汪湄，陳徹，楚慧媛

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院，蘭州7300000

肝細(xì)胞癌是肝硬化患者最常見(jiàn)的死亡原因[1]，占全部肝癌的90%以上，嚴(yán)重地威脅著人類的健康。慢性肝炎、肝硬化等導(dǎo)致的肝功能受損是肝細(xì)胞癌最重要的發(fā)病因素之一。目前，手術(shù)切除仍然是肝細(xì)胞癌的首選治療方式，但由于潛在的肝功能障礙，手術(shù)切除在臨床上并未得到廣泛應(yīng)用[2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，肝移植已被用于肝癌的治療，但由于大部分肝癌患者的確診時(shí)間較晚，且缺乏肝移植的供體，故僅有約15%的患者能夠受益，從而限制了肝移植治療肝癌的進(jìn)展[3]，因此化療仍然是肝癌治療的重要方法；但是，由于肝癌細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物產(chǎn)生了一定的耐藥性且傳統(tǒng)化療藥物的毒副作用較大，使化療的應(yīng)用受到了一定的限制[4]，因此，許多化療藥物增敏劑被發(fā)掘且得到高效利用，藥物的聯(lián)合使用使化療效果得以提高的同時(shí)大大地減少了化療藥物的用量，降低了其毒副作用，故而受到臨床治療領(lǐng)域的廣泛推崇。目前，一些增敏劑的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組將三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）與3'-疊氮-2'，3'-脫氧胸腺核苷（3'-azido-2'，3'-dideoxy thymidine，AZT）聯(lián)合用于肝細(xì)胞癌的治療，雖然效果顯著，但是AZT通過(guò)何種機(jī)制來(lái)起到增效的作用仍然未知，對(duì)水通道蛋白9（aquaporin 9，AQP9）的研究有望為AZT增敏機(jī)制的明確提供新的思路。

1 As 2 O 3聯(lián)合AZT治療肝癌的研究進(jìn)展

1.1 As 2 O 3治療肝癌的研究進(jìn)展

As2O3是中藥砒霜的主要成分，為一種劇毒藥物。20世紀(jì)70年代中國(guó)學(xué)者將As2O3作為一線藥物用于急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）的治療[5]，同時(shí)也有報(bào)道顯示As2O3對(duì)肝癌、宮頸癌、肺癌等有顯著的療效[6-7]。另有研究表明，As2O3可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，并抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8-10]。然而As2O3的毒副作用卻限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，除產(chǎn)生惡心、嘔吐等應(yīng)激反應(yīng)外，As2O3還可引起心臟毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性及骨髓抑制等多個(gè)器官系統(tǒng)病變[11-12]。因此，在不影響療效的情況下降低As2O3的用量，尋找其減毒增效的聯(lián)合用藥方案，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性已成為肝癌治療的研究重點(diǎn)。

1.2 AZT用于肝癌治療的研究進(jìn)展

AZT為胸苷類似物，也稱疊氮胸苷，是一種端粒酶抑制藥，可在腫瘤細(xì)胞的端粒復(fù)制時(shí)摻入新合成的端粒DNA鏈而使端粒復(fù)制終止，進(jìn)而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[13]。Sabokrouh等[14]研究表明，Pt-AZT通過(guò)抑制端粒酶的活性，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制小鼠肝癌細(xì)胞的增殖。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，AZT與大黃素聯(lián)合使用可協(xié)同抑制白血病KG-1a細(xì)胞的增殖。AZT還可以與放療藥物聯(lián)合應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤和宮頸癌的治療中，通過(guò)增強(qiáng)射線對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力而發(fā)揮其增敏作用[16-17]。Chau等[18]將阿扎胞苷與As2O3聯(lián)合起來(lái)用于白血病的治療，實(shí)驗(yàn)證明AZT能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞對(duì)As2O3的吸收，增強(qiáng)其對(duì)As2O3的敏感性。AZT與阿扎胞苷同為核苷類藥物，具有相似的結(jié)構(gòu)及功能。因此，本實(shí)驗(yàn)組推測(cè)：AZT是一種非常有潛力的抗癌藥物，與As2O3聯(lián)合使用可能達(dá)到肝癌治療的目的，并有望起到增效減毒的作用，并首次提出將AZT作為增敏藥物與As2O3聯(lián)合應(yīng)用于肝細(xì)胞癌的治療。

基于上述設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)組開(kāi)展相關(guān)研究，前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明As2O3聯(lián)合AZT可協(xié)同抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，這一作用可能與誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、上調(diào)caspase 3和BAX表達(dá)以及下調(diào)BCL-2表達(dá)有關(guān)[9]；As2O3聯(lián)合AZT能夠明顯抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力，該抑制作用可能是通過(guò)調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路的磷酸化以及下調(diào)MMP-2和VEGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10]。上述研究成果證明，將As2O3與AZT聯(lián)合應(yīng)用可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)其凋亡，且AZT可有效減少As2O3的使用劑量，但該過(guò)程是否是通過(guò)AZT促進(jìn)HepG2細(xì)胞對(duì)As2O3的攝取來(lái)實(shí)現(xiàn)的尚不清楚。

