李楊

摘要 [目的]篩選出適合于cDNA文庫(kù)構(gòu)建的豬苓菌核及菌絲體總RNA的提取方法。[方法]采用Trizol改良法和EASY Spin植物快速提取試劑盒法（簡(jiǎn)稱(chēng)試劑盒法）對(duì)豬苓菌絲及菌核的總RNA進(jìn)行提取。[結(jié)果]經(jīng)紫外分光光度計(jì)對(duì)所得總RNA的均一性及1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所得總RNA的完整性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，2種方法均可提出完整的總RNA，試劑盒法相較于Trizol改良法其所提取的總RNA質(zhì)量和純度都較好，但Trizol改良法所提取的總RNA產(chǎn)率比較高。[結(jié)論]LD-PCR成功合成了豬苓菌核和菌絲體的cDNA產(chǎn)物，呈彌散狀分布在1 000～5 000 bp和750～2 500 bp，滿(mǎn)足cDNA建庫(kù)的要求。

關(guān)鍵詞 豬苓；菌絲；菌核；總RNA提取方法

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）02-0063-03

Abstract [Objective]To screen out the method for extracting total RNA from Polyporus umbellatus mycelium and sclerotium suitable for cDNA library construction. [Method]The total RNA of mycelium and sclerotium of P. umbellatus was extracted by improved Trizol method and EASY Spin plant RNA kit method（kit method for short）. [Result]The total RNA was homogenized by UV spectrophotometer and the integrity of the obtained total RNA was detected by 1% agarose gel electrophoresis. It was found that both methods could provide the complete total RNA. Compared with the kit method， the total RNA extracted by the improved Trizol method was better in quality and purity， but the total RNA extracted by improved Trizol method had higher yield. The cDNA of mycelium and sclerotium of P. umbellatus was successfully synthesized by LDPCR and distributed in the range of 1 000-5 000 bp and 750-2 500 bp， which satisfied the requirement of cDNA library construction.

Key words Polyporus umbellatus；Mycelium；Sclerotium；Total RNA extraction method

cDNA文庫(kù)構(gòu)建是現(xiàn)代生物技術(shù)研究中一項(xiàng)很重要的技術(shù)，是大規(guī)模與高效率獲得基因序列的有效途徑，特別是對(duì)基因組龐大且短期內(nèi)不能進(jìn)行全基因組測(cè)序的某些物種來(lái)說(shuō)，其是有效開(kāi)展功能基因組研究的一條重要途徑[1]。通過(guò)構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)能夠直接發(fā)現(xiàn)并克隆與生命活動(dòng)有關(guān)的調(diào)控基因，進(jìn)而闡述其基因所編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)及其相互作用的關(guān)系。然而，構(gòu)建高質(zhì)量的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)并不容易，要獲得完整的mRNA就是一個(gè)棘手問(wèn)題。目前從細(xì)胞中提取總RNA的方法很多，通常采用的方法有Trizol法、改良CTAB 法、SDS酸酚法、異硫氰酸胍-CTAB法、異硫氰酸胍-SDS法等，提取純度高、完整性好的mRNA是順利構(gòu)建cDNA文庫(kù)、RT-PCR以及EST序列分析等分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵[2-4]。為此，許多公司制定和生產(chǎn)了用于提取不同物種總RNA的方法和試劑盒，但不同物種細(xì)胞組織中所含的成分（多糖、多酚等）有很大差異，因此，不同方法和不同廠(chǎng)家的試劑盒間也各有優(yōu)缺點(diǎn)。

豬苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fr.] 是一種藥用大型真菌，在分類(lèi)學(xué)上屬于無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱（Holobasidiomycetidae）、 無(wú)褶菌目（Aphyllophorales）、 多孔菌科（Polyporaceae）、 多孔菌屬（Polyporus）。豬苓主要分布于我國(guó)陜西等西南省區(qū)和東北長(zhǎng)白山區(qū)[5]。Xing等[6]通過(guò)分析比對(duì)nr DNA ITS和28s rRNA（LSU）序列認(rèn)為豬苓的種群發(fā)源地應(yīng)是陜西省和甘肅省。豬苓的生長(zhǎng)過(guò)程可分為菌絲體萌發(fā)、菌核生長(zhǎng)和子實(shí)體形成三個(gè)階段。生長(zhǎng)3年的菌核（黑苓）才可作為藥材，一般認(rèn)為，豬苓菌核生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，細(xì)胞趨于木質(zhì)化[7]，在菌核中會(huì)大量富集多糖、酚類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物。尤其是酚類(lèi)物質(zhì)易被氧化成醌，與RNA不可逆地結(jié)合，增加了提取足夠質(zhì)量與純度的總RNA的難度。目前還少有關(guān)于從豬苓菌核中提取總RNA方法的文獻(xiàn)報(bào)道。筆者以產(chǎn)于陜西的豬苓菌核及菌絲體為試材，通過(guò)Trizol改良法和EASY Spin植物快速提取試劑盒法（簡(jiǎn)稱(chēng)試劑盒法）提取總RNA，探索提取豬苓菌核及菌絲體總RNA的最適方法，為后續(xù)構(gòu)建陜西豬苓菌核及菌絲體的cDNA文庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料。

