任柯昱 張帥 雒珺瑜 呂麗敏 崔金杰 祝建波

摘要 armet是一種水溶性唾液蛋白，在蚜蟲(chóng)取食過(guò)程中具有重要作用。本研究結(jié)合棉蚜的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，以注釋的armet基因轉(zhuǎn)錄本作為參考，克隆得到棉蚜的armet基因（GenBank登錄號(hào)KY612465）。armet基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?22 bp，編碼173個(gè)氨基酸。在其氨基酸序列的N端具有一個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。在其氨基酸序列的C-末端具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)KDEL。運(yùn)用RT-qPCR分析棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的時(shí)間表達(dá)譜，結(jié)果表明，armet基因的表達(dá)量在除3日齡成蚜外的各個(gè)時(shí)期均穩(wěn)定表達(dá)，在兩種專(zhuān)化型棉蚜中表達(dá)量相當(dāng)，說(shuō)明armet基因可能在棉蚜整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程中均起重要作用。分別將棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜轉(zhuǎn)接到西葫蘆Cucurbita pepo L.后，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)armet基因在轉(zhuǎn)接寄主前后表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示armet基因在轉(zhuǎn)接第2代3日齡黃瓜型成蚜中的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)接前，在其他轉(zhuǎn)接試驗(yàn)中轉(zhuǎn)接前后表達(dá)量有變化，但未達(dá)到顯著水平，說(shuō)明armet基因在不同專(zhuān)化型棉蚜寄主轉(zhuǎn)接試驗(yàn)的成、若蚜中發(fā)揮不同作用。

關(guān)鍵詞 棉蚜； 寄主專(zhuān)化型； armet； 寄主轉(zhuǎn)移； 表達(dá)譜

中圖分類(lèi)號(hào)： S 433.39

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017062

Abstract ARMET is a water-soluble saliva protein thought to be crucial for Aphis feeding. In this study， the gene armet was cloned according to the annotated armet transcript sequence from the Aphis gossypii transcriptome （GenBank accession no. KY612465）. The open reading frame of armet was 522 bp， encoding 173 amino acids. It had a signal peptide sequence of 20 amino acid residues in N-terminal region. The C-terminus of its amino acid sequence had an ER retention signal that was KDEL. The temporal expression pattern of armet in aphids on Cucumis sativus and Gossypium hirsutum were studied by RT-qPCR analysis. The expression level of armet gene was stable in all stages except in 3-day-old aphids， and the expression level of armet gene in two biotypes of cotton aphids was similar， which indicated that armet gene might play an important role in the whole life of cotton aphid. The aphids were then transferred to Cucurbita pepo L. from C.sativus and G.hirsutum aphid and the expression of armet was detected by RT-qPCR. The results showed that the expression of armet gene in the 3-day-old aphids of the second generation on C.sativus was significantly higher than that before the transfer， but no significant differences were observed transferrin other transfer experiments， indicating that the armet gene played different roles in the host transfer process.

Key words Aphis gossypii； host biotype； armet； host transfer； gene expression profile

棉蚜Aphis gossypii屬半翅目刺吸式口器昆蟲(chóng)，其生態(tài)適應(yīng)性廣，為多食性昆蟲(chóng)，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，已形成不同的寄主專(zhuān)化型。據(jù)研究報(bào)道，在世界上，棉蚜的寄主多達(dá)285種[1]。在中國(guó)，棉蚜主要分為黃瓜型棉蚜和棉花型棉蚜[23]，棉花型與黃瓜型的棉蚜相互轉(zhuǎn)接后其存活率及繁殖力均明顯下降且不能建立種群，棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜都能在西葫蘆上建立種群[4]。西葫蘆為棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的重要中間寄主[5]。

棉蚜在與寄主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，形成了復(fù)雜的互作關(guān)系。當(dāng)棉蚜為害寄主植物時(shí)，棉蚜唾液中的特異性激發(fā)子被寄主植物細(xì)胞表面的受體識(shí)別，從而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)。而棉蚜通過(guò)唾液中的特異性效應(yīng)子抑制寄主植物的免疫防御反應(yīng)[6]。棉蚜為刺吸式口器昆蟲(chóng)，在取食寄主植物韌皮部汁液的過(guò)程中，分泌凝膠唾液和水溶性唾液，其中水溶性唾液主要為唾液蛋白，具有引發(fā)和抑制寄主植物防御反應(yīng)，促進(jìn)棉蚜取食的作用[7]。

armet又稱(chēng)為中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（MANF），具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫中，響應(yīng)非折疊蛋白反應(yīng)（UPR）[8]。在蚜蟲(chóng)中，armet是一種鈣離子結(jié)合蛋白，是蚜蟲(chóng)唾液腺中高表達(dá)蛋白之一[9]。armet隨唾液分泌到寄主植物中，與篩管中的Ca2+結(jié)合，從而防止Ca2+與Forisome蛋白結(jié)合，致使篩管無(wú)法被Forisome蛋白阻塞，抑制寄主植物的免疫防御反應(yīng)，而利于蚜蟲(chóng)取食[10]。

