，而T2處理的發(fā)芽率在70%左右。與清水浸種處理（S0）相比，相同低溫脅迫T1和T2處理下SNP浸種處理（S1）均顯著提高了種子的發(fā)芽指數(shù)、胚根長(zhǎng)和胚芽鞘長(zhǎng)（P＜0.05），并且縮短了平均發(fā)芽時(shí)間，同時(shí)顯著降低種子余質(zhì)量（P＜0.05）。但T1處理下SNP浸種處理顯著提高了胚根和胚芽鞘干質(zhì)量（P＜0.05），T2處理下略有增加但無(wú)明顯差異。表明SNP浸種處理明顯緩解了低溫脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制，且T1處理下SNP浸種顯著改善發(fā)芽質(zhì)量，而過(guò)低的溫度T2處理下SNP對(duì)種子發(fā)芽的促進(jìn)作用降低。

2.2 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥種子貯藏物質(zhì)分解的影響

表2表明，低溫處理（T1、T2）下種子淀粉含量顯著高于對(duì)照（T0），而可溶性糖含量和游離氨基酸含量分別顯著低于對(duì)照（P＜0.05），且萌發(fā)溫度越低，淀粉分解越慢，導(dǎo)致可溶性糖和游離氨基酸含量顯著降低（P＜0.05）。與清水處理（S0）相比，相同溫度下S1處理顯著降低了小麥萌發(fā)種子內(nèi)淀粉含量，并顯著提高了可溶性糖含量（P＜0.05），表明SNP浸種加速了種子淀粉的降解。同時(shí)發(fā)現(xiàn)T1-S1處理的淀粉和可溶性糖含量接近T0-S0處理，與其他低溫處理差異顯著（P＜0.05），表明在過(guò)低的溫度下SNP的作用下降。

表1 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥種子萌發(fā)的影響

表2 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥種子淀粉、可溶性糖和游離氨基酸含量的影響

2.3 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥種子淀粉酶活性的影響

低溫處理顯著降低了種子內(nèi)α-淀粉酶和β-淀粉酶活性，且2種淀粉酶活性隨溫度的降低而降低（圖1）。在T0、T1處理下，與S0比較，SNP浸種均顯著提高了α-淀粉酶和β-淀粉酶活性，但在T2處理下，SNP浸種處理與S0處理差異不顯著，表明低溫抑制種子內(nèi)淀粉降解，且SNP對(duì)低溫脅迫的緩解作用受溫度的影響。

圖1 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥種子淀粉酶活性的影響

2.4 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)和葉綠素含量的影響

與適溫對(duì)照（T0）相比，低溫處理（T1、T2）顯著降低了幼苗地上部和根系干質(zhì)量及葉片葉綠素含量（P＜0.05，表3）。與清水浸種處理（S0）相比，相同溫度處理下SNP浸種（S1）處理均顯著提高了小麥株高、根長(zhǎng)、干質(zhì)量和葉綠素含量（P＜0.05），表明SNP浸種處理促進(jìn)了小麥幼苗的生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SNP浸種處理下小麥株高、地上部和根系干質(zhì)量的增加幅度隨著溫度的降低而降低，說(shuō)明SNP浸種對(duì)低溫脅迫的緩解作用因溫度而異。

表3 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)和葉綠素含量的影響

2.5 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗碳氮含量的影響

與適溫對(duì)照（T0）相比，低溫處理（T1、T2）顯著降低了小麥幼苗根系和地上部可溶性糖含量，但顯著提高了游離氨基酸和可溶性蛋白含量（P＜0.05，表4）。除T2處理的根系游離氨基酸含量外，相同溫度下SNP浸種（S1）均提高了小麥幼苗根系和地上部可溶性糖含量，但降低了游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)含量，改善了小麥幼苗植株體內(nèi)的碳氮平衡，有利于植株生長(zhǎng)。此外，T1處理下SNP浸種顯著提高了根系和地上部可溶性糖含量（P＜0.05），而對(duì)T2處理的地上部可溶性糖含量無(wú)顯著影響，表明過(guò)低溫度條件下SNP緩解低溫脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的效應(yīng)降低。

表4 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗游離氨基酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

2.6 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

表5表明，低溫處理下小麥幼苗根系和葉片SOD、POD活性及MDA含量隨溫度的降低而顯著提高。在T1和T2處理下，與S0相比，SNP浸種均顯著提高了小麥幼苗根系和葉片SOD、POD活性（P＜0.05），T1處理下，SNP浸種顯著降低了根系和葉片MDA含量（P＜0.05），T2處理下，SNP浸種顯著降低了根系MDA含量（P＜0.05）。表明SNP通過(guò)增強(qiáng)植株抗氧化活性，降低膜脂過(guò)氧化，緩解了低溫對(duì)生長(zhǎng)的抑制。

