鐘順順，李 凱，楊 陽(yáng)，繆時(shí)英，王琳芳，宋 偉

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

近年來(lái)，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞、動(dòng)物和植物等方面的研究，對(duì)生命科學(xué)的研究有重要意義，它相比于傳統(tǒng)的基因編輯——鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，更加精準(zhǔn)和高效[1]。

QKI(quaking, QKI)是一類(lèi)RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，可通過(guò)選擇性剪切可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生QKI5、QKI6和QKI7 3種轉(zhuǎn)錄本，都具有同源的KH結(jié)構(gòu)域[2]。目前，QKI的研究主要集中在神經(jīng)、 心血管系統(tǒng)等研究領(lǐng)域[3- 5]。在生殖領(lǐng)域，QKI突變的雄性小鼠不育，其睪丸組織切片中幾乎沒(méi)有精子的存在，附睪組織中僅有精子頭部和尾部畸形的無(wú)運(yùn)動(dòng)能力的精子[6]，表明QKI在精子發(fā)生中也有重要作用。

目前關(guān)于QKI在精子發(fā)生中的功能與機(jī)制的研究較少，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了GC1-spg細(xì)胞系的QKI基因中與RNA結(jié)合的KH結(jié)構(gòu)(K Homology domain, KH)的敲除細(xì)胞株，并從細(xì)胞增殖、分化等方面初步探索QKI在精子發(fā)生中的可能功能，為深入揭示QKI蛋白在精子發(fā)生中的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠精原細(xì)胞系GCI-spg(本課題組保存)；真核表達(dá)質(zhì)粒px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(本實(shí)驗(yàn)室保存)；轉(zhuǎn)染所用試劑Lipofectamine(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco-BRL公司)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；gRNA序列(擎科生物科技有限公司合成)；anti-QKI抗體(Millipore公司)；anti-Tubulin抗體和嘌呤霉素(Sigma-Aldrich公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠；兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Cell Counting Kit- 8(同仁化學(xué)研究所)；Transcriptor First Strand cDNA Synthetsis Kit(Roche公司)；TransStart Tip Green qPCR Super Mix(Transgen Biotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 敲除靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)及QKI的測(cè)序引物設(shè)計(jì)：利用麻省理工學(xué)院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/設(shè)計(jì)QKIDNA區(qū)域的一對(duì)oligoDNAs，根據(jù)得分高低選擇合適的一對(duì)引導(dǎo)RNA序列。同時(shí)，在QKI敲除區(qū)域的上下游選擇合適的位置設(shè)計(jì)測(cè)序引物，用于后續(xù)的PCR鑒定和測(cè)序檢測(cè)。

1.2.2 質(zhì)粒和重組體的構(gòu)建：將合成的兩條oligo DNAs按照上游下游各100 pmol的比例進(jìn)行100 ℃反應(yīng)10 min，后自然降溫退火至室溫，形成雙鏈DNA，與PX330質(zhì)粒用T4連接酶連接，進(jìn)而轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)后，提取質(zhì)粒備用。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及單克隆的篩選：根據(jù)GC1-spg細(xì)胞的特征，選擇Lipofectamine做轉(zhuǎn)染試劑，按照其說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞，待質(zhì)粒表達(dá)36 h后，用加入3 mg/L嘌呤霉素，待陰性對(duì)照中細(xì)胞完全死亡，停止加藥，待細(xì)胞長(zhǎng)到適當(dāng)數(shù)量，進(jìn)行單克隆分選，挑選有效單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)至可用來(lái)DNA測(cè)序和Western blot驗(yàn)證。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)：將構(gòu)建成功的PX330重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GC1-spg細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收取細(xì)胞，用1×SDS裂解液(50 μL 1 mol/L Tris-HCl pH 6.8, 125 μL 80%甘油, 10% SDS, 625 μL H2O)裂解細(xì)胞樣品，致使細(xì)胞呈黏稠透明液體，100 ℃變性10 min，后用BCA法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE電泳，分離蛋白，用320 mA進(jìn)行恒流轉(zhuǎn)膜，后用相應(yīng)的各抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 CCK8測(cè)量增殖曲線(xiàn)：在96孔板中種植一定數(shù)量(1 000個(gè))細(xì)胞，12 h后待細(xì)胞完全貼壁后，加入10% CCK8檢測(cè)液和90% DMEM完全培養(yǎng)基的混合液。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱孵育75 min后，檢測(cè)450和630 nm處吸光度值，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.2.6 q-PCR對(duì)mRNA水平的檢測(cè)：利用 Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，后用Transcriptor First Strand cDNA Synthetsis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)c-kit、Stra8、Lhx8、Hspa2、Zfp42和Mtl5的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建GC1-spg的QKI敲除細(xì)胞株

