劉遠征 漆艷香 曾凡云 丁兆建 何壯 彭軍 張欣 謝培蘭 謝藝賢

摘 要 本研究克隆并鑒定香蕉枯萎病菌4號生理小種（Foc4）β1-微管蛋白（β1-tub）基因，采用Split-marker同源重組技術(shù)獲得Foc4的β1-tub基因敲除突變體，通過測定突變體菌株的生長速度、產(chǎn)孢量、致病力及對多菌靈敏感性，研究β1-tub基因在香蕉枯萎病菌的生長發(fā)育及對多菌靈抗藥性中的作用。結(jié)果表明：與Foc4野生型菌株相比，敲除突變體生長緩慢、菌絲畸形及產(chǎn)孢量增加，對巴西蕉苗的致病力明顯減弱，但對多菌靈的抗性水平無明顯變化。由此推測β1-tub基因可能在Foc4的生長發(fā)育、產(chǎn)孢及致病力等方面具有重要的作用。

關鍵詞 香蕉枯萎病菌；β1-微管蛋白；基因敲除；致病力

中圖分類號 S436.681 文獻標識碼 A

Functional Analysis of the β1-tubulin Gene in Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race 4

LIU Yuanzheng1，2， QI Yanxiang2， ZENG Fanyun2， DING Zhaojian2， HE Zhuang1，2，

PENG Jun2， ZHANG Xin2， XIE Peilan2， XIE Yixian2*

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract In this study， the β1- tubulin （β1-tub） gene in F.oxysporum f. sp. cubense race 4 （Foc4） was cloned and identified. The gene-knockout mutants of β1-tub gene in Foc4 were obtained by split-marker homologous recombination technique. The growth rate， sporulation， pathogenicity and sensitivity to carbendazim of the mutant strain were studied to investigate the effects of β1-tub on the growth， development and carbendazim resistance in Foc4. The results demonstrated that the knockout mutants of β1-tub showed slow growth， the hyphal deformity and increased conidium production， and significantly decreased pathogenicity to banana （Cavendish， AAA）， but no significant change in the resistance level to carbendazim when compared with the wild type isolate of Foc4. Therefore， we hypothesized that the β1-tub gene might play an important role in the growth， sporulation and pathogenicity of Foc4.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense； β1- tubulin； gene knockout； pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.017

由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）引起的香蕉枯萎病是破壞香蕉維管束導致植株死亡的毀滅性土傳維管束病害，已給香蕉產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。在實際生產(chǎn)中，使用化學殺菌劑、生物藥劑對香蕉枯萎病防治的效果并不理想。種植抗（耐）病品種是當前該病綜合治理中最為有效的方法之一。然而，目前生產(chǎn)上栽培的較抗（耐）枯萎病香蕉品種均是通過體細胞無性系變異獲得的，通過無性變異獲得的抗耐病品種易因病原菌的進化而逐漸喪失抗病性[1]。

苯并咪唑類殺菌劑（如多菌靈及以多菌靈為主的混/復配藥劑）具有廣譜、 高效、作用靶標位點單一和內(nèi)吸性等特點，被廣泛用于防治鐮刀菌引起的植物病害[2-3]。該類殺菌劑主要作用于病原菌的β-微管蛋白，阻止菌體形成紡錘體，進而抑制有絲分裂，但由于藥劑作用位點單一，病原菌在藥劑選擇壓力下較易產(chǎn)生抗藥性[4-5]。已有研究結(jié)果表明，多菌靈對香蕉枯萎病有一定防預作用[6]，但效果不太理想。

目前，由于缺乏理想的化學藥劑、抗病品種等防治措施，香蕉產(chǎn)業(yè)面臨著極大的威脅。近年來，對于香蕉枯萎病的致病機理與致病相關基因的研究已經(jīng)在G蛋白、過氧化氫酶、MAPK通路等方面取得了一定進展[7-11]。對于β-微管蛋白的研究主要集中在其突變所產(chǎn)生的抗藥性等方面[12]。

為了闡明香蕉枯萎病菌中β1-微管蛋白基因是否在抗藥性及在病原菌致病過程中發(fā)揮作用，利用同源重組的原理獲得了該基因的敲除突變體，并對敲除突變體的生長速度、產(chǎn)孢量、致病力及對多菌靈敏感性等生物學特性進行分析，完善該基因的具體功能，為香蕉枯萎病菌對多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生的抗藥性及其致病機理的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和香蕉品種 香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)oc4），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所熱帶果樹病害課題組鑒定保存。試驗接種用香蕉品種為巴西蕉（Cavendish，AAA）（5～7片葉）。

