孫嘉茵　李宇茜　熊小平　樊淑宏　羅婷婷　雍志全　徐小平

摘要：對Combretastatin系列化合物的重要中間體CA4酸（CA4s）理化特征、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑和含量測定的方法進行系統(tǒng)研究。通過IR、UV、MS、NMR等確定本品的化學結(jié)構(gòu)。采用HPLC法檢測有關(guān)物質(zhì)，條件為：色譜柱C18（150mm×4.60mm，5μm），流動相（體積比）：0.1%甲酸（氨水調(diào)解pH至6.8）-甲醇-乙腈（75：22：3），檢測波長為220nm；采用HS-GC法檢測殘留溶劑，條件為：PEG20M（30m×0.53mm，1μm）的石英毛細管柱，柱溫80℃，檢測器溫度250℃（FID），進樣口溫度200℃，流量4.0mL/min，分流比：10：1；采用LC-MS鑒定本品有關(guān)物質(zhì)；以剩余滴定法測定本品的含量。結(jié)果表明：CA4酸為難溶于水的淺黃色結(jié)晶性粉末，其化學結(jié)構(gòu)與2-（3，4，5-三甲氧苯基）-3-[3-羥基-4-甲氧苯基卜丙烯酸相吻合，有6個雜質(zhì)組分，經(jīng)鑒定雜質(zhì)5和雜質(zhì)2為三甲氧基苯乙酸和異香草醛；雜質(zhì)6為z式CA4酸，受光照影響發(fā)生較大的變化反映出順反異構(gòu)的特征；殘留溶劑乙醇量小于0.08%。CA4酸為Combretastatinl類化合物的關(guān)鍵中間體，難溶于水，分子中的羧基可與堿性化合物作用生成可溶性的鹽，可突破該類化合物難溶性瓶頸，提高該類化合物抑制腫瘤血管的效率，是一個具有較高價值Combretastatins中間體或先導化合物。

關(guān)鍵詞：CA4酸；抗腫瘤藥；高效液相色譜；氣相色譜

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5124（2018）02-0041-07

0引言

Combretastatin類化合物是近年來發(fā)現(xiàn)的一類腫瘤血管抑制劑，其二苯乙烯母核的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)于南非灌木柳樹Combretumcaffrum的樹皮中，是一類具有順式二苯乙烯結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，其抗腫瘤作用機理與秋水仙堿結(jié)構(gòu)類似，是通過競爭抑制與微管蛋白相結(jié)合，從而發(fā)揮其抗有絲分裂的作用，達到抑制微管形成，阻滯細胞增殖以及抗血管活性的效果。在這類化合物中，Combretastatin A-4（CA4）具有最佳的微管抑制效果及體外細胞毒性，且對有異常結(jié)構(gòu)特征和功能的腫瘤血管具有靶向抑制性，對正常血管作用較小，因而全身毒性較小且不易產(chǎn)生耐藥性，因而備受關(guān)注。但由于CA4具有水溶性較差且難以保持其有效構(gòu)型等缺點，限制了其臨床應用。對該類化合物結(jié)構(gòu)修飾并改善其水溶性是解決它們最終抗癌作用的關(guān)鍵，包括骨架及基團修飾和合成氨基糖類衍生物等。近年，國內(nèi)外相繼開發(fā)出的CA4磷酸鹽前藥CA4P已進入II、III期臨床試驗。

本文在CA4和CA4P研究的基礎(chǔ)上，發(fā)掘一種具有酸性結(jié)構(gòu)的中間體——CA4酸（CA4s），可以通過成鹽產(chǎn)生具有良好水溶性的化合物，從而突破這類化合物的瓶頸。采用3，4，5-三甲氧基苯乙酸和異香草醛在乙酸酐和三乙胺中進行Perkin縮合反應，經(jīng)濃鹽酸處理，并經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶精制，得到（E）-3-（3-羥基-4-甲氧基苯基）-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）-丙烯酸（即CA4s，路線見圖1）。近期，CA4s與有機胺結(jié)合產(chǎn)生的DX1002作為腫瘤血管抑制劑已經(jīng)申請國家一類創(chuàng)新藥臨床試驗，而CA4s的質(zhì)量控制成為DX1002質(zhì)量的關(guān)鍵，建立中間體CA4s的質(zhì)量標準具有非常重要的意義，由于CA4s為首次開發(fā)，暫無直接的研究報道，本文根據(jù)CA4s合成特點，針對其化學結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和質(zhì)量特征進行系統(tǒng)研究，確證其化學結(jié)構(gòu)、性狀、種類，檢查其有關(guān)物質(zhì)、建立含量測定方法，為進一步深入研究開發(fā)DX1002系列化合物提供中間體的分析方法和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1實驗部分

