陳亮 陳明霞 李和陽(yáng)

摘要[目的]對(duì)分離自市售高溫滅菌牛奶的產(chǎn)脂肪酶菌株SJXYZ進(jìn)行鑒定。[方法]通過(guò)16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析、形態(tài)觀察和生理生化特性分析，對(duì)菌株SJXYZ生物學(xué)特性進(jìn)行初步鑒定。[結(jié)果]16S rRNA基因序列分析顯示該菌株屬于芽胞桿菌屬（Bacillus），與B.altitudinis 41KF2bT（高地芽胞桿菌）、B.xiamenensis HYC-10T（廈門(mén)芽胞桿菌）、B.safensis FO-36bT（沙福芽胞桿菌）、B.zhangzhouensis DW5-4T（漳州芽胞桿菌）、B.australimaris NH7I_1T（南海芽胞桿菌）和B.pumilus ATCC 7061T（短小芽胞桿菌）相似度皆為97%以上。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，該菌株與B.altitudinis 41KF2bT親緣關(guān)系最近，但形成獨(dú)立的進(jìn)化分支，無(wú)法歸入已知物種。菌株SJXYZ為革蘭氏陽(yáng)性，直桿狀，運(yùn)動(dòng)性，最適溫度為30～35 ℃，適宜pH為5～9，適宜鹽度（NaCl）為0%～5%;產(chǎn)脂肪酶，不產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶;對(duì)氨芐西林（10 μg）、慶大霉素（10 μg）、氟哌酸（10 μg）、頭孢唑啉（30 μg）、四環(huán)素（30 μg）、頭孢噻吩（30 μg）、鏈霉素（10 μg）敏感。所測(cè)特性與B.altitudinis 41KF2bT有較大的差異。[結(jié)論]菌株SJXYZ可能為新的物種，暫命名為Bacillus sp.SJXYZ。

關(guān)鍵詞芽胞桿菌;菌種鑒定;脂肪酶

中圖分類(lèi)號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0108-02

Identification of a Lipaseproducing Bacillus sp. SJXYZ

CHEN Liang1， CHEN Mingxia1， LI Heyang2

（1.College of Chemical Engineering， Huaqiao University， Xiamen，F(xiàn)ujian 361021;2.Third Institute of Oceanography， State Oceanic Administration， Xiamen， Fujian 361005）

Abstract[Objective] To identify strain SJXYZ， which was isolated from commercial sterilized milk. [Method] Strain SJXYZ was characterized by morphological， biochemical and physiological tests， 16S rRNA gene sequence determination and phylogenetic analyses. [Result]16S rRNA gene analysis indicated that strain SJXYZ belonged to the genus Bacillus and had small higher than 97% similarity to B.altitudinis 41KF2bT， B. xiamenensis HYC10T， B. safensis FO36bT， B. zhangzhouensis DW54T， B. australimaris NH7I_1T and B. pumilus ATCC 7061T. The phylogenetic analysis showed that strain SJXYZ was closest to B. altitudinis 41KF2bT， but formed an independent branch separated from all the reference strains. Cells were gramstainpositive， straight rod， motile. Growth occurred at pH 5-9， at 0%-5% NaCl， and with optimum temperature at 30-35 ℃. Lipase was passive. Proteinase， cellulase and amylase were negative. Sensitive to ampicillin （10 μg）， gentamycin（10 μg）， norxacin （10 μg）， cefazolin （30 μg）， tetracycline （30 μg）， cephalothin （30 μg） and streptomycin （10 μg）. Genomic and phenotypic data of strain SJXYZ shew a big difference from B. altitudinis 41KF2bT. [Conclusion] On the basis of these findings， we propose that strain SJXYZ represents a new species of Bacillus for which we propose the name Bacillus sp. SJXYZ.