3 討論

種子萌發(fā)是作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的階段，也是衡量作物抗逆能力強(qiáng)弱的關(guān)鍵時(shí)期。隨著種子萌發(fā)進(jìn)程，種子內(nèi)胚、胚乳、子葉中細(xì)胞內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，包括酶系統(tǒng)的活化、貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)移、呼吸作用增強(qiáng)、ATP和內(nèi)源激素的合成與活化等，這一系列過(guò)程受溫度、激素和信號(hào)物質(zhì)的調(diào)控。陳蕾太等研究表明，干旱、低溫等逆境條件顯著降低了不同小麥品種種子的活力、發(fā)芽勢(shì)及種子內(nèi)的生理代謝活性[1]。王興等研究表明，6-BA處理可促進(jìn)小麥種子發(fā)芽，調(diào)節(jié)植株內(nèi)源激素和膜脂過(guò)氧化作用，提高抵御低溫的能力[15]。張華研究表明，NO可促進(jìn)滲透脅迫下小麥種子的吸脹、萌發(fā)和胚芽胚根的生長(zhǎng)，加速貯藏物淀粉降解，提高種子萌發(fā)過(guò)程中的抗氧化能力[16]。本研究表明，低溫顯著降低了小麥的發(fā)芽率，延緩了胚根、胚芽鞘的生長(zhǎng)。然而，SNP浸種顯著提高了低溫脅迫下種子的發(fā)芽率、發(fā)芽速率和發(fā)芽指數(shù)，促進(jìn)了胚根和胚芽的生長(zhǎng)，說(shuō)明SNP對(duì)促進(jìn)種子萌發(fā)和緩解低溫脅迫具有重要的作用。種子萌發(fā)所需要的物質(zhì)和能量完全來(lái)源于貯藏物質(zhì)動(dòng)員，小麥種子胚乳中儲(chǔ)存的淀粉是其萌發(fā)所需物質(zhì)和能量的主要來(lái)源。α-淀粉酶和β-淀粉酶是主要的淀粉水解酶，由SNP產(chǎn)生的NO能提高脅迫和非脅迫下種子萌發(fā)及淀粉酶活性[17-18]。NO能誘導(dǎo)自由型β-淀粉酶活化上調(diào)β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄水平，増加β-淀粉酶蛋白的表達(dá)，同時(shí)能夠誘導(dǎo)β-淀粉酶的快速應(yīng)答[19]。在本研究中，SNP顯著提高了α-淀粉酶和β-淀粉酶活性，加速了淀粉的降解，提高了種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖含量，表明SNP能夠通過(guò)提高低溫脅迫下小麥籽粒淀粉代謝能力，促進(jìn)小麥種子的萌發(fā)。

表5 SNP浸種對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗SOD、POD活性和MDA含量的影響

低溫脅迫下小麥幼苗細(xì)胞平衡被打破，活性氧（ROS）大量積累，引起細(xì)胞膜、磷脂、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷，同時(shí)，植株細(xì)胞內(nèi)SOD酶被激活，降低超氧陰離子(O2-)積累，從而減輕逆境對(duì)細(xì)胞的氧化傷害[20]。Mur等研究表明，植物應(yīng)對(duì)諸如高溫、低溫、干旱等脅迫時(shí)，產(chǎn)生ROS和活性氮（NO），兩者在逆境脅迫下都起到信號(hào)傳遞作用[21]。鄭春芳等研究指出，NO顯著提高鹽脅迫下萌發(fā)的小麥種子線粒體內(nèi)SOD、CAT活性，抑制超氧陰離子產(chǎn)生速率，同時(shí)降低了H2O2和MDA積累[22]。本研究結(jié)果表明，低溫處理顯著提高了小麥幼苗根系、地上部SOD、POD活性和MDA含量，說(shuō)明低溫脅迫激活了小麥體內(nèi)ROS酶促系統(tǒng)，維持ROS平衡。SNP浸種提高了小麥幼苗根系和地上部SOD、POD活性，降低了MDA含量，促進(jìn)低溫脅迫下小麥幼苗的生長(zhǎng)。同時(shí)，根系SOD、POD活性增加幅度顯著高于地上部，說(shuō)明根系對(duì)低溫脅迫和SNP較敏感。因此，SNP浸種可提高低溫脅迫下小麥幼苗的抗氧化能力，增強(qiáng)幼苗的耐低溫能力。

綜上所述，低溫脅迫抑制了小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，SNP浸種提高了低溫脅迫下小麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽速度和種子淀粉酶活性、游離氨基酸含量、可溶性糖含量，加快了貯藏淀粉的降解，促進(jìn)胚根和胚芽鞘的生長(zhǎng)。同時(shí)，SNP浸種可激活幼苗的抗氧化系統(tǒng)，提高SOD、POD活性，降低ROS對(duì)幼苗的傷害，增強(qiáng)幼苗對(duì)低溫的耐性。因此，SNP浸種可作為一種有效的調(diào)控遲播小麥出苗質(zhì)量的重要手段。

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