棉蚜的唾液蛋白是棉蚜與寄主植物相互作用的橋梁，在棉蚜寄主轉(zhuǎn)換及適應(yīng)不同寄主的過(guò)程中具有重要作用。本文分別以棉蚜的兩種寄主專(zhuān)化型：棉花型棉蚜、黃瓜型棉蚜為研究對(duì)象，研究棉蚜唾液蛋白基因armet在棉蚜兩寄主專(zhuān)化型中的表達(dá)譜，以及兩種寄主專(zhuān)化型在中間寄主——西葫蘆上飼養(yǎng)4代后，armet基因表達(dá)量的變化。以期闡明棉蚜唾液蛋白基因armet在不同寄主專(zhuān)化型棉蚜中的表達(dá)情況及棉蚜寄主轉(zhuǎn)移中的作用，為更進(jìn)一步研究armet基因在棉蚜中的具體作用指明方向，為更加有效地防治棉蚜提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

試驗(yàn)所用棉花Gossypium hirsutum Linn.品種為‘中棉所49，由中棉所種質(zhì)資源中期庫(kù)提供；黃瓜Cucumis sativus Linn.品種為‘新津優(yōu)一號(hào)，西葫蘆Cucurbita pepo Linn.品種為‘極早優(yōu)美，購(gòu)于市場(chǎng)。將試驗(yàn)所用植物材料種植于人工氣候室內(nèi)，溫度（26±1）℃，濕度70%～80%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 供試?yán)ハx(chóng)

棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜分別采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場(chǎng)試驗(yàn)田的棉花和黃瓜植株上，分別由一頭成蚜單獨(dú)飼養(yǎng)，繁殖獲得單克隆系。飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，濕度70%～80%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

將棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的成蚜分別接到放于培養(yǎng)皿中的離體棉花和黃瓜葉片的背面，葉柄用浸透水的脫脂棉包裹，以保持葉片的新鮮，24 h后去除成蚜，留若蚜于皿中，繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀(guān)察蚜蟲(chóng)蛻皮情況，并適時(shí)更換葉片。分別收集棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜1、2、3、4齡若蚜和1、3、5、7日齡成蚜樣品，每個(gè)時(shí)期收集約30 mg為一組，共收集3組。將棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的成蚜分別接于離體的西葫蘆葉片上，分別收集每一代棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜3齡若蚜和3日齡成蚜樣品，共收集4代，每個(gè)時(shí)期的蚜蟲(chóng)取約30 mg為一組，收集3組。液氮速凍后保存于-70℃冰箱中備用。

1.3 棉蚜總RNA的分離及cDNA的合成

棉蚜總RNA的提取按照Trizol試劑（Ambion公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。運(yùn)用Nanodrop 2000及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度、純度以及其完整性。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit （Perfect Real Time）試劑盒，將以上不同時(shí)期棉蚜的總RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈的cDNA。

1.4 基因克隆

以本實(shí)驗(yàn)室得到的棉蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLAST比對(duì)，獲得棉蚜的armet基因序列。運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。armet的上游引物為5′-CGAACATTTACTGAAGAAGATTG-3′，下游引物為5′-TTATAACTCATCTTTGACGAAAG-3′。PCR反應(yīng)體系為：PrimeSTAR Max DNA聚合酶（TaKaRa公司）25 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收純化，按照 pEASY-T3 Cloning Kit試劑盒（全式金公司）的說(shuō)明書(shū)將其連接到T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列分析

運(yùn)用SignalP4.1在線(xiàn)軟件（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽。運(yùn)用ExPASy在線(xiàn)軟件（http：∥web.expasy.org/protparam/）分析編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。在NCBI上，通過(guò)BLAST比對(duì)搜索同源基因，運(yùn)用軟件DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。運(yùn)用MEGA 5.05軟件中的UPGMA法進(jìn)行1 000次重復(fù)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)armet基因的序列設(shè)計(jì)定量引物，選取棉蚜的ACTIN和DIMT作為內(nèi)參基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