1.1.2 供試藥劑 使用前將98%多菌靈原藥（湖北康寶泰精細化工有限公司）溶解于0.1 mol/mL鹽酸中，配成10 mg/mL的母液，然后用無菌水將母液稀釋配成1 mg/mL工作液。

Congo Red（剛果紅，CR）購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Calcofluor White Stain（熒光增白劑，CFW）購于北京的sigma-aldrich。

1.2 方法

1.2.1 Foc4野生型菌株對多菌靈的敏感性測定 參照曾凡松等[13]的方法對供試菌株進行多菌靈敏感性測定。將Foc4野生型菌株的菌餅接種到0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 μg/mL 7個處理終濃度的多菌靈PDA平板中。28 ℃下培養(yǎng) 7 d，每個處理重復3皿，試驗重復 3次。最終計算抑制中濃度EC50。

1.2.2 香蕉枯萎病菌基因組DNA的制備 將野生菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，收集新鮮菌絲，液氮速凍?；蚪MDNA提取按照Biomiga Fungal gDNA Kits（Biomiga）說明書進行。

1.2.3 β1-微管蛋白基因克隆與分析 根據(jù)已完成測序的香蕉枯萎病菌熱帶4號生理小種菌株54006的β1-微管蛋白基因（β1-tub）核酸序列（GenBank登錄號：JH658279.1），在ORF兩端設計基因特異性引物對：TUBU1-2F（5′-AATAGCCTGGAAGGAACCGC-3′）/ TUBU1-2R（5′-ATGTCAAGTCCCTGCTCGCA -3′）。PCR擴增反應在PTC200 PCR儀（MJ RESEARCH）上進行。PCR反應總體積25 μL，其中10× PCR 緩沖液 （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTPs混合物（2.5 mmol/L）2 μL，引物對各0.5 μL（20 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），DNA 模板100 ng，無菌超純水補足至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后連接到T-Vector pMD19（Simple）載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，將獲得的陽性克隆送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。將測得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析，通過BLAST搜索分析β1-微管蛋白基因的同源性，用Clustal X （2.0）軟件進行多序列比對，采用MEGA 6.0軟件以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 β1-tub基因敲除重組片段擴增 根據(jù)Foc4基因組DNA測序序列，采用Split-marker重組技術(shù)進行PCR擴增獲得β1-tub基因敲除重組片段。設計引物FOC4TUB-LBCK和FOC4TUB-HPH-LB-R、FOC4TUB-HPH-RB-F和FOC4TUB-RBCK擴增β1-tub基因上下游片段；設計引物HYG-F和HYG-R擴增潮霉素（HYG）基因片段；重組PCR用引物FOC4TUB-LB-F和HYG-R1、HYG-F1和FOC4TUB-HPH-RB-F來擴增上下游片段，所有引物序列見表1。

1.2.5 原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化 Foc4野生型菌株原生質(zhì)體制備參照王飛燕等[14]的方法。PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照徐齊君等[15]的方法，略作修改。分別取50 μL的上下游重組片段，緩慢加入到300 μL原生質(zhì)體中，輕輕混勻，室溫放置20 min；緩慢滴加1.5～2 mL PTC溶液，室溫放置20 min；將上述反應液加入到再生培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL潮霉素B）中，混勻后，倒于培養(yǎng)皿上；于 28 ℃培養(yǎng) 3～7 d后獲得轉(zhuǎn)化子，并連續(xù)培養(yǎng)3代獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

1.2.6 β1-tub敲除突變體鑒定 采用CTAB法[16]提取Foc4與抗性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，根據(jù)β1-tub基因上游片段和潮霉素基因序列設計引物FOC4TUB-LBCK和HPT-RBCK（表1），根據(jù)潮霉素基因序列和β1-tub基因下游片段設計引物HPT-LBCK和FOC4TUB-RBCK（表1），根據(jù)β1-tub基因全長設計內(nèi)源特異引物TUB1-CKFP和TUB1-CKRP，根據(jù)潮霉素全長片段設計特異引物HYG-F和HYG-R（表1），利用這4對引物對轉(zhuǎn)化子進行PCR鑒定，引物TUB1-CKFP/TUB1-CKRP無擴增條帶，而引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK、HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK和HYG-F/HYG-R可擴出目的片段的轉(zhuǎn)化子為陽性β1-tub基因敲除突變體。

