成 丹，聶天驕，李成慧

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et M.go）蘭科石斛屬多年生附生草本植物，又名鐵皮蘭、黑節(jié)草，生于海拔達(dá)1600m的山地半陰濕的巖石上。其莖入藥，屬補(bǔ)益藥中的補(bǔ)陰藥，有滋陰益胃，清熱生津，有提高人體免疫功能、防治腫瘤和延年益壽等功效，被廣泛應(yīng)用于臨床和日常生活保健[1]。被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)藥用植物。鐵皮石斛種子在自然條件下繁殖率極低，而又由于人們的過度開采，鐵皮石斛野生資源被采挖殆盡，已經(jīng)瀕臨滅絕，因此鐵皮石斛在市場(chǎng)上的價(jià)格居高不下，且在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)無大規(guī)模的供應(yīng)[2]。鐵皮石斛種苗組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖已初具規(guī)模，但一次成苗技術(shù)鮮有報(bào)道。組織培養(yǎng)一次成苗技術(shù)即是用一種培養(yǎng)基完成種苗的整個(gè)生長(zhǎng)過程，極大簡(jiǎn)化了組織培養(yǎng)流程。在鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究中多以種子為外植體[3]，但是鮮有以莖段為外植體的一次成苗技術(shù)的報(bào)道，且可適于外植體培養(yǎng)的種子很少，很難滿足市場(chǎng)需求。本研究旨在簡(jiǎn)化育苗流程，降低成本，促進(jìn)鐵皮石斛的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的鐵皮石斛材料于2017年5月選自于江蘇省林科院。挑選健康、無病蟲害植株，以莖段作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理。選取長(zhǎng)勢(shì)良好、均勻、葉片繁茂的鐵皮石斛材料，將其莖段從植株上剪下，去掉葉片后，剪取一定長(zhǎng)度的帶節(jié)間莖段，將其放入搪瓷缸中，再將紗布蓋在搪瓷缸口，用流水沖洗20min。之后再將洗衣粉倒在搪瓷缸里，用玻璃棒攪拌均勻，浸泡30min。用流水沖洗干凈后，將材料用75%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗1次，再用0.1%的升汞浸泡8min，用無菌水沖洗5～8次，材料滅菌后應(yīng)立即取出，然后放在無菌紙上瀝干，留待接種。

1.2.2 一次成苗初代培養(yǎng)基的篩選。基本培養(yǎng)基使用MS 和 1/2MS，分別添加 0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L 的NAA與1mg/L、3mg/L、5mg/L的6-BA，在此基礎(chǔ)上添加香蕉泥100g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5g/L，pH值為5.8。將消毒好的鐵皮石斛莖段接種在上述不同處理的培養(yǎng)基中，每種處理接種外植體10瓶，每瓶接種5個(gè)莖段材料。將所有的組培苗放在光照強(qiáng)度為2000Lx，溫度為（25±2）℃的培養(yǎng)室里，35d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。不定芽的誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出芽苗數(shù)/未污染的接種數(shù)，統(tǒng)計(jì)并作好記錄，從而篩選出一次成苗的最適培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基為1/2MS的鐵皮石斛組培苗不定芽的誘導(dǎo)率普遍比基本培養(yǎng)基為MS的不定芽誘導(dǎo)率高，且長(zhǎng)勢(shì)普遍良好，比基本培養(yǎng)基為MS的組培苗效果更加明顯，誘導(dǎo)的不定芽更多，更加壯實(shí)。在接種莖段后的5～15d內(nèi)，不同處理的鐵皮石斛組培苗都開始發(fā)芽，但是隨著時(shí)間的推移，在生長(zhǎng)后期開始出現(xiàn)明顯差距，有的不定芽生長(zhǎng)不明顯，有的不定芽生長(zhǎng)慢，非常細(xì)弱?；九囵B(yǎng)基為1/2MS的鐵皮石斛組培苗明顯長(zhǎng)勢(shì)普遍更佳，組培苗的不定芽數(shù)更多，不定芽長(zhǎng)得更加健壯。

培養(yǎng)基中不同濃度的激素含量對(duì)組培苗的不定芽的生長(zhǎng)誘導(dǎo)及促進(jìn)有一定程度的差異。在植物組織培養(yǎng)中最常用的是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，本實(shí)驗(yàn)選用了其中最具代表性的NAA和6-BA來進(jìn)行研究。