2.1.1 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)示意圖：QKI基因敲除靶點(diǎn)位置(圖1)，敲除靶點(diǎn)序列長(zhǎng)度為20 bp，1#靶點(diǎn)和2#靶點(diǎn)分別位于KH的+67到+86處和+13到+32處(1#靶點(diǎn)序列為：5′-GGATGTAAAATAATGGTCCG-3′，2#靶點(diǎn)序列為：5′-GGGAGAATCCTTGGACCTAG-3′)

2.1.2 Western blot與測(cè)序驗(yàn)證敲除細(xì)胞株：獲得1#靶點(diǎn)單細(xì)胞株3株，2#靶點(diǎn)單細(xì)胞株3株，Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖2A)，其中1#06測(cè)序結(jié)果(圖2B)得到GTCCGAG堿基缺失突變體，測(cè)序峰圖結(jié)果(圖2C)表明突變細(xì)胞株是在該區(qū)域因堿基缺失造成移碼突變。后續(xù)功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均選擇1#06進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 QKI對(duì)GC1-spg細(xì)胞增殖與分化的影響

2.2.1 QKI蛋白對(duì)于細(xì)胞增殖的影響：測(cè)定QKI敲除成功的細(xì)胞株增殖曲線(xiàn)結(jié)果(圖3)，實(shí)驗(yàn)組Cas-QKI細(xì)胞增殖明顯慢于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 QKI基因敲除靶點(diǎn)Fig 1 Diagram of QKI gene target site

A.cells were collected for Western blot; B,C.cells were collected for PCR, and B.sequence PCR product compared with wild type, C.sequencing peak map, the red line marked the mutation

圖2敲除細(xì)胞株的鑒定
Fig2Identificationoftheknock-outcellstrain

*P<0.05 compared with control group圖3 CCK8檢測(cè)QKI對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig 3 CCK8 method was used to detect the proliferation of QKI-knocking out cells

2.2.2 QKI蛋白對(duì)于細(xì)胞分化的影響：檢測(cè)減數(shù)分裂相關(guān)分子標(biāo)志基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組c-kit、Mtl5的表達(dá)量相較于對(duì)照組有顯著降低(P<0.01)，Hspa2表達(dá)量也低于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group圖4 QKI蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的影響Fig 4 Effect of QKI protein on cells’ meiosis

3 討論

在體外機(jī)制的研究中，常用RNA干擾(RNA interference, RNAi)進(jìn)行基因沉默，影響蛋白質(zhì)表達(dá)，但是由于siRNA的持續(xù)作用時(shí)間較短，一般傳代2～3代就會(huì)失效，而且受細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和狀態(tài)影響大，靶點(diǎn)的敲低效率也不穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)于一些周期比較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)不適用，所以本研究選擇利用CRISPR/Cas9構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，可以解決RNAi的技術(shù)弊端。