提取Foc4野生型菌株和β1-tub基因敲除突變體菌株的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以Foc4野生型菌株的cDNA模版為對照，引物actin-F/actin-R為內(nèi)參，引物QRT-TUB1-F/QRT-TUB1-R為β1-tub特異引物進行實時定量PCR驗證敲除突變體。

1.2.7 β1-tub敲除突變體對多菌靈的敏感性測定 將β1-tub敲除突變體接種到含有不同濃度多菌靈的PDA平板中，方法同1.2.1，其中Foc4作為對照，并計算β1-tub敲除突變體的抑制中濃度EC50值。

1.2.8 β1-tub敲除突變體生長特性分析 生長形態(tài)和生長速率測定：將Foc4和β1-tub敲除突變體的5 mm 新鮮菌餅接種到PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)，分別在接種后2、4、6、7 d 觀察拍照，并于每天測量菌落直徑，每次設3個重復。

產(chǎn)孢量分析：分別從長有β1-tub敲除突變體和Foc4（均培養(yǎng)了7 d）的 PDA平板上打7 mm的菌餅3個，加入無菌水后震蕩打碎，然后采用血球計數(shù)板計數(shù)，每次設3個重復。

菌絲顯微觀察：分別從長有β1-tub敲除突變體和Foc4（均培養(yǎng)了7 d）的PDA平板上取少量菌絲到載玻片上，制片后進行顯微觀察。

1.2.9 β1-tub敲除突變體對脅迫因子的敏感性分析 Foc4和敲除突變體菌株在PDA平板活化7 d，打取7 mm的菌餅分別接種于含有Congo Red（終濃度100 μg/mL）、Calcofluor White Stain（終濃度100 μg/mL）、NaCl（終濃度0.7 mol/L）、H2O2（終濃度4 mmd.L-1）的minimal medium（MM）平板上，以未處理的MM平板作為對照，28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察并拍照記錄，計算抑菌率，每次設3個重復。抑制率=（對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。

1.2.10 β1-tub敲除突變體致病性測定分析 分別將Foc4野生型菌株和敲除突變體接種于100 mL的PDB培養(yǎng)液中，置于28 ℃、160 r/min的搖床中恒溫震蕩培養(yǎng)3 d，過濾收集分生孢子，用無菌水重懸分生孢子，懸浮液至106個孢子/mL。采用盆栽傷根淋灌法測定菌株的致病性。Foc4與敲除突變體均處理15株巴西蕉苗，每株苗澆20 mL孢子懸浮液，以無菌水作為對照，設3次重復。按照常規(guī)方法栽培管理，30 d后縱向切開巴西蕉球莖，觀察球莖褐變程度及外部葉片黃化情況，參考Mohamed等[17]的病情調(diào)查分級標準，記錄每株蕉苗的發(fā)病級別并進行病情指數(shù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株對多菌靈敏感性測定

由圖1可知，生長7 d后，F(xiàn)oc4野生型菌株對多菌靈表現(xiàn)為敏感，其中EC50=0.51 μg/mL。

2.2 β1-tub基因的序列分析和同源性比較

Foc4的β-微管蛋白基因全長1 670 bp，GenBank登陸號為MF668108。該基因序列包含4個內(nèi)含子和5個外顯子，編碼1個由446個氨基酸殘基組成的蛋白。

經(jīng)BLAST分析和Clustal X比對，F(xiàn)oc4中β1-tub基因的氨基酸序列，與輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides，XP_018748359.1）、尖孢鐮刀菌番茄?；停‵. oxysporum f. sp. lycopersici，XP_018241948.1）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum，AAP68979.1）等幾種常見植物病原真菌的β1-tub氨基酸序列高度同源（圖2）。

2.3 β1-tub基因敲除重組片段擴增與突變體獲得

采用Split-marker重組技術(shù)原理進行PCR擴增（圖3-A），擴增目的條帶如圖3-B所示，第一輪PCR擴增的上下游片段，大小約為1 938、1 858 bp，同時擴增出潮霉素（HYG）基因片段，大小約為1 376 bp；第二輪PCR擴增出用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的上下游重組片段，大小約為2 419、2 136 bp。