1.1儀器和試劑

LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津），SPD-20A紫外/可見檢測器（日本島津），SePu3000色譜工作站（杭州普惠科技有限公司）；Nicolet Impact 410型紅外光譜儀（美國Nicolet儀器公司）；UV-2300紫外-可見分光光譜儀（上海天美科學儀器有限公司）；GC7890F氣相色譜儀（FID，上海天美科學儀器有限公司）；Varian UNITY INOVA型400核磁共振譜儀（美國Nicolet儀器公司）；軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（LTQ Orbitrapelite美國熱電分析儀器公司）；pHS-3C型酸度計（成都方舟科技開發(fā)公司）；Sartorious BT 125D十萬分之一電子（德國Sartorius）；SHANGPING FA2004萬分之一電子天平（上海天平儀器廠）；KL10260D型超聲波清洗器（上海荊和分析儀器有限公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（成都市予華偉業(yè)儀器有限公司）；超純水機（成都品成科技有限公司）；旋渦振蕩器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）。

CA4s樣品及其順式結(jié)構(gòu)樣品（自制，東莞達信生物技術(shù)有限公司）；異香草醛對照品（Adamas Reagentco.，Ltd.，批號：P1097634）和3，4，5-三甲氧基苯乙酸對照品（Adamas Reagentco.，Ltd.，批號：P03109）；氫氧化鈉（AR，天津市科密歐化學試劑有限公司）；濃硫酸（AR，成都市天華科技股份有限公司）；甲醇（HPLC，天津科密歐化學試劑有限公司）；乙腈（HPLC，進口分裝）；氨水（AR，廣東光華科技股份有限公司）；無水乙醇（HPLC，天津科密歐化學試劑有限公司）；水為純水機自制超純水。

1.2方法

1.2.1CA4s的結(jié)構(gòu)確證

分別通過核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）、紅外分光光度法（IR）和紫外分光光度法考察（CA4s）的結(jié)構(gòu)。

1.2.2CA4s的理化性質(zhì)測定

1）性狀的考察。取潔凈濾紙一張，挑取樣品少許置于其上，平鋪均勻，于自然光下觀察。取3份樣品適量，分別置于高溫（60℃）、高濕（相對溫度為92.5%）和光照（4500k）條件下1h，觀察外觀變化。

2）溶解度的考察。照ChP.2015凡例要求，稱取樣品適量，于（25±2）℃條件下，加入待考察的溶劑適量，每隔5min強力振搖30s，觀察溶解情況。考察溶劑包括：水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、DMSO、DMF。

3）pH的考察。取樣品適量，加超純水配制飽和溶液，測定pH。

4）酸、堿條件下紫外圖譜。取樣品適量，精密稱定，分別加0.1mol/LhCl溶液和0.1mol/LnaOH溶液制成含量為20μg/mL的溶液，在波長200～400nm進行紫外掃描。

1.2.3有關(guān)物質(zhì)的研究

1）色譜條件的確定

以CA4P分離色譜條件為基礎(chǔ)，確定對CA4s的色譜條件為C18（150mm×4.60mm，5μm）；流動相比例（體積比）為0.1%甲酸（pH 6.8）-甲醇-乙腈（75：22：3），柱溫30℃，流量1mL/min。

2）方法學驗證

照上述建立的CA4s有關(guān)物質(zhì)HPLC檢測條件進行了相關(guān)方法學驗證，內(nèi)容包括：1）專屬性試驗；2）檢測限與定量限的測定；3）精密度試驗（進樣精密度、重復性精密度及中間精密度）。

3）重要有關(guān)物質(zhì)的鑒定研究

根據(jù)CA4s合成工藝及其有關(guān)物質(zhì)分離結(jié)果表明，本品除了來自原料的異香草醛、三甲氧基苯乙酸外，受溫度和光照影響最明顯的為本品主峰后的雜質(zhì)峰，為此，采用LC/MS對雜質(zhì)進一步鑒定。色譜條件為ODS（4.6mm×250mm）色譜柱：流動相0.1%甲酸（氨水調(diào)pH 6.8）-甲醇-乙腈=75：22：3，流量1mL/min，進樣量為10μL，柱溫40℃：質(zhì)譜條件為安捷倫三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜，干燥氣為氮氣，氣體溫度：350℃，流量：11L/min，電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓：4kV，霧化氣壓力：40psi（1psi=6.895kPa），裂解電壓：75V，離子化方式為正模式。碰撞能量：15V，細胞加速電壓：3V，檢測方式為多重反應監(jiān)測（MRM）方法。