2 AQP 9的結(jié)構(gòu)、分布及功能

2.1 AQP 9的結(jié)構(gòu)與分布

AQP9與其他水通道蛋白的結(jié)構(gòu)基本類似，是一種跨細(xì)胞膜6次的單肽鏈，每個(gè)單肽鏈均為由295個(gè)氨基酸組成的單體，其相對(duì)分子質(zhì)量約為31 kD，肽鏈的羧基端與氨基端均位于細(xì)胞內(nèi)，共形成7個(gè)環(huán)，3個(gè)胞內(nèi)環(huán)，4個(gè)胞外環(huán)[19]。AQP9的高級(jí)結(jié)構(gòu)由同源四聚體構(gòu)成，6個(gè)跨膜的α螺旋組成一個(gè)單體，該α螺旋構(gòu)成了基本的含水通道，故AQP9具備通透水的作用[20]。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)，AQP9主要表達(dá)于肝臟組織和脂肪組織，其中AQP9在肝臟中的表達(dá)最為豐富，主要分布于面向門(mén)靜脈的肝竇狀隙質(zhì)膜上，是肝臟最重要的水甘油通道。

2.2 AQP 9的功能

AQP9作為一種水通道蛋白，除了可以轉(zhuǎn)運(yùn)水以外還可以對(duì)甘油、氨、尿素、嘌呤及嘧啶等進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Qiu等[22]實(shí)驗(yàn)表明，AQP9還參與了機(jī)體糖代謝、脂代謝、膽汁的分泌以及砷的代謝等；Loitto等[23]也報(bào)道，AQP9的高表達(dá)能夠增加水分子的跨膜流動(dòng)，從而迅速改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，形成偽足，該偽足可促使腫瘤細(xì)胞脫離原位而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此AQP9參與了腫瘤的遷移過(guò)程。上述研究表明，AQP9參與了肝臟的眾多生理和病理過(guò)程，在維持肝臟的正常生理功能及參與其病理環(huán)節(jié)中起著重要的作用。

3 AQP 9與肝癌的關(guān)系

既往有研究表明，與正常肝臟組織相比，AQP9在肝癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，冉呂[24]研究發(fā)現(xiàn)，AQP9 mRNA和AQP9蛋白在肝癌組織中的表達(dá)比在癌旁組織中明顯下降，對(duì)其做相關(guān)性分析表明，AQP9表達(dá)的下降程度與肝癌的轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。Blum和Spangenberg[25]分析，正是由于AQP9的表達(dá)水平較低，才導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性增強(qiáng)，從而惡性程度也就更高。Jablonski等[26]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中AQP9的表達(dá)水平相比于癌旁組織明顯下降。Padma等[27]研究進(jìn)一步表明，AQP9在肝臟正常組織中以肝中央靜脈為中心呈帶狀分布樣表達(dá)，但是在肝癌組織中其表達(dá)明顯減少，進(jìn)而推測(cè)AQP9在病理組織上表達(dá)的改變可能是源于肝細(xì)胞癌的特征性改變。除此之外，張文廣等[28]報(bào)道，AQP9可能直接參與肝癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響肝癌的預(yù)后，用Hg2+選擇性抑制水通道AQP9，發(fā)現(xiàn)引起肝細(xì)胞因滲透壓改變所致的水通透是AQP9依賴性的，且該水通透直接與細(xì)胞的凋亡速度相關(guān)，抑制該通透可抑制凋亡小體的形成，相反的，AQP9過(guò)表達(dá)可增加肝癌細(xì)胞對(duì)水的通透作用，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果均表明，AQP9的表達(dá)水平可能直接影響著原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。

4 AQP 9在As 2 O 3聯(lián)合AZT治療肝癌中的作用

前期研究表明，As2O3的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收及釋放是通過(guò)芳基硫酸脂酶A、B，砷抵抗蛋白3，ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等完成的。但是，近期研究顯示，As2O3還可通過(guò)AQP9出入細(xì)胞[29]，該現(xiàn)象可能是因?yàn)槿齼r(jià)砷與甘油具有較相似的結(jié)構(gòu)及電荷分布，因此可模仿甘油通過(guò)水-甘油通道AQP9進(jìn)入細(xì)胞[30]。Liu等[31]研究表明，AQP9主要表達(dá)于肝臟組織及脂肪組織，是亞砷酸鹽最高效的吸收通道。Mukhopadhyay等[32]研究發(fā)現(xiàn)，早幼粒細(xì)胞白血病HL60細(xì)胞系被過(guò)表達(dá)AQP9后，細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性增強(qiáng)。Leung等[33]對(duì)10個(gè)髓系和淋巴系白血病細(xì)胞株分別應(yīng)用RT-qPCR和Western blotting的方法檢測(cè)AQP9 mRNA及蛋白的表達(dá)量，結(jié)果表明：AQP9的表達(dá)量與As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性呈正相關(guān)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇既不表達(dá)AQP9且對(duì)As2O3不敏感的Hep3B肝癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染EGFP-AQP9到該細(xì)胞株，上調(diào)AQP9的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性也相應(yīng)增加了。利用同樣的方法上調(diào)K562慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株中的AQP9表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞內(nèi)的As2O3濃度及其誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性也隨之顯著增加，因此，可得出結(jié)論，即AQP9調(diào)控As2O3的轉(zhuǎn)運(yùn)及白血病細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性。Tang等[34]在肝癌HepG2細(xì)胞中導(dǎo)入AQP9過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)AQP9表達(dá)量增高時(shí)，可提高As2O3對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用，促進(jìn)caspase 3的活化以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。以上結(jié)果與本課題組通過(guò)As2O3與AZT聯(lián)合用藥對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)行為相吻合。

綜上所述，在As2O3與AZT聯(lián)合治療肝癌的過(guò)程中，AZT扮演著As2O3增敏劑的重要角色，其在協(xié)同抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及促進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上大大地減少了As2O3的使用劑量，起到了減毒增效的作用。AZT的As2O3增敏作用可能與其影響AQP9的表達(dá)有關(guān)，其可能通過(guò)上調(diào)AQP9的表達(dá)增加肝癌細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性，從而促進(jìn)As2O3的吸收，提高As2O3的利用效率。

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