2.4 β1-tub敲除突變體的鑒定

2.4.1 β1-tub敲除突變體PCR驗證 經(jīng)過再生培養(yǎng)和潮霉素抗性篩選，共獲得20個轉(zhuǎn)化子。分別提取Foc4和轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以其為模版，用引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK、HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK、HYG-F/HYG-R和TUB1-CKFP/TUB1-CKRP進行PCR擴增。將20個轉(zhuǎn)化子進行初步檢測，發(fā)現(xiàn)有9個為陽性轉(zhuǎn)化子，以其中3個轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模版，用引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK和HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK進行PCR擴增，分別擴增出約2.3、2 kb的2個條帶，與預計大小一致，以Foc4基因組DNA為模版擴增作為對照（圖4-A）。用引物HYG-F/HYG-R進行PCR擴增，獲得約1.4 kb的條帶，與預計大小一致，以Foc4為對照（圖4-B）。用引物TUB1-CKFP/TUB1-CKRP進行PCR擴增，無擴增條帶，以Foc4基因組DNA為模版擴增得到約0.7 kb的條帶（圖3-C），與預計大小一致。這些結(jié)果表明這3個轉(zhuǎn)化子的β1-tub基因已被敲除，故將其分別命名為Δβ1-tub-1、Δβ1-tub-2和Δβ1-tub-3。選取Δβ1-tub-1敲除突變體作為研究對象進行以下研究。

2.4.2 β1-tub敲除突變體QPCR驗證 將Foc4野生型菌株、Δβ1-tub-1、Δβ1-tub-2和Δβ1-tub-3敲除轉(zhuǎn)化子進行實時定量PCR驗證。由圖5可知，β1-tub敲除突變體不再表達β1-tub基因，說明這3個轉(zhuǎn)化子的β1-tub基因已被敲除。

誤差線代表3次生物學重復的標準誤差，不同小寫字母代表在p<0.05水平下差異顯著。下同。

The error line represents the standard error of three biological repetitions， and different small letters represents a significant difference when p<0.05. The same as below.

2.5 β1-tub敲除突變體對多菌靈敏感性測定

將Foc4野生型菌株和Δβ1-tub菌株分別接種到含有不同濃度多菌靈的PDA平板中，生長7 d后，測定Δβ1-tub菌株對多菌靈的敏感性。結(jié)果表明，Δβ1-tub對多菌靈的敏感性（EC50=0.53 μg/mL）與Foc4野生型菌株對多菌靈的敏感性（EC50=0.51 μg/mL）無明顯差異（圖6），說明β1-微管蛋白敲除突變體對多菌靈的抗性無明顯變化。

2.6 β1-tub基因敲除突變體的生長特性分析

2.6.1 β1-tub基因敲除突變體的生長速度和產(chǎn)孢量分析 將Δβ1-tub和Foc4野生型菌株分別接種于PDA平板上并培養(yǎng)7 d，每天測量菌落直徑。結(jié)果表明，生長7 d后，F(xiàn)oc4野生型菌株菌落已長滿整個平板，而Δβ1-tub菌落生長緩慢，菌落直徑約為Foc4菌落的1/5（圖 7-A、B）。計算平板菌落生長的孢子產(chǎn)量，F(xiàn)oc4的孢子產(chǎn)量約為0.937×106/mm2，Δβ1-tub的孢子產(chǎn)量約為2.704×106/mm2（圖7-C），表明Δβ1-tub的產(chǎn)孢量增加。通過光學顯微鏡觀察Foc4和Δβ1-tub的菌絲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Δβ1-tub的菌絲生長出現(xiàn)畸形（圖7-D、E）。

2.6.2 β1-tub基因敲除突變體對脅迫因子的敏感性分析 在含有100 μg/mL CR（Congo Red）和100 μg/mL CFW（Calcofluor White）條件下，F(xiàn)oc4野生型菌株和Δβ1-tub突變體菌株的生長均受到不同程度的抑制，其中，F(xiàn)oc4較Δβ1-tub抑制程度更明顯；在含0.7 mol/L NaCl的培養(yǎng)基上，F(xiàn)oc4和Δβ1-tub均表現(xiàn)出一致的長勢，生長沒有受到抑制；在含4 mmol/L H2O2 的培養(yǎng)基中，F(xiàn)oc4和Δβ1-tub的生長均受到不同程度的抑制，F(xiàn)oc4較Δβ1-tub抑制程度更明顯（圖8）。上述結(jié)果表明，β1-tub敲除突變體對細胞壁選擇性壓力、氧化壓力和滲透壓均不敏感。