1.2.4殘留溶劑的檢查

根據(jù)CA4s的合成和精制工藝，確定本品殘留溶劑為乙醇（bp.78.4℃）。參照ChP.2015通則0521氣相色譜法和通則0861殘留溶劑測定法，建立氣相色譜法檢測CA4s中的殘留乙醇并進行方法學驗證。

1）色譜條件的選擇

本文對色譜柱SE-54（30m×0.32mm，0.25μm）、OV-624（30m×0.53mm，0.5μm）、OV-17（15m×0.53mm，1.0μm）、PEG（30m×0.53mm，1μm）；分流比（200：30、200：25、200：20、200：20、200：15、200：10、200：5）；流量3.5，4.0，4.5mL/min和柱溫60，80，100，120℃、進樣方式（直接進樣、頂空進樣）以及溶劑（DMF、DMSO）等條件做了篩選，以乙醇的理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子為指標進行考察。

2）線性與靈敏度

CA4s中殘留乙醇約0.1%，因此設(shè)置線性范圍為0.0067-1.0796mg/mL，進樣濃度為0.0067，0.0135，0.0270，0.0540，0.1080，0.2699，0.5398，1.0796mg/mL。頂空后，依次精密量取上述溶液1mL分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。按信噪比法，在S/N≥10，確定定量限，在S/N≥3，確定檢出限。

3）回收率

供試品溶液的配制：分別精密取本品9份（每份約1g）置于10mL容量瓶中，分為高、中、低3組。往低濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mL的對照品溶液0.8mL；往中濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mL對照品溶液1mL；往高濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mt的對照品溶液1.2mL，加入DMSO稀釋至刻度，分別作為CA4s回收率80%、100%、120%的供試品溶液。

1.2.5含量測定研究

根據(jù)CA4s結(jié)構(gòu)（見圖2）中的羧基呈酸性的特點，試驗將采用酸堿滴定法就其含量進行測定。由于CA4s水溶性極差，所以，在設(shè)計本品含量測定方法時，采用了以定量過量NaOH溶液溶解，然后用硫酸標準溶液滴定的剩余滴定法來實現(xiàn)。

1）滴定曲線的測定及指示劑的選擇

取樣品約100mg，精密稱定，加入0.1mol/LnaOH滴定液25mL，搖勻溶解后加入50mL新沸水，用0.05mol/Lh2SO4滴定液滴定至溶液中有沉淀析出，并在滴定過程中，記錄滴定過程的pH值變化，繪制滴定曲線。

2）精密度試驗

重復性精密度：取同一批CA4s 6份，經(jīng)含量測定，以CA4s的含量計算重復性精密度：中間精密度試驗：取本品，分別由兩個不同的實驗員連續(xù)6d、每人測定6份樣品含量，計算含量平均值和RSD。

2結(jié)果與討論

2.1結(jié)構(gòu)確認

如圖3所示，MS的分子離子峰（+m/z）為359，碎片峰與CA4s的分子量360的M-1吻合：NMR tH譜（圖4）的氫譜的歸屬分別為：63.296（d，3H，4"--OCH3），δ3.753（d，9H，3，4，5-OCH3），δ6.484（s，2H，2，6'-H），δ6.545（s，1H，2"-H），δ6.676（d，1H，5"-H），δ6.788（d，1H，6"-H），δ7.707（s，1H，3-H），除兩個活潑氫被D2O氘代，其他皆與結(jié)構(gòu)吻合（具體編號見圖2）；IR光譜（圖5）中波數(shù)3300，2900，1670，1600，1400cm^-1等分別表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)中的羥基、甲基、羰基、甲氧基等，與CA4s分子結(jié)構(gòu)中的相關(guān)基團吻合；UV光譜（圖6）特征表明，本品具有共軛體系，受羧基和酚羥基的影響，B帶和E帶都發(fā)生長移現(xiàn)象，最大吸收為311nm，與CA4s的機構(gòu)特征吻合。4大譜結(jié)果表明本品的結(jié)構(gòu)為2-（3，4，5-三甲氧基-苯基）-3-（3-甲氧基2-羥基-苯基）丙烯酸。對比本品順反式UV譜（圖7）可知，由于羥基苯基在空間上影響到羧基的作用，使得311nm的最大吸收萎縮，并250nm的肩峰凸顯，由此證明本品系羧基與羥苯基于異側(cè)的反式或E式結(jié)構(gòu)。即（E）2-（3，4，5'-三甲氧基-苯基）-3-（3”-甲氧基2"-羥基-苯基）丙烯酸。