由于QKI有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，就其序列進(jìn)行分析，其3個(gè)轉(zhuǎn)錄本高度同源，僅在3′端氨基酸序列與個(gè)數(shù)不同，其QUA結(jié)構(gòu)域具有介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的作用；KH可以與RNA結(jié)合，通過(guò)與RNA結(jié)合參與生物學(xué)過(guò)程。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)GC1-spg細(xì)胞的QKI進(jìn)行KH結(jié)構(gòu)域定點(diǎn)敲除，共篩出6株單細(xì)胞(1#靶點(diǎn)3株，2# 靶點(diǎn)3株)。CRISPR/Cas9技術(shù)雖然持續(xù)周期較長(zhǎng)(2個(gè)月左右)，但是其敲除效率高，構(gòu)建出的細(xì)胞株可以穩(wěn)定缺失QKI，構(gòu)建成功的細(xì)胞株不會(huì)因?yàn)閭鞔螖?shù)增多而恢復(fù)，所以可以為體外功能與機(jī)制研究提供合適的細(xì)胞模型。

目前QKI在精子發(fā)生中的功能與機(jī)制的研究較少，本研究利用上述構(gòu)建的QKI敲除細(xì)胞模型，初步觀(guān)察了該基因?qū)ι?xì)胞的增殖和分化的影響。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出QKI可以影響細(xì)胞增殖；在檢測(cè)c-kit、Stra8和Lhx8這些減數(shù)分裂早期關(guān)鍵分子[7- 8]與 Hspa2、Zfp42和Mtl5 等減數(shù)分裂后期的關(guān)鍵分子[9- 10]時(shí)，c- kit、Mtl5和Hspa2的表達(dá)量變化都提示了QKI蛋白在精子發(fā)生過(guò)程中具有重要作用；這些將為深入揭示QKI蛋白在精子發(fā)生中的功能奠定了良好基礎(chǔ)。

但是精子發(fā)生是一個(gè)特殊的分化過(guò)程，涉及生物學(xué)過(guò)程很多，而目前生精細(xì)胞在體外的培養(yǎng)和繼續(xù)減數(shù)分裂難度大，本研究中選擇的GC1-spg也僅是永生化的精原細(xì)胞株，不能全面代表精子發(fā)生的整個(gè)過(guò)程，所以要真正闡釋QKI蛋白在精子發(fā)生中的功能表型與詳細(xì)機(jī)制，還需進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)的功能研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes[J]. Nat Biotechnol, 2014, 32: 347- 355.

[2] Teplova M, Hafner M, Teplov D,etal. Structure-function studies of STAR family Quaking proteins bound to theirinvivoRNA target sites[J]. Genes Dev, 2013, 27: 928- 940.

[3] Busse TM, Roth JJ, Wilmoth D,etal. Copy number alterations determined by single nucleotide polymorphism array testing in the clinical laboratory are indicative of gene fusions in pediatric cancer patients[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2017, 56: 730- 749.

[4] Hayakawa-Yano Y, Suyama S, Nogami M,etal. An RNA-binding protein, Qki5, regulates embryonic neural stem cells through pre-mRNA processing in cell adhesion signaling[J]. Genes Dev, 2017, 31: 1910- 1925.

[5] Ramkissoon SH, Bandopadhayay P, Hwang J,etal. Clinical targeted exome-based sequencing in combination with genome-wide copy number profiling: precision medicine analysis of 203 pediatric brain tumors[J]. Neuro Oncol, 2017, 19: 986- 996.

[6] Yanagimachi R, Wakayama T, Kishikawa H,etal. Production of fertile offspring from genetically infertile male mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101: 1691- 1695.

[7] Feng CW, Bowles J, Koopman P. Control of mammalian germ cell entry into meiosis[J]. Mol Cell Endocrinol, 2014, 382: 488- 497.

[8] Mithraprabhu S, Loveland KL. Control of KIT signalling in male germ cells: what can we learn from other systems?[J]. Reproduction, 2009, 138: 743- 757.

[9] Govin J, Caron C, Escoffier E,etal. Post-meiotic shifts in HSPA2/HSP70.2 chaperone activity during mouse spermatogenesis[J]. J Biol Chem, 2006, 281: 37888- 37892.

[10] Sugihara T, Wadhwa R, Kaul SC,etal. A novel testis-specific metallothionein-like protein, tesmin, is an early marker of male germ cell differentiation[J]. Genomics, 1999, 57: 130- 136.