黃春瓊 劉國道 白昌軍 唐軍 王文強 丁西朋 劉一明

摘 要 利用SRAP標記技術研究45份結(jié)縷草屬植物的遺傳變異情況。從100對引物中篩選出13對擴增帶型清晰、多態(tài)性較好的引物對其進行擴增，共擴增出113條條帶，平均每對引物擴增出8.69條條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為96條，多態(tài)性條帶所占比例為84.16%，遺傳相似性范圍為0.54～0.96，平均為0.75。基于UPMAG（unweighted pair-group method with arithmetic means）法，在遺傳相似性系數(shù)為0.74時，可將45份結(jié)縷草屬種質(zhì)分為4個類群，生態(tài)地理條件相似的種質(zhì)優(yōu)先聚在一起。本研究結(jié)果說明結(jié)縷草屬植物種質(zhì)間遺傳變異比較廣泛，為結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源的開發(fā)利用及新品種選育奠定了良好基礎。

關鍵詞 結(jié)縷草；遺傳變異；SRAP

中圖分類號 S544+.2 文獻標識碼 A

Abstract Sequence-related amplifed polymorphism （SRAP） was used to detect the genetic variation and genetic ralationship among 45 Zoysia willd. accessions. A total of 13 primer pairs from the original 100 primer pairs were selected based on the polymorphic， clear and reproducible bands produced by them among 3 Zoysia accessions. A total of 113 bands were amplified by 13 SRAP primer pairs from 45 Zoysia accessions， and 96 （84.16%） out of them were polymorphic. The genetic similarity coeffcients （GSC） among the 45 accessions ranged from 0.54 to 0.96 with an average of 0.75. Cluster analysis conducted by the unweighted pair-group method with arithmetic averages （UPGMA） separated the 45 Zoysia accessions into 4 distinct groups when the genetics similarity coefficient was 0.74. Results obtained clearly indicated significant variation existed in the wild Zoysia genotypes， which would provide a theoretical foundation for development and utilization of Zoysia germplasm resources and new variety breeding.

Keywords Zoysia； genetic varation； SRAP

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.001

結(jié)縷草屬（Zoysia willd.）隸屬于禾本科（Gramineae）、畫眉草亞科（Chloridoideae）多年生低矮草本植物，主要分布在東亞、東南亞以及澳大利亞等。結(jié)縷草屬一般分為11個種、多個變種以及變型[1-4]，其中大多數(shù)結(jié)縷草可用于運動場草坪、休憩草坪及保土草坪等的建植。結(jié)縷草屬植物在我國分布有5個種、2個變種和1個變型，是該屬中目前作為草坪種質(zhì)資源研究和開發(fā)利用的主要種。5個種分別是結(jié)縷草（Z. japonica Steud.）、細葉結(jié)縷草（Z. tenuiflia willd.ex Trin.）、溝葉結(jié)縷草（Z. matrella （L.） Merr.）、大穗結(jié)縷草（Z. macorostachya Franch.et Sva.）以及中華結(jié)縷草（Z. sinica Hance）；2個變種分別是青結(jié)縷草（Z. japonica var. pollida Nakai et Honda）和長花結(jié)縷草（Z. sinica var. nipponica Ohwi.）；1個變型是大穗日本結(jié)縷草（Z. japonica f. macrostachya H. D. Dung et L. J. Gong）[5]。其中結(jié)縷草是該屬中分布范圍最廣、應用面積最大的一個種，也是中國結(jié)縷草屬的代表種[6]。中國的野生結(jié)縷草屬種質(zhì)資源豐富，分布地域廣泛，北起遼寧東部，南至福建南部，東起吉林省鴨綠江中上游，西到陜西東南部，包括我國東南部遼寧、山東、河北、河南、陜西、湖北、江西、安徽、江蘇、浙江及福建共11個省[7]。

近年來，分子標記技術在草坪草種質(zhì)資源的研究中的應用越來越廣泛。在結(jié)縷草屬植物的研究中也有廣泛的應用。如限制片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[8]、隨機擴增多態(tài)性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）[9-11]、擴增片段長度多態(tài)性（amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）[12-13]、DNA簡單序列重復（simple sequence repeats，SSR） [14-17]、表達序列標簽（expressed sequence tags，EST-SSR）[18]、簡單序列重復區(qū)間擴增（inter-simple sequence

repeat，ISSR）[19]標記已應用在親緣關系的鑒定、遺傳多樣性分析、指紋圖譜及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等。這些標記各有優(yōu)缺點，相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）[20]的出現(xiàn)彌補了以上分子標記的不足并且呈現(xiàn)出許多優(yōu)越性，該標記具有擴增簡便穩(wěn)定、重復性好、多態(tài)性高并且不依賴于基因組序列等優(yōu)點。目前已應用于植物的遺傳多樣性、遺傳圖譜的構(gòu)建等研究中[21-23]。在結(jié)縷草種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究中，郭海林等[24]的研究表明了SRAP應用在結(jié)縷草屬種質(zhì)資源遺傳多樣性研究上的優(yōu)越性和有效性?；赟RAP分子標記的諸多優(yōu)越性，本研究采用SRAP分子標記的方法對不同地理來源的結(jié)縷草屬種質(zhì)進行遺傳變異研究，從分子水平上探討了結(jié)縷草種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為結(jié)縷草屬種質(zhì)資源的研究奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料選取2004—2008年從山東、江蘇、浙江、安徽、上海以及福建等地采集的45份結(jié)縷草屬野生種質(zhì)資源，材料來源詳見表1。其中，