2.7 β1-tub基因敲除突變體的致病性

將Foc4和β1-tub基因敲除突變體菌株Δβ1-tub分別接種巴西蕉（Cavendish，AAA）幼苗。30 d后觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種野生菌株的巴西蕉苗葉片出現(xiàn)黃化枯萎現(xiàn)象，植株下部葉片大部分褪綠、變黃，且切開球莖觀察到球莖部位褐化嚴重，病害嚴重度達到3～4級；而接種Δβ1-tub菌株的巴西蕉苗與接種H2O的對照巴西蕉苗均未出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象，且球莖無褐化現(xiàn)象（圖9-A）。根據(jù)病情指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，接種Δβ1-tub菌株的巴西蕉苗平均病情指數(shù)（12.50）顯著低于Foc4接種的平均病情指數(shù)（52.92）（圖9-B）。這表明β1-tub基因在Foc4的致病性方面起著重要作用。

3 討論

在真核生物中，微管由微管蛋白（tubulin）和微觀輔助蛋白（MAPs）兩大類蛋白組成，作為細胞骨架的重要組分而普遍存在。微管是由α和β-微管蛋白以異二聚體形式組裝而成，α-微管蛋白和β-微管蛋白在真核蛋白中具有高度保守性，參與細胞形態(tài)、維持有絲分裂和其它各種形態(tài)事件的發(fā)生[18]。而β-微管蛋白是微管結(jié)構(gòu)最主要的成分之一，同時也是多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的作用靶標[19]。

真菌基因組僅有一個或2個β-微管蛋白基

因[20]。在禾谷鐮刀菌中，2個β-微管蛋白基因得到鑒定[21]。β-微管蛋白作為多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的作用靶標，大多數(shù)病原真菌對苯并咪唑類藥劑的抗性與β-微管蛋白的變化有關。其中，灰葡萄孢菌對苯并咪唑類藥劑的抗性是由于β1-微管蛋白的變化引起，而禾谷鐮刀菌不是由于β1-微管蛋白的變化引起抗藥性[22]。在香蕉枯萎病菌中，本研究克隆并鑒定了其β1-微管蛋白基因，其氨基酸序列高度保守，并與其它常見植物病原真菌的β1-微管蛋白基因的氨基酸高度同源。本研究利用同源重組原理獲得了β1-微管蛋白基因的敲除突變體，與野生菌株相比，敲除突變體對多菌靈敏感性稍有下降，其EC50值與野生型菌株無顯著差異，說明β1-微管蛋白基因敲除突變體不具有對多菌靈的抗性，這與于俊杰[23]研究小麥赤霉病中β1-微管蛋白基因敲除突變體對多菌靈的敏感性結(jié)果一致，推測在香蕉枯萎病菌中還可能存在其它微管蛋白的作用，并不是由于β1-微管蛋白的變化而引起的抗藥性。

本研究中，β1-微管蛋白基因缺失突變體的生物學表型與野生菌差別顯著，突變體表現(xiàn)為生長緩慢、菌絲畸形及產(chǎn)孢量增加，這與畢朝位[24]在研究禾谷鐮刀菌β1-微管蛋白基因敲除突變體的生物學表型與野生菌差異不顯著的研究結(jié)果存在差異。同時，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)β1-微管蛋白基因的缺失造成香蕉枯萎病菌的致病力減弱，與仇劍波[25]研究禾谷鐮刀菌β1-微管蛋白基因敲除突變體在花期小麥穗子上的致病力降低是一致的。綜上所述，雖然β1-微管蛋白基因在進化過程中存在高度保守性，但不同植物病原菌的β1-微管蛋白具有不同的功能。β1-微管蛋白基因的敲除導致香蕉枯萎病菌生長緩慢，產(chǎn)孢增加，不能正常侵染寄主，推測β1-微管蛋白基因在香蕉枯萎病菌的生長發(fā)育及致病力等方面發(fā)揮著重要功能，但對香蕉枯萎病菌致病性的具體調(diào)控機制還需進一步研究。

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