Key wordsBacillus;Identification;Lipase

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41506179）;福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01613）;“全球變化與海氣相互作用”專(zhuān)項(xiàng)（GASI-03-01-03-01，GASI-03-01-03-02）;華僑大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（12BS206）。

作者簡(jiǎn)介陳亮（1987—），男，湖北漢川人，從事微生物鑒定研究。 *通訊作者，講師，博士，從事海洋微生物資源研究。

收稿日期2018-01-10

芽胞桿菌（Bacillus）是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽胞，需氧或兼性厭氧，大多數(shù)有動(dòng)力，無(wú)莢膜，廣泛存在于土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道等各類(lèi)生境中[1-5]，在生產(chǎn)、生活及環(huán)境生態(tài)中扮演著重要角色。該屬種類(lèi)繁多，目前有效命名的種類(lèi)有357種（https：//www.dsmz.de/bacterialdiversity/prokaryoticnomenclatureuptodate/prokaryoticnomenclatureuptodate.html），有的具有致病性，比如可引起人及動(dòng)物致病的B.anthraci（炭疽芽胞桿菌）和引起食物中毒的B.cereus（蠟狀芽胞桿菌）;有的可作為益生菌，比如B.coagulans（凝結(jié)芽胞桿菌）、B.lentus（緩慢芽胞桿菌）、B.subtilis（枯草芽胞桿菌）、B.pumilus（短小芽胞桿菌）和B.licheniformis（地衣芽胞桿菌），這些益生菌在動(dòng)物腸道中生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些活性物質(zhì)（如枯草菌素、有機(jī)酸等），能抑制和殺死腸道病原菌，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，抑制腸源性毒素的產(chǎn)生和吸收，從而調(diào)節(jié)和維持動(dòng)物消化道微生物區(qū)系的平衡;有的可作為微生物農(nóng)藥，比如B.thuringiensis（蘇云金芽胞桿菌）可用于防治直翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目的多種害蟲(chóng)[6];多數(shù)芽胞桿菌屬細(xì)菌可以產(chǎn)生種類(lèi)繁多的工業(yè)用酶，比如工業(yè)用的高溫淀粉酶主要是由B.licheniformis生產(chǎn)的、B.alkalophilic（嗜堿芽胞桿菌）是堿性纖維素酶的主要生產(chǎn)菌株、B.subtilis（枯草芽胞桿菌）是蛋白酶的主要生產(chǎn)菌株[7]。筆者從市售高壓滅菌的純牛奶中分離一株未知菌株SJXYZ，其菌落呈樹(shù)枝狀且產(chǎn)生脂肪酶，該研究對(duì)此進(jìn)行初步鑒定。

1材料與方法

1.1菌株培養(yǎng)

菌株SJXYZ分離自市售高壓滅菌的純牛奶，其培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，25～30 ℃培養(yǎng)。

1.2菌株鑒定

1.2.1菌株16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

細(xì)菌總DNA采用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518225，上海生工）進(jìn)行提取，16S rRNA基因片段的擴(kuò)增方法參考文獻(xiàn)[8]。菌株16S rRNA基因序列由南京金斯特生物技術(shù)有限公司測(cè)定，所得序列校正后在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析并獲取相近菌種的16S rRNA基因序列。利用DNAman（version 5.1，Lynnon BioSoft）軟件進(jìn)行序列同源性分析及構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2形態(tài)及生理生化特性鑒定。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]的方法，進(jìn)行培養(yǎng)和部分生理生化特征的測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1菌株SJXYZ 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序得到16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 133 bp，已提交GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為HM371427。通過(guò)EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析表明：菌株SJXYZ與B.altitudinis 41KF2bT、B.xiamenensis HYC-10T、B.safensis FO-36bT、 B.zhangzhouensis DW5-4T、B.australimaris NH7I_1T和B.pumilus ATCC 7061T相似度皆為97%以上。在此基礎(chǔ)上，在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)尋找Bacillus屬的相關(guān)序列，并構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出菌株SJXYZ與B.altitudinis 41KF2bT的親緣關(guān)系最近，但處在一個(gè)完全獨(dú)立的進(jìn)化分支上。在該進(jìn)化樹(shù)上可以明顯發(fā)現(xiàn)菌株SJXYZ的近源種之間的進(jìn)化距離較小，菌株SJXYZ與所有近源種之間的距離大于種間距離，無(wú)法歸為任何一個(gè)已知物種。根據(jù)Drancourt 等[10-11]提出16S rRNA基因序列同源性鑒定規(guī)則，初步將菌株SJXYZ歸為Bacillus屬，命名為Bacillus sp.SJXYZ。

