文開新

許多既有應(yīng)用前景又令人興奮的技術(shù)正在不斷地被推出，它們能夠幫助人們應(yīng)對作物的霉菌毒素污染問題，其中一個突破就是宿主誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)。研究已證明了如何使用這項技術(shù)來減少收獲前玉米中的黃曲霉毒素。

中圖分類號：S852.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）05-0001-03

霉菌毒素是由各種真菌產(chǎn)生的有害于動物健康的化合物。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）估計，全球大約1/4的食物至少會被一種霉菌毒素污染。依據(jù)對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失和動物健康影響來說，問題最為嚴(yán)重的霉菌毒素是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素由多種曲霉菌（Aspergillus Fungus）產(chǎn)生。由于其會影響動物健康，許多國家在法律上對人的黃曲霉毒素的攝入量都進(jìn)行了規(guī)定，美國對食物中黃曲霉毒素含量的限定最為嚴(yán)格，要求不得超過20 μg/kg，而歐盟對嬰兒奶粉中黃曲霉毒素的含量要求不得高于0.025 μg/kg。

數(shù)十年來，對于如何降低食品/飼料中黃曲霉毒素含量的問題，商業(yè)界和學(xué)術(shù)界進(jìn)行了多方面的研究。這些研究包括用不產(chǎn)霉菌毒素的曲霉菌來競爭天然產(chǎn)毒的曲霉菌、在易感作物中培育抗真菌或抗霉菌毒素的品種、使用螯合劑結(jié)合霉菌毒素來使其失去生物學(xué)活性。盡管人們做了很多努力，但是，據(jù)估計每年各類作物因黃曲霉毒素含量超標(biāo)就要損失數(shù)百萬噸，這其中以玉米為主。

1 降低玉米中黃曲霉毒素的含量

玉米在全球范圍被大量用于食物/飼料，而且很容易被黃曲霉毒素污染。據(jù)估計全球每年約有50億人食用玉米，且主要集中在發(fā)展中國家，人們因食用受到霉菌毒素污染的玉米而導(dǎo)致霉菌毒素的長期攝入。然而，能夠降低生長期玉米籽粒中黃曲霉毒素水平的RNA干擾（RNA interference，RNAi）抑制技術(shù)已經(jīng)得到成功應(yīng)用。這種新方法利用了近期的兩項科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：一是所有的真核細(xì)胞都擁有基因抑制機(jī)制，包括一種被稱為Dicer的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)使用“一個由小干擾RNA（Small Interfering RNA，siRNA）組成的模板分子”；另一個發(fā)現(xiàn)是這些siRNA分子能夠在植物宿主和污染病原體之間穿越；當(dāng)帶有特殊序列的siRNA分子被引入病原體并在其中表達(dá)時，它會開始降解含有與引入siRNA同源序列的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄子；其結(jié)果是，通過引入專門設(shè)計的siRNA，病原體體內(nèi)的靶基因表達(dá)表現(xiàn)為沉默或受到抑制。如果某一基因的RNA轉(zhuǎn)錄能夠通過這種方式被抑制，那么該轉(zhuǎn)錄就不能被翻譯成蛋白質(zhì)。同時，由于蛋白質(zhì)的缺失，相應(yīng)的酶會失去活性；在本例中，該靶酶是毒素生物合成途徑的一個組成部分，因此病原體就不能產(chǎn)生毒素。如果需要沉默的基因位于表達(dá)病原體本身的siRNA中，那么該技術(shù)被稱作RNAi技術(shù)。該技術(shù)被證實(shí)是研究各種生物體基因功能的一項有用技術(shù)。如果該siRNA在某一生物體（如宿主細(xì)胞）中表達(dá)（本文指玉米細(xì)胞），而此靶基因在污染病原體體內(nèi)會被抑制，RNAi抑制就超越了物種界限，這就是宿主誘導(dǎo)基因沉默（Host-Induced Gene Silencing，HIGS）技術(shù)。

2 靶向特定基因

在研究中，HIGS技術(shù)通過表達(dá)一種能夠在真菌黃曲霉毒素通路中靶向作用生物合成基因的RNAi盒來抑制被曲霉菌污染的玉米產(chǎn)生毒素。選擇通過RNAi技術(shù)來靶向抑制的基因為真菌聚酮合成酶基因（即aflC）。之所以選擇這個基因，是因為它編碼的一種蛋白質(zhì)是生成全部四種黃曲霉毒素化合物的生物合成前體所必需的，因而抑制該酶的合成將導(dǎo)致曲霉菌不能產(chǎn)生毒素。另外，聚酮合成酶的編碼基因很大，因此選擇它作為抑制的目標(biāo)，以提高在RNAi盒中使用該基因區(qū)域的可行性。RNAi盒只對曲霉菌基因有效，對宿主玉米或任何下游消費(fèi)者（如人類、豬、牛等）表達(dá)的任何基因都不會表現(xiàn)出顯著的同源性。具體而言，所選擇的三個特定區(qū)域長度大約為200 bp，是真菌聚酮合成酶基因在可食用玉米籽粒部分中構(gòu)建能夠表達(dá)RNAi抑制盒的區(qū)域。經(jīng)生物信息學(xué)分析可知，所選曲霉菌aflC基因的三個區(qū)域與玉米、人、豬或牛的基因組沒有同源性。所選靶基因的三個區(qū)域?qū)煌耆种?，而不是僅僅縮短其長度，使編碼的酶仍保留一定的活性，或者是降低污染性黃曲霉菌產(chǎn)生耐藥性的概率，因為谷物的耐藥性可能由該病原體中aflC基因的三個正在突變的目標(biāo)域組成。研究人員已經(jīng)成功培育出轉(zhuǎn)基因玉米，同時分子分析顯示它能表達(dá)具有除草劑抗性的選擇性標(biāo)記物Bar基因和插入式RNAiaflC基因盒。在RNAiaflC基因盒成功插入前，這種RNAiaflC表達(dá)水平最高的轉(zhuǎn)基因玉米采用自我授粉。研究人員種植了這種來自表達(dá)植物的玉米籽粒，但授粉10 d后玉米棒上仍生長出了一種可產(chǎn)生黃曲霉毒素的知名曲霉菌且數(shù)量相同。該感染在玉米籽粒的生長期持續(xù)保持30 d。在感染的最后，研究人員收集每個感染點(diǎn)周圍的玉米籽粒，并將每一株玉米的籽粒混合在一起以檢測毒素的含量。每個玉米棒感染3～4次，每個感染點(diǎn)周圍有6～8顆籽粒。研究人員檢測了所有非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩鬃蚜?，測試結(jié)果為黃曲霉毒素含量介于1 000 μg/kg～220 000 μg/kg；然而，研究人員未能從轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中檢測到毒素（圖1）。