當(dāng)培養(yǎng)基中的激素NAA濃度在0.5mg/L時(shí)，鐵皮石斛組培苗不定芽生長(zhǎng)的數(shù)量及其誘導(dǎo)率相比，NAA濃度為0.3mg/L以及0.7mg/L時(shí)更多更高，而且較其而言，當(dāng)培養(yǎng)基中的NAA為0.5mg/L時(shí)其組培苗長(zhǎng)勢(shì)更佳，不定芽長(zhǎng)得更加壯實(shí)、健康、旺盛。但當(dāng)NAA在0.3mg/L以及0.7mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率相比較而言較低，對(duì)組培苗不定芽的生長(zhǎng)，不定芽的誘導(dǎo)有一定程度的抑制作用；當(dāng)培養(yǎng)基中的6-BA為3mg/L時(shí)，鐵皮石斛組培苗的不定芽的誘導(dǎo)率比較高，不定芽生長(zhǎng)的數(shù)量及其誘導(dǎo)率相比6-BA濃度為1mg/L以及5mg/L時(shí)更多更高，且培養(yǎng)基中的6-BA為3mg/L的石斛組培苗長(zhǎng)勢(shì)相較更佳，當(dāng)培養(yǎng)基中的6-BA濃度為1mg/L及5mg/L時(shí)，對(duì)鐵皮石斛組培苗的不定芽的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)起到一定程度的抑制作用，長(zhǎng)勢(shì)也相較略差，不定芽長(zhǎng)得比較緩慢，瘦弱。數(shù)據(jù)表明：隨著培養(yǎng)基中的激素NAA濃度的提高，激素6-BA對(duì)不定芽誘導(dǎo)與生長(zhǎng)的影響呈現(xiàn)著先增大后減小的趨勢(shì)，這說明過高或過低濃度的6-BA對(duì)不定芽的增殖有著一定程度的抑制作用。從整體來看，培養(yǎng)基中的激素NAA對(duì)鐵皮石斛組培苗不定芽誘導(dǎo)與生長(zhǎng)的影響隨著其濃度的增高而逐漸開始抑制。由此可見：選取合適的培養(yǎng)基激素濃度對(duì)組培苗不定芽的增殖有顯著的促進(jìn)作用。

表1 不同的培養(yǎng)基對(duì)成苗的影響

總的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明：培養(yǎng)基中的NAA濃度在0.5mg/L以及其中的激素6-BA濃度為3mg/L時(shí)，鐵皮石斛的組培苗不定芽的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)情況為最佳狀態(tài)，這2種濃度的激素都極利于不定芽的生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中加入的激素NAA濃度 為0.3mg/L、0.7mg/L以及培養(yǎng)基中的激素6-BA濃度為1mg/L、5mg/L時(shí)，組培苗的不定芽誘導(dǎo)率都相較較低而且不定芽的數(shù)量也很少，生長(zhǎng)明顯緩慢，生長(zhǎng)后期幾乎停止生長(zhǎng)，且不定芽長(zhǎng)得十分瘦弱，長(zhǎng)勢(shì)不佳。因此，由此可得出鐵皮石斛一次成苗的最適培養(yǎng)基配方為：1/2MS+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L+香蕉泥100g/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 3mg/L，pH值為5.8，這一培養(yǎng)基最利于鐵皮石斛組培苗不定芽的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)。

3 討論

石斛一直被認(rèn)為是中藥中的上品，已在臨床上及中藥復(fù)方中被廣泛應(yīng)用。況且，鐵皮石斛的花朵外形優(yōu)美，花香怡人，廣受人們的喜愛并具有極高的觀賞價(jià)值，在國(guó)際花卉市場(chǎng)上占有重要的地位。但是由于人們對(duì)鐵皮石斛的過度開采，它的的野生生態(tài)壞境遭到嚴(yán)重破壞，野生資源正在大幅度減少，已瀕臨絕跡，但是與此同時(shí)，它的市場(chǎng)的需求量在逐年上升，鐵皮石斛材料短缺，作為瀕臨滅絕的受保護(hù)中藥品種之一[4]，市場(chǎng)售價(jià)較高。鐵皮石斛人工培養(yǎng)具有重大意義，現(xiàn)關(guān)于鐵皮石斛快繁體系研究頗多并有顯著成果，在市場(chǎng)上多已利用于規(guī)模生產(chǎn)，但在其組織培養(yǎng)繁殖[5]方面仍存在問題，并且關(guān)于以其莖段為外植體的一次成苗技術(shù)鮮有報(bào)道，其系統(tǒng)性也不夠，本研究主要在前人研究的基礎(chǔ)上，課題組成員多方查閱文獻(xiàn)資料，廣泛進(jìn)行調(diào)查研究，對(duì)國(guó)內(nèi)外本項(xiàng)目領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀進(jìn)行分析，對(duì)鐵皮石斛一次成苗過程進(jìn)行初步研究，以期能夠簡(jiǎn)化鐵皮石斛組培種苗培育的流程，將其投入大規(guī)模的工廠生產(chǎn)可大大降低成本，縮短種苗的繁育時(shí)間，以期推動(dòng)鐵皮石斛的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程

（收稿：2018-01-11）

參考文獻(xiàn)：

[1]楊善巖,李海龍,狄志鴻.鐵皮石斛原球莖富鉻培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù),2013,（12）:1702-1706

[2]宋順,許奕,王必尊,等.不同培養(yǎng)基成分對(duì)鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29（13）:133-139．

[3]譙德惠.鐵皮石斛：藥用價(jià)值更勝一籌[J].中國(guó)花卉園藝,2014（5）:26-28

[4]楊冬華,羅冠勇,鐘云芳.鐵皮石斛組培苗生產(chǎn)流程及影響的因素分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程,2013,37（3）:34-36

[5]蔣影,林昌虎,王文華,等.鐵皮石斛組培苗移栽馴化階段的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2014,35（3）:483-487