熒光定量PCR反應(yīng)使用Promega公司的GoTaq qPCR Master Mix熒光定量試劑盒，反應(yīng)體系為：上下游引物各0.85 μL，qPCR MasterMix 10 μL，cDNA模板1.0 μL，最后加ddH2O補(bǔ)齊至20 μL，混勻，離心放入熒光定量PCR儀中擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性2 min；接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95℃，15 s；60℃，1 min。每個(gè)樣品做3次技術(shù)重復(fù)。使用儀器為Eppendorf公司的Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值，采用2-△△Ct法[11]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 armet基因的克隆與序列分析

通過(guò)基因克隆的方法得到棉蚜的armet基因（GenBank登錄號(hào)為KY612465）（圖1）。其開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為522 bp，編碼173個(gè)氨基酸，推測(cè)其蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為20.3 kD，等電點(diǎn)為6.62，具有8個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，通過(guò)SignalP4.1預(yù)測(cè)其蛋白信號(hào)肽為21個(gè)氨基酸。在氨基酸序列的C-末端具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)位點(diǎn)KDEL。

經(jīng)BLAST比對(duì)后，我們選取豌豆蚜Acyrthosiphon pisum（GenBank登錄號(hào)：XP_001949541.1）、麥雙尾蚜Diuraphis noxia（GenBank登錄號(hào)：XP_015365890.1）、中華按蚊Anopheles sinensis（GenBank登錄號(hào)：KFB4-0515.1）、家蠅Musca domestica（GenBank登錄號(hào)：XP_005185002.2）、家蠶Bombyx mori（GenBank登錄號(hào)：XP_004921981.1）armet基因編碼的氨基酸序列，與棉蚜的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（圖2），其中豌豆蚜與棉蚜armet基因編碼的氨基酸序列同源性最高，為95%?？梢钥闯鲈摶蛟诶ハx(chóng)的進(jìn)化過(guò)程中是高度保守的。

運(yùn)用MEGA5.0軟件，采用UPGMA法對(duì)包括棉蚜在內(nèi)的21種昆蟲(chóng)的armet基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果可以看出，棉蚜的armet基因與蚜科昆蟲(chóng)的同源性較高，而與其他昆蟲(chóng)的同源性較低，分屬不同分支（圖3）。

2.2 armet基因的時(shí)間表達(dá)譜

2.2.1 黃瓜型棉蚜的armet基因的時(shí)間表達(dá)譜

運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)armet基因在黃瓜型棉蚜不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示armet基因在黃瓜型棉蚜生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，在若蚜的早期及中期（1～3齡）表達(dá)量相對(duì)較低，4齡表達(dá)量有所上升，但差異不顯著，1日齡成蚜與4齡若蚜基因的表達(dá)量相同，1日齡成蚜基因的表達(dá)量顯著降低，5日齡成蚜基因表達(dá)量再次上升（圖4）。

2.2.2 棉花型棉蚜的armet基因的時(shí)間表達(dá)譜

運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)armet基因在棉花型棉蚜不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。在棉花型棉蚜的若蟲(chóng)期，armet基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，但差異不顯著。在成蟲(chóng)期，armet基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)。在棉花型棉蚜的整個(gè)發(fā)育時(shí)期，3日齡成蚜的表達(dá)量最低，顯著低于3、4齡若蚜和7日齡成蚜（圖5）。

2.3 寄主轉(zhuǎn)接后基因armet表達(dá)量的變化

2.3.1 黃瓜型棉蚜轉(zhuǎn)接西葫蘆前后基因armet表達(dá)量的變化

將黃瓜型棉蚜轉(zhuǎn)接到中間寄主西葫蘆上后，各代3齡若蚜armet基因的表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)接前取食原寄主黃瓜的表達(dá)量。轉(zhuǎn)接后，基因armet的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中轉(zhuǎn)接后第二代3齡若蚜表達(dá)量最高，但各代之間差異不顯著（圖6）。

將黃瓜型棉蚜轉(zhuǎn)接到中間寄主西葫蘆上后，armet基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中第1、2、3代3日齡成蚜armet基因的表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)接前的，且第2代3日齡成蚜armet基因的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)接前（圖7）。

2.3.2 棉花型棉蚜轉(zhuǎn)接西葫蘆前后基因armet表達(dá)量的變化

將棉花型棉蚜轉(zhuǎn)接到中間寄主西葫蘆上后，各代3齡若蚜armet基因的表達(dá)量均低于轉(zhuǎn)接前取食原寄主棉花的表達(dá)量。轉(zhuǎn)接后，基因armet的表達(dá)量呈現(xiàn)逐代降低趨勢(shì)，各代之間基因表達(dá)量差異不顯著（圖8）。