包括中華結(jié)縷草1份（江蘇）、溝葉結(jié)縷草2份（福建）、結(jié)縷草42份（江蘇12份，山東19份，浙江6份，安徽4份，上海1份），這些材料均保存于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究室試驗基地。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 參考黃春瓊等[25]利用改良CTAB法提取3種暖季型草坪草基因組DNA的方法提取基因組DNA。提取產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以及核酸蛋白含量儀測定后，篩選出符合實驗要求的樣品保存于–20℃冰箱。

1.2.2 SRAP-PCR分析 本研究所使用引物序列與Huang等[26]所用的序列一致，以3份結(jié)縷草（Z14、Z35和Z41）的DNA作為模板進行引物篩選，篩選在3份材料間有多態(tài)性條帶、擴增穩(wěn)定且?guī)颓逦囊铮缓罄煤Y選出的引物對45份結(jié)縷草屬種質(zhì)進行SRAP-PCR擴增分析。本研究所使用的反應體系、擴增程序及擴增產(chǎn)物的檢測與Huang等[27]的一致。

1.3 數(shù)據(jù)處理

SRAP-PCR擴增條帶以0，1建立數(shù)據(jù)庫。同一對引物，同一個位點上能擴增出條帶的記為1，

沒有該條帶的記為0，形成0，1矩陣數(shù)據(jù)庫，利用NTSYS2.10e軟件計算種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)。同時利用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA）對種質(zhì)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA質(zhì)量的檢測

結(jié)縷草屬種質(zhì)基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，擴增條帶清晰明亮、帶型整齊干凈，無其他雜帶，無拖尾現(xiàn)象，說明所提取的DNA質(zhì)量較好，DNA完整無降解。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，A260/A280在1.8～2.0，表明酚類、多糖等雜質(zhì)去除較好，符合實驗要求。

2.2 引物的篩選

從100對SRAP引物中共篩選出了13對多態(tài)性和穩(wěn)定性良好的引物（表2）。部分引物篩選情況如圖2所示，圖2中所用的引物依次是M6E2、M5E2、M4E2、M3E2、M2E2、M1E2和M10E2。從圖2中可以看出，引物M5E2和M3E2分別在600、450 bp處在3份結(jié)縷草種質(zhì)中擴增出多態(tài)性條帶（箭頭所示）。

2.3 SRAP-PCR擴增多態(tài)性分析

利用上述篩選出的13對SRAP引物對45份結(jié)縷草屬種質(zhì)進行擴增，擴增結(jié)果如表3所示。從表3中可以看出，共擴增出113條條帶，平均每對引物擴增獲得8.69條帶，其中多態(tài)性條帶為96條，多態(tài)性比例為84.16 %，由此可以看出，SRAP標記揭示結(jié)縷草屬植物的多樣性效率是比較高的。擴增條帶數(shù)最多的引物為M9E5，擴增條帶數(shù)為12條，擴增條帶數(shù)最少的引物是M1E2，擴增條帶數(shù)為6條。圖3為引物M2E10對45份結(jié)縷草種質(zhì)擴增的電泳圖，從圖中可以看出，擴增帶型比較清晰，多態(tài)性豐富。

2.4 遺傳相似性分析

經(jīng)NTSYS軟件計算得出45份結(jié)縷草屬種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)范圍為0.54～0.96，平均值為0.75。從遺傳相似系數(shù)矩陣（略）可以得知，在45份結(jié)縷草屬種質(zhì)中，來自山東東營的Z13和山東泰安的Z14號的遺傳相似系數(shù)最大，為0.96，表明這2個種質(zhì)間的親緣關系較近，遺傳變異最?。粊碜哉憬笊降腪21和安徽肥東的Z37的遺傳相似系數(shù)最小，為0.54，表明它們之間的親緣關系較遠，遺傳變異最大。

2.5 聚類分析

基于各種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)，利用UPGMA法對45份結(jié)縷草屬種質(zhì)進行聚類分析，聚類分析結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，在遺傳相似性系數(shù)為0.74時，可將45份結(jié)縷草屬種質(zhì)明顯分為4個類群。第1類群包括8份種質(zhì)，其中結(jié)縷草6份、溝葉結(jié)縷草2份（來自福