2.2菌株SJXYZ菌落及個(gè)體形態(tài)

菌株SJXYZ在LB平板上于30 ℃培養(yǎng)48 h后，菌落為白色，菌落呈擴(kuò)散性生長(zhǎng)，邊緣呈現(xiàn)樹(shù)枝狀或羽毛狀，菌落初始光滑、濕潤(rùn)，后期則干燥或形成皺褶，不透明，無(wú)金屬光澤，易挑取。

菌體為革蘭氏陽(yáng)性，產(chǎn)芽胞，無(wú)莢膜，具有運(yùn)動(dòng)性，直桿狀，大小約1.1 μm×4.2 μm。

2.3菌株SJXYZ生理生化特性

菌株SJXYZ適宜鹽度（NaCl）為0%～5%，在10%的NaCl下基本不生長(zhǎng);適宜pH為5～9，在pH 4和10下菌株基本不生長(zhǎng);最適溫度為30～35 ℃。氧化酶、過(guò)氧化氫酶及脂肪酶陽(yáng)性，淀粉酶、蛋白酶及纖維素酶陰性。對(duì)氨芐西林（10 μg）、慶大霉素（10 μg）、氟哌酸（10 μg）、頭孢唑啉（30 μg）、四環(huán)素（30 μg）、頭孢噻吩（30 μg）、鏈霉素（10 μg）敏感。

3討論

16S rRNA基因序列同源性分析在細(xì)菌的分類(lèi)鑒定中具有非常重要的作用，一般將同源性高于95%的細(xì)菌歸為同一個(gè)屬，同源性高于97%或98%的細(xì)菌歸為同一個(gè)種[10-11]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬細(xì)菌的16S rRNA基因序列同

源性普遍偏高，相近種之間很難通過(guò)16S rRNA基因序列的

同源性進(jìn)行區(qū)分[12-13]。Liu等[13]對(duì)1 007個(gè)芽胞桿菌屬菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行種間、種內(nèi)及菌株間3個(gè)水平統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)該屬細(xì)菌種內(nèi)及菌株內(nèi)的16S rRNA同源性為99.14%～100%，而種間同源性為97.34%～100%，相近種之間極其容易混淆。菌株SJXYZ與最近種B.altitudinis 41KF2bT的16S rRNA基因序列同源性為97.96%，兩者的生理生化特性也有較大差異：B.altitudinis 41KF2bT[2]蛋白酶、淀粉酶陽(yáng)性，脂肪酶陰性，在pH 5 條件下不生長(zhǎng)，對(duì)氨芐西林、氟哌酸、頭孢唑啉有抗性，而菌株SJXYZ剛好相反。綜上可見(jiàn)，菌株Bacillus sp.SJXYZ極有可能是芽胞桿菌屬內(nèi)的一個(gè)全新的物種，后續(xù)需要通過(guò)更加全面的系統(tǒng)鑒定以確定其分類(lèi)地位，包括DNA-DNA同源性、G+C含量（mol%）、ANI（平均核苷酸同源性）、脂肪酸組分分析和醌組分分析等一系

列生理生化及分子方面指標(biāo)的測(cè)定。此外，菌株SJXYZ分離

自高溫滅菌的市售牛奶，其存在可能與牛奶的保質(zhì)期直接相關(guān)，也警示著牛奶加工產(chǎn)業(yè)滅菌工藝有待完善。

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