2.2理化性質(zhì)

試驗結(jié)果表明，本品為淺黃色結(jié)晶性粉末；在高溫和高濕條件下較穩(wěn)定，光照時出現(xiàn)顏色加深。難溶于水，微溶于甲醇和丙酮，易溶于乙醇，是其難以以原型發(fā)揮活性的根源，飽和水溶液的pH為6.48，在酸性條件較穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定。

2.3有關(guān)物質(zhì)研究

2.3.1色譜分離的影響因素

如圖8所示，水相的pH對分離呈負相關(guān)，pH升高保留時間縮短：水相比例提高保留時間增加；柱溫對本品色譜行為無明顯影響。

2.3.2有關(guān)物質(zhì)的鑒定

結(jié)合CA4s的合成途徑，起始原料3，4，5-三甲氧基苯乙酸和異香草醛的色譜定位，以及LC/MS對本品雜質(zhì)譜的分離和在線鑒定，分離出6個雜質(zhì)組分，其中本品主峰前的雜質(zhì)2為異香草醛、雜質(zhì)5為3，4，5-三甲氧基苯乙酸。而雜質(zhì)6與主峰分子質(zhì)量相同，但保留時間相差甚遠，結(jié)合紫外吸收圖譜和核磁共振氫譜分析，確定雜質(zhì)6為CA4s的順式（Z式）異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)如圖9所示。

2.3.3檢出限和定量限

按信噪比法，在S/N≥10和S/N≥3，確定CA4s的定量限為1ng、檢出限為0.2ng。

2.3.4專屬性試驗

結(jié)果表明，酸破壞（4mol/LhCl破壞4h）和堿破壞（4mol/LnaOH破壞4h）條件下，供試品溶液雜質(zhì)峰數(shù)量無明顯增加，主峰也無明顯降解；在氧化破壞（30%H2O2破壞4h）和高溫破壞（160℃放置1h）條件下，雜質(zhì)峰含量略有增加，主峰無明顯降解。在光照破壞（4500Lx破壞4h）條件下，雜質(zhì)峰數(shù)量和含量都有增加，雜質(zhì)6含量增加尤為明顯，主峰也顯著降解。

2.3.5精密度

連續(xù)進樣6針，各雜質(zhì)峰面積RSD在2.27%～5.03%，表明此方法進樣精密度良好。平行配制6份供試品溶液進樣，以不加校正因子的自身稀釋對照法計算各雜質(zhì)含量，RSD在1.63%-4.67%之間，表明此方法重復性良好。連續(xù)3d，每天由兩名實驗員平行配制6份供試品溶液進樣，以不加校正因子的自身稀釋對照法計算各雜質(zhì)含量，RSD在2.84%～5.07%，表明此方法中間精密度良好。

2.3.6有關(guān)物質(zhì)的含量檢查

用建立的方法對自制3批樣品進行有關(guān)物質(zhì)檢查，3批樣品中單個雜質(zhì)含量均小于0.05%，總雜質(zhì)含量小于0.5%，符合規(guī)定。

2.3.7有關(guān)物質(zhì)研究小結(jié)

由于CA4s在水中幾乎不溶，采用甲醇作為溶劑時，各雜質(zhì)峰有關(guān)物質(zhì)峰理論塔板數(shù)均較低，對稱性差，且溶劑峰對保留時間短的雜質(zhì)出峰影響很大。故采用甲醇溶解樣品制成高濃度的儲備液（約為5mg/mL），再用流動相作為溶劑，稀釋制成0.5mg/mL的供試品溶液，采用這種方法制備的供試品溶液色譜圖中，各雜質(zhì)峰柱效有了顯著提高。通過專屬性試驗可以看出，CA4s對酸性、堿性、氧化、高溫條件耐受性較高，在光照的條件下容易發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn)，得到順式結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)6。因此在合成和儲存過程中，應注意避光。