建的Z35和Z36），來自江蘇鹽城的Z21與其他7個種質(zhì)的親緣關系較遠，而來自江蘇鹽城河邊的Z11與江蘇東臺海邊的Z12親緣關系較近。第2類群僅包括1份浙江衢州田邊采集的結(jié)縷草Z18。第3類群包括24份種質(zhì)，其中中華結(jié)縷草（Z02）1份、結(jié)縷草23份，來自山東東營路邊的Z13和山東泰安山坡的Z14的親緣關系最近，引物組合M9E5可將其區(qū)分開，而來自山東臨沂路邊的Z19與安徽蚌埠淮河邊的Z16親緣關系較遠。第4類群包括12份結(jié)縷草種質(zhì)，其中來自山東煙臺水邊的Z24與江蘇南通水邊的Z39的親緣關系較遠，而來自浙江仙居谷地的Z06與浙江龍游田邊的Z09的親緣關系較近。

3 討論

關于結(jié)縷草種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究，前人在形態(tài)學方面的研究結(jié)果表明中國結(jié)縷草屬植物在形態(tài)上存在著豐富的遺傳變異[28-30]。在分子方面也有相關報道，金洪[5]利用AFLP標記對中國結(jié)縷草種質(zhì)資源自然分布區(qū)的19個野生居群和1個栽培居群進行了生態(tài)學特性和居群變異研究，10對AFLP引物共擴增出524條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶為385條，多態(tài)性比例為73.50%，從DNA水平上顯示出結(jié)縷草具有豐富的遺傳多樣性。趙巖等[18]利用EST-SSR驗證其在結(jié)縷草中的通用性，結(jié)果顯示9份參試材料擴增出豐富的多態(tài)性，多態(tài)性比例為91.38%。以上這些研究僅針對結(jié)縷草屬的1個種進行遺傳變異研究。本研究通過SRAP分子標記技術對涵蓋了我國主要分布和應用區(qū)域的結(jié)縷草屬植物的3個種（結(jié)縷草、溝葉結(jié)縷草和中華結(jié)縷草）的遺傳多樣性進行研究，結(jié)果顯示13對引物能擴增出113條條帶，其中多態(tài)性條帶為96條，多態(tài)性比例為84.16%，種質(zhì)間的遺傳相似性變異范圍較大，為0.54～ 0.96，在分子水平上說明了我國結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源間存在豐富的遺傳變異，同時也證實了利用SRAP標記技術對結(jié)縷草屬植物的多樣性及種內(nèi)關系進行研究是有效的。

本研究在對結(jié)縷草屬植物進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，生態(tài)地理條件來源相似的種質(zhì)優(yōu)先聚在一起，如Z13（山東東營路邊）和Z14（山東泰安山坡）的親緣關系最近，因為都在山東省內(nèi)的草地采集，種群數(shù)量較多，發(fā)生遺傳變異的概率較小。這一研究結(jié)果與宣繼萍等[31]利用SSR標記研究結(jié)縷草屬的9種1變種共58份材料的研究結(jié)果一致，聚類分析結(jié)果同樣表明生態(tài)地理條件相似的種優(yōu)先聚在一起。另外，來自浙江衢州的Z18單獨聚為1類，與其他結(jié)縷草的遺傳基礎差異較大，親緣關系較遠，這份材料的形態(tài)特征與其他結(jié)縷草相比并沒有特別的區(qū)別特征，但可能在遺傳物質(zhì)上確實存在一些特異的基因。這一現(xiàn)象與郭海林等[24]的研究結(jié)果一致。此外，本研究通過SRAP分子標記技術對結(jié)縷草屬植物的3個種的遺傳變異進行研究，未能將溝葉結(jié)縷草（Z35和Z36）、中華結(jié)縷草（Z02）和結(jié)縷草（42份）從種間明顯區(qū)分開。這一現(xiàn)象前人也有相關報道。郭海林等[24， 32]分別利用SRAP和SSR標記對結(jié)縷草屬植物5種1變種共96份種質(zhì)進行遺傳多樣性分析時也發(fā)現(xiàn)結(jié)縷草、中華結(jié)縷草和溝葉結(jié)縷草存在交叉聚類現(xiàn)象，同一個種并非完全聚在一類。這可能和收集的種質(zhì)數(shù)量及所用引物有關，本研究使用的是溝葉結(jié)縷草2份、中華結(jié)縷草1份、結(jié)縷草43份。后期研究可以繼續(xù)多篩選一些引物或者結(jié)合其他分子標記進行分析，看能否將這幾個種明顯區(qū)分開。本研究結(jié)果顯示結(jié)縷草屬種質(zhì)間具有豐富的遺傳多樣性，為狗牙根種質(zhì)資源后續(xù)研究奠定了良好的基礎。

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