豬苓菌核為采自于陜西省佛坪縣的3年生黑苓，菌絲體采用組織分離法從豬苓菌核中分離獲得，再經(jīng)轉(zhuǎn)管活化和擴(kuò)繁后保存于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試試劑。

1.1.2.1 RNA提取試劑。

TrizolReagent 購(gòu)于Invitrogen公司；EASY Spin植物快速提取試劑盒購(gòu)于北京艾德萊生物科技有限公司。

1.1.2.2 其他試劑。

DEPC 購(gòu)于Solarbio 公司；Advantage 2 PCR kit 購(gòu)于Clontech 公司；其他常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 供試引物。

SMART ⅣTM Oligonucleotide（12 μmol/L）5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCG GG-3；CDS Ⅲ/3 PCR Primer（12 μmol/L）5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d（T）30N-1N-3。

1.2 方法

1.2.1 豬苓菌核及菌絲體中總RNA提取。

1.2.1.1 Trizol改良法[8]。

取1.5 mL預(yù)冷后EP管，分別加入80 mg 經(jīng)液氮研磨后的豬苓菌核及菌絲體粉末，經(jīng)1 mL Trizol試劑的裂解后，加入氯仿產(chǎn)生有機(jī)相，離心取上清后加入等體積的水飽和酚、三氯甲烷和異戊醇去除蛋白質(zhì)[9]，離心取上清后用異丙醇沉淀RNA[10]，離心去上清后由75% 乙醇清洗沉淀2～3 次，最后用DEPC水溶解沉淀。

1.2.1.2 試劑盒法。

參照EASY Spin 植物RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行操作。

1.2.2 總RNA檢測(cè)。

用紫外分光光度法檢測(cè)提取總RNA的均一性；用1%瓊脂糖凝膠、TAE緩沖液電泳檢測(cè)所得總RNA的完整性。

1.2.3 豬苓菌核及菌絲體cDNA的合成。

1.2.3.1 cDNA第一鏈的合成。

向0.5 mL EP管中加入3 μL 總RNA、1 μL SMART ⅣTM Oligonucleotide、1 μL CDS Ⅲ/3 PCR Primer，瞬時(shí)離心。72 ℃孵育2 min，冰上冷卻2 min，瞬時(shí)離心。再按順序加入2 μL 5×FirstStrand Buffer、1 μL DTT（20 mmol/L）、1 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1 μL SMARTScribeTM MMLV Reverse Transcriptase，反應(yīng)體系為10 μL，輕輕混合。42 ℃水浴1 h，將管置于冰上終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA完整性檢測(cè)

采用2種提取方法都可以從豬苓菌核和菌絲體中提取出總RNA，由圖1和圖2的電泳結(jié)果可見(jiàn)，都出現(xiàn)了總RNA的28S、18S、5S這3條條帶。但是Trizol改良法的5S條帶拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán)重，說(shuō)明Trizol改良法提取的總RNA存在著降解問(wèn)題，可能是RNase酶未去除干凈或溫度過(guò)高導(dǎo)致RNA單鏈斷裂，致使RNA降解；而試劑盒法提取出的RNA，3條帶比較清晰，意味著RNA沒(méi)有出現(xiàn)蛋白質(zhì)殘留或DNA污染等現(xiàn)象，而且28S的亮度約為18S的2倍，表明提取的總RNA完整性很高，沒(méi)有發(fā)生降解。

2.2 RNA均一性檢測(cè)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/280來(lái)檢驗(yàn)所提取總RNA的均一性，當(dāng)OD260/280值過(guò)小時(shí)，表明有蛋白質(zhì)或酚污染；當(dāng)OD260/280值大于2.2時(shí)，意味著RNA已經(jīng)降解成單核酸了[10-11]。由表1可知，采用試劑盒法提取總RNA的OD260/280比值均為1.7～2.1，表明總RNA純度很高；而采用Trizol改良法提取總RNA的OD260/280比值大于22，表明總RNA已經(jīng)降解。但是，相比Trizol改良法，試劑盒法提取的總RNA產(chǎn)量偏低，推測(cè)是樣品在用基因組DNA清除柱清除殘留DNA時(shí)RNA的產(chǎn)量也嚴(yán)重降低。豬苓菌核中的總RNA產(chǎn)量明顯低于菌絲體中的總RNA產(chǎn)量，其原因可能是因?yàn)榫颂幱谛菝郀顟B(tài)，活性較弱，且菌核細(xì)胞趨于木質(zhì)化，裂解難度增大，導(dǎo)致總RNA產(chǎn)量比較低。

2.3 LD-PCR擴(kuò)增cDNA

通過(guò)對(duì)豬苓菌核及菌絲體的cDNA合成和LD-PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，其結(jié)果見(jiàn)圖3、4。豬苓菌核和菌絲體的引物擴(kuò)增條帶彌散分別分布在1 000～5 000 bp和750～2 500 bp，說(shuō)明它們的cDNA擴(kuò)增帶的豐度和長(zhǎng)度均符合cDNA文庫(kù)構(gòu)建條件。