隨后，研究人員使用定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法測定從感染玉米組織中提取到的RNA，結(jié)果顯示，該目標(biāo)aflC基因在與轉(zhuǎn)基因籽?；プ鞯恼婢M織中都沒有表達(dá)，但在非轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中有表達(dá)，而另一個用作表達(dá)對照的幾丁質(zhì)合成酶在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的受污染玉米籽粒中都有同等水平的表達(dá)。這些研究結(jié)果表明HIGS技術(shù)能用來減少生長期玉米籽粒中黃曲霉毒素的污染，從而能夠降低全球食物/飼料中的黃曲霉毒素水平。

3 探索計劃外的基因抑制

RNAi和HIGS技術(shù)在很大程度上依靠靶序列的特異性來抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。這種技術(shù)的一個潛在風(fēng)險就是引入的siRNA分子可能不僅僅與靶基因具有序列同源性，甚至可能與其他所希望的目標(biāo)基因也有同源性；就HIGS來說，其可能會與互作的生物體共用相似的基因而引起不必要的基因抑制。這種不必要的基因抑制通常會在生物技術(shù)群體中產(chǎn)生“計劃外的表現(xiàn)型”或“非靶向”表達(dá)。本研究向玉米籽粒中引入了siRNA分子，其目的是研究隨著RNAiaflC盒的引入是否會對內(nèi)源性玉米RNA轉(zhuǎn)錄子產(chǎn)生任何不必要的抑制。試驗用的RNA提取自2個非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩缀?個表達(dá)RNAiaflC的轉(zhuǎn)基因玉米。所有RNA轉(zhuǎn)錄樣本通過一個新的兩兩比較法進(jìn)行彼此間比較，尤其要注意轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩椎?組比較。盡管轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組的每一兩兩比較能產(chǎn)生70～100個顯著轉(zhuǎn)錄差異，但是在對這6個轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米的兩兩比較時，研究人員發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比較，轉(zhuǎn)基因樣本中的任何一個轉(zhuǎn)錄均始終未見到始終如一的顯著差異。這說明當(dāng)對兩個樣本（轉(zhuǎn)基因/非轉(zhuǎn)基因）進(jìn)行比較時，由于玉米作物在自身的微環(huán)境和所處的生長階段上略微不同，它們在轉(zhuǎn)錄水平上還存在微小的差異。

然而，為了研究所引入的RNAi盒的表達(dá)在玉米籽粒中是否會出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄上的差異，研究人員分析了6組兩兩對比，結(jié)果沒有在轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中發(fā)現(xiàn)有持續(xù)不同的轉(zhuǎn)錄水平。如果所引入的RNAiaflC盒由于與玉米內(nèi)源性基因具有同源性而引起非靶向表達(dá)，那么我們可以期待此RNA轉(zhuǎn)錄分析應(yīng)該顯示。與2個非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比，3個轉(zhuǎn)基因組的基因表達(dá)會被持續(xù)地抑制。這表明如果用來構(gòu)建RNAi抑制盒的序列特異性地靶向作用于需抑制的基因，那么就不會發(fā)生非靶向或計劃外表型的事件。證明在RNAiaflC轉(zhuǎn)基因玉米籽粒和對照組玉米上的轉(zhuǎn)錄無顯著差異是朝著證明實(shí)質(zhì)上等值的第一步，在本質(zhì)上證明了該生物技術(shù)產(chǎn)品能在各個方面（引入的特性除外）與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障喈?dāng)，這是在生物技術(shù)特性邁向商業(yè)化時的一個調(diào)控手段。

該研究還表明，對于減少收獲前玉米中黃曲霉毒素的含量，HIGS技術(shù)是一項既有應(yīng)用前景又令人興奮的手段；基于此，此項技術(shù)還可引入到其他對黃曲霉毒素敏感的作物，并可用于抑制其他真菌產(chǎn)生霉菌毒素。應(yīng)用HIGS技術(shù)來抑制霉菌毒素合成路徑對提高人類健康以及增強(qiáng)全球食品安全性和穩(wěn)定性來說是一個強(qiáng)大的工具。