轉(zhuǎn)接到中間寄主西葫蘆上后的棉花型棉蚜，各代3日齡成蚜armet基因的表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)接前取食原寄主棉花的表達(dá)量。轉(zhuǎn)接后，基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)接前后差異不顯著（圖9）。

3 討論

armet是蚜蟲(chóng)唾液腺分泌蛋白，對(duì)蚜蟲(chóng)的取食具有積極促進(jìn)作用。本研究首次克隆了棉蚜的唾液蛋白相關(guān)基因armet的cDNA序列，并對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果表明，該基因具有armet的典型特征，具有8個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)。armet基因編碼的氨基酸序列的N端具有一個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，這與唾液蛋白為外分泌蛋白的特征一致。在氨基酸序列的C端具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)位點(diǎn)：KDEL，預(yù)測(cè)該基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的相關(guān)反應(yīng)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果可以看出，棉蚜的armet基因與蚜科昆蟲(chóng)的同源性較高，而與其他昆蟲(chóng)在進(jìn)化樹(shù)上分屬不同分支，說(shuō)明在功能上已與其他昆蟲(chóng)的armet產(chǎn)生了一定的分化。

昆蟲(chóng)的寄主專(zhuān)化性是指昆蟲(chóng)對(duì)特定寄主取食的專(zhuān)一性反應(yīng)，即對(duì)不同種類(lèi)的寄主植物和不同的取食部位的嗜食程度[12]。在昆蟲(chóng)與寄主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，昆蟲(chóng)為了適應(yīng)寄主植物和不斷變化的自然環(huán)境，會(huì)導(dǎo)致同一物種不同種群間適應(yīng)性的改變，因而分化出不同的寄主專(zhuān)化型。雖然棉蚜為多食性昆蟲(chóng)，但其對(duì)廣泛寄主長(zhǎng)期的適應(yīng)過(guò)程中，已形成了相對(duì)嚴(yán)格的寄主專(zhuān)化型[13]。

通過(guò)熒光定量的方法對(duì)棉蚜的兩個(gè)寄主專(zhuān)化型：棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜中的armet基因的時(shí)間表達(dá)譜進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，armet基因在棉蚜的兩個(gè)寄主專(zhuān)化型生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，且表達(dá)量都具有先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)。在若蟲(chóng)的晚期及成蟲(chóng)的初期armet基因的表達(dá)量出現(xiàn)一個(gè)峰值，這與赤擬谷盜中的研究結(jié)果一致[14]。說(shuō)明armet基因在棉蚜的不同寄主專(zhuān)化型中的表達(dá)量的變化趨勢(shì)是大體相同的，但具體到每個(gè)時(shí)期，又具有各自的特異性。

將棉花型棉蚜轉(zhuǎn)移到中間寄主西葫蘆上培養(yǎng)4代，轉(zhuǎn)接后，armet基因在各代3齡若蚜中的表達(dá)量具有先升高后降回轉(zhuǎn)接前表達(dá)量的趨勢(shì)，在3日齡成蚜中也有相同的趨勢(shì)。將黃瓜型棉蚜轉(zhuǎn)接到西葫蘆上后，armet基因無(wú)論在若蚜還是成蚜中的表達(dá)量都具有逐代降低的趨勢(shì)，但各代之間armet基因的表達(dá)量變化差異不顯著，與轉(zhuǎn)接寄主前變化差異也不顯著。說(shuō)明armet基因在棉蚜的不同寄主專(zhuān)化型之間具有不同的變化趨勢(shì)，相同寄主專(zhuān)化型中在成蚜和若蚜中的變化趨勢(shì)相同，但armet基因在寄主轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮的作用并不相同，這可能由于西葫蘆與黃瓜的親緣關(guān)系近于西葫蘆與棉花的親緣關(guān)系，轉(zhuǎn)接后承受的植物防御壓力也不同。

研究表明，蚜蟲(chóng)中armet基因表達(dá)蛋白為鈣離子結(jié)合蛋白[9]，能夠阻斷響應(yīng)鈣離子激活篩管閉合機(jī)制中的forisome蛋白形成締結(jié)而阻塞篩管缺口[10]，具有直接抑制植物防御反應(yīng)的作用。本研究的結(jié)果表明，armet基因在各個(gè)生物型棉蚜原始寄主上整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程中均起重要作用，在不同專(zhuān)化型棉蚜寄主轉(zhuǎn)接試驗(yàn)的成、若蚜中發(fā)揮不同作用，為下一步研究armet基因在棉蚜中的具體作用和功能奠定了重要基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）