2.4殘留溶劑

2.4.1色譜條件影響

與其他3種類型色譜柱相比較時，PEG毛細管色譜柱在柱效、分離度和峰對際性方面均有明顯優(yōu)勢，并且分析時間合適；分流比對本品分析影響較大，隨著分流比增大，出峰時間延遲，乙醇峰理論塔板數(shù)升高，與基質(zhì)中的雜質(zhì)峰分離度有所提高，但靈敏度有所下降，當分流比10：1時，既能保證乙醇峰有較高的柱效、分離度和對稱性，保留時間也比較合適，故選擇分流比10：1；不同流量對本品分析影響不大，流量4.0mL/min時，有較好的柱效、分離度、對稱性，能保證殘留溶劑乙醇的有效檢出，故選擇流量4.0mL/min；柱溫對柱效和拖尾因子影響不大，但隨著柱溫的升高，乙醇峰的分離度顯著下降，柱溫80℃時，能保證殘留溶劑乙醇的有效檢出，且與空白溶劑中相關(guān)峰達到有效分離，故照國家藥品標準，選擇柱溫80℃：頂空進樣與直接進樣相比，柱效和峰對稱性等方面均有明顯優(yōu)勢，頂空進樣可避免基質(zhì)影響和樣品對色譜柱的污染，故選擇頂空進樣方式；溶劑DMF在乙醇峰前面有溶劑峰，影響乙醇的檢出，故選擇DMSO作為殘留溶劑檢查的樣品溶劑。

2.4.2系統(tǒng)適應性條件

色譜柱為PEG毛細管色譜柱（30m×0.53mm，1μm），柱溫80℃，檢測器為氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度250℃：進樣口溫度200℃；載氣為氮氣，流量為4.0mL/min，分流比10：1；頂空進樣，頂空瓶溫度80℃，平衡時間40min進樣：進樣體積1.0mL。

2.4.3線性與靈敏度

由乙醇峰高（H）對乙醇溶液濃度回歸作圖，獲得乙醇的標準曲線方程為y=674724.8172x-2034.2，（r²=0.9993）。乙醇濃度在0.0067-1.0796mg/mL范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好。按信噪比法，在S/N≥10，確定定量限1.8μg/mL；在S/N≥3，確定檢出限為0.6μg/mL。

2.4.4回收率與精密度

經(jīng)過高、中、低3種濃度的回收率測定結(jié)果分別為98.06%（RSD為4.57%）、103.6%（RSD為1.73%）、93.63%（RSD為7.21%）：進樣精密度RSD為1.90%；重復性精密度測定殘留溶劑含量為0.0739%（RSD為4.10%）。方法的準確度和精密度均良好。

2.4.53批樣品的殘留溶劑結(jié)果

用建立的方法對自制3批樣品進行殘留溶劑檢查，3批樣品中殘留溶劑含量為0.0748%、0.0727%、0.0795%，符合規(guī)定。

2.5含量測定

2.5.1滴定曲線的考察

滴定曲線確定突躍范圍為7.5～9.0，由于本品為難溶于水的酸性化合物，故實驗設(shè)計本品預先溶于定量的NaOH溶液中，由HCl標準溶液回滴定剩余的堿液，經(jīng)空白校正后，計算出本品的含量。根據(jù)溶液體系由堿到酸的滴定過程，試驗選擇了堿性指示劑酚酞指示終點，溶液由紅色變?yōu)闊o色。

2.5.2CA4s的含量測定方法

取樣品約300mg，精密稱定，加入0.1mol/LnaOH滴定液25mL，充分搖勻溶解后加入50mL新沸水，加入酚酞指示劑2滴，用0.05mol/Lh2SO4滴定液滴定至溶液紅色消失，且0.5min內(nèi)顏色無改變，并將結(jié)果用空白試驗校正。每1mLh2SO4（0.05mol/L）滴定液相當于36.04mgc19H20O7。

2.5.3精密度試驗

重復性精密度測定結(jié)果為100.7%（RSD 0.08%）：中間精密度測定結(jié)果為100.5%（RSD 0.11%），說明此方法精密度良好。

2.5.4 3批樣品含量測定

用建立的方法對自制3批樣品含量進行測定，3批樣品含量分別為100.4%（RSD 0.057%）、100.6%（RSD 0.150%）、100.6%（RSD 0.057%）。

2.5.5容量法研究小結(jié)

采用酚酞作為指示劑時，溶液濃度對重點判斷影響很大，濃度越大變色現(xiàn)象越不明顯，經(jīng)過多次對比試驗，在堿溶液中加入50mL新沸水對溶液進行稀釋后，能顯著觀察到變色現(xiàn)象，有利于減少終點誤差。

3結(jié)束語

CA4s作為Combretastatin類化合物重要中間體，其質(zhì)量將對終產(chǎn)物造成直接影響。本品的化學結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明與CA4s的結(jié)構(gòu)式吻合：所建立的HPLC雜質(zhì)檢查法、GC殘留溶劑檢查法和容量分析法能夠有效檢測出本品的有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑和含量，可為進一步研究CA4s提供良好的分析手段。