3 討論與結(jié)論

豬苓菌核細(xì)胞內(nèi)含有較多的多糖和麥角甾醇，而且其含量隨年份增加亦明顯升高，而用液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體多糖和麥角甾醇含量更是高于菌核[12]。豬苓菌核是由擬薄壁組織和疏絲組織形成的一種休眠體，是菌核貯藏養(yǎng)分的器官[13]，這些因素都明顯增加了豬苓菌核及菌絲體總RNA的提取難度。欒換東等[14]采用Trizol法、Trizol改良1法、Trizol改良2法及CTAB改良法對(duì)長(zhǎng)白山豬苓菌絲體總RNA的提取結(jié)果表明，Trizol法存在多糖多酚污染，影響了RNA的完整性，CTAB改良法耗時(shí)較長(zhǎng)，產(chǎn)率比較低，Trizol改良1法、Trizol改良2法提取的總RNA無(wú)論是完整性還是純度均較Trizol法與CTAB改良法好。秦亞麗[15]分別采用Trizol試劑法、RNAiso plus法、RNAiso plus搭配RNAisomate for Plant Tissue法、CTABLiCl法及Trizol Reagent法共5種方法對(duì)陜西豬苓菌絲體總RNA進(jìn)行提取，結(jié)果表明CTAB法與Trizol Reagent法所提出的RNA產(chǎn)率低，且OD260/280也達(dá)不到要求；Trizol法與RNAiso plus法雖得出了明顯的條帶，但存在蛋白質(zhì)或多糖污染，而RNAiso plus搭配RNAisomate for Plant Tissue法經(jīng)改良后得到的RNA質(zhì)量和產(chǎn)量都很好。

鑒于豬苓菌核特殊的結(jié)構(gòu)和在提取總RNA時(shí)出現(xiàn)的困難，筆者認(rèn)為需要注意以下幾點(diǎn)：①加入裂解液前要保證豬苓樣品一直處于冷凍的狀態(tài)；②針對(duì)豬苓菌核難提取易降解的情況，可適當(dāng)增加裂解液的量并延長(zhǎng)裂解液與豬苓樣品接觸的時(shí)間；③用提前預(yù)熱到75～85 ℃的RNasefree H2O溶解RNA，這些可以在一定程度上提高總RNA產(chǎn)量。

該研究采用了Trizol改良法和試劑盒法2種不同的方法提取豬苓菌核和菌絲體的總RNA。Trizol試劑作為普遍的RNA提取試劑，雖然成功率高，但所得總RNA純度較低，完整性較差，易降解；而試劑盒法比較簡(jiǎn)便，且提取時(shí)間短，通常30 min就可以完成，所得RNA純度比較高，完整性也較好。

參考文獻(xiàn)

[1] 姜靜.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，2003.

[2] 薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（上冊(cè)）[M].北京：科學(xué)出版社，2005.

[3] BUTT R H，PFEIFER T A，DELANEY A，et al.Enabling coupled quantitative genomics and proteomics analyses from rat spinal cord samples[J].Mol Cell Proteomics，2007，6（9）：1574-1588.

[4] 周玉婷，王鈺.蘋(píng)果RNA提取方法的探索[J].運(yùn)城學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，28（5）：43-44.

[5] 許廣波，傅偉杰，趙旭奎.我國(guó)豬苓研究的進(jìn)展[J].菌物研究，2003，1 （1）：58-61.

[6] XING X K，MA X T，HART M M，et al.Genetic diversity and evolution of Chinese traditional medicinal fungus Polyporus umbellatus（Polyporales，Basidiomycota）[J].Plos one，2013，8（3）：1-10.

[7] 郭順星，徐錦堂.豬苓菌核結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究[J].菌物學(xué)報(bào)，1991，10（4）：312-317.

[8] 楊楠，徐正進(jìn)，周永力.改良TRIZOL法提取高質(zhì)量稻曲病菌總RNA的方法[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（11）：145-149.

[9] 王阿娜，裴瑾，劉薇，等.桑葉片總RNA提取方法的比較研究[J].中成藥，2012，34（7）：1377-1380.

[10] 張曉麗，代紅軍.植物RNA提取方法的研究進(jìn)展[J].北方園藝，2014（8）：175-178.

[11]汪天虹.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：北京大學(xué)出版社，2008：36.

[12] 李雯瑞，梁宗鎖，陳德育，等.不同發(fā)育階段豬苓菌核顯微結(jié)構(gòu)和成分含量的比較[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（4）：116-121.

[13] 周微微.豬苓菌核及發(fā)酵菌絲體化學(xué)成分研究及質(zhì)量分析[D].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2008.

[14] 欒換東，戰(zhàn)瑩瑩，姜穎越，等.長(zhǎng)白山藥用真菌雞爪苓菌絲體總RNA提取方法的比較[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（4）：297-301.

[15] 秦亞麗.豬苓遺傳多樣性及多糖合成酶-UGPase基因的克隆[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.