吳永良，李燕垣，彭云鐵

(廣東省質(zhì)量監(jiān)督煙草檢驗站，廣東 廣州 510610)

卷煙主流煙氣中的酚類化合物主要由多酚類化合物(綠原酸和蕓香苷)、木質(zhì)素和纖維素在卷煙燃燒過程中熱裂解生成[1]。目前，已報道的卷煙煙氣中酚類物質(zhì)有50多種，其中含量最高的為苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚7種酚類化合物[2]。酚類化合物對人體健康的影響常表現(xiàn)為兩面性，既具有基因毒性和致癌作用，又具有抗基因毒性和抗癌作用[3-4]。因此，對卷煙主流煙氣中酚類化合物的分析檢測具有重要意義。

卷煙煙氣是一個非常復(fù)雜的混合物體系，其中含有超過5 000種化合物，且酚類化合物含量很低，實現(xiàn)其準(zhǔn)確定量難度較大。目前，卷煙主流煙氣中酚類化合物的檢測方法主要有：氣相色譜法(GC)[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)[7-10]、液相色譜法(HPLC)[11-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[18-20]等。傳統(tǒng)的GC法靈敏度低，需要對樣品衍生化，前處理復(fù)雜；GC/MS法得到的色譜雜峰較多，一般需要固相萃取凈化樣品；最常用的是HPLC法，但分析時間長，對低含量的間苯二酚定量準(zhǔn)確性較差；HPLC-MS/MS儀器昂貴，不易普及。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)檢出限低、抗干擾能力強、定性準(zhǔn)確，適合復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量化合物的測定，目前，尚未見該方法應(yīng)用于檢測卷煙主流煙氣中酚類化合物的報道。

本研究擬采用GC-MS/MS法檢測卷煙主流煙氣中的酚類化合物，希望為卷煙有害物質(zhì)的分析研究提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

7890B-7000C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；SM450直線型吸煙機：英國Cerulean公司產(chǎn)品；AG245電子分析天平(感量0.01 mg)：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；KH-500DE超聲波發(fā)生器：昆山禾創(chuàng)公司產(chǎn)品；HY-5振蕩器：常州澳華公司產(chǎn)品。

卷煙樣品：均來源于市售卷煙樣品；44 mm劍橋濾片：英國Whatman公司產(chǎn)品；0.45 μm有機相濾膜：上海安譜公司產(chǎn)品。

苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚：純度99.0%，美國Supelco公司產(chǎn)品；苯甲酸丙酯、十七烷、苯甲酸芐酯：純度99.0%，美國Sigma-Aldrich產(chǎn)品；丙酸苯乙酯：純度99.0%，Acros公司產(chǎn)品；環(huán)己烷、二氯甲烷、異丙醇、甲醇：HPLC級，德國CNW公司產(chǎn)品。

1.2 溶液配制

內(nèi)標(biāo)溶液：稱取約0.1 mg丙酸苯乙酯，用異丙醇溶解，定容于100 mL棕色容量瓶。

一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取約150 mg鄰苯二酚、對苯二酚，約50 mg苯酚，約25 mg鄰甲酚、間甲酚、對甲酚，約10 mg間苯二酚(精確至0.01 mg)，用異丙醇溶解，定容于100 mL棕色容量瓶。

二級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取10 mL一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，并用異丙醇定容。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取0.1、0.2、0.5 mL二級標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1、0.2、0.5 mL一級標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 mL棕色容量瓶中，再加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，用異丙醇定容。

1.3 樣品前處理

按照GB/T 16450 和GB/T 19609規(guī)定的方法捕集5支卷煙的總粒相物[ 21-22]。將捕集有總粒相物的劍橋濾片置于100 mL錐形瓶中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液和50 mL異丙醇萃取劑，超聲提取20 min。靜置，冷卻至室溫后，將萃取液過0.45 μm有機濾膜，然后將濾液轉(zhuǎn)移至色譜分析瓶中，用于GC-MS/MS分析測定。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：HP-5MS UI毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣，恒流模式，流速1.2 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1.0 μL；分流比：20∶1；升溫程序：從80 ℃以6 ℃/min 升至140 ℃，再以20 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

1.4.2質(zhì)譜條件 EI離子源電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；溶劑延遲：2 min；碰撞氣流速：氮氣1.5 mL/min，氦氣2.25 mL/min。優(yōu)化后的保留時間、定量和定性離子對及碰撞能量列于表1。

表1 7種酚類化合物和內(nèi)標(biāo)的保留時間和MRM參數(shù)Table 1 Retention time and MRM parameters of 7 phenolic compounds and ISTD

1.5 結(jié)果計算

卷煙主流煙氣中酚類化合物的釋放量由式(1)計算得出：

(1)

式中：m為每支卷煙酚類化合物的釋放量(μg/cig)；A為萃取溶液中酚類化合物的濃度(mg/L)；V為萃取溶液的體積(mL)；n為每次測試抽吸卷煙的支數(shù)(cig)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取劑及用量的選擇 提取劑是影響提取效率的關(guān)鍵因素，提取劑與目標(biāo)物的極性越接近，目標(biāo)物在溶劑中的溶解度就越大，越易被提取。實驗比較了環(huán)己烷、二氯甲烷、異丙醇和甲醇4種不同極性溶劑的萃取效率，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明：環(huán)己烷提取鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚的效率較低；二氯甲烷提取苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚的效率較低；異丙醇和甲醇對各化合物的提取效率相似，但異丙醇的毒性小于甲醇，因此選擇異丙醇為提取劑。

提取劑的用量至少應(yīng)可浸沒捕集濾片。本實驗考察了20、50、100 mL 異丙醇提取劑對提取效率的影響，結(jié)果列于表3?？梢姡?dāng)提取劑為20 mL時，7種酚類化合物的測定結(jié)果均略低于50 mL和100 mL。綜合考慮，選擇提取劑用量為50 mL。

表2 不同提取劑的提取效率比較Table 2 Comparison of extraction efficiency of different extraction solvents

表3 不同提取溶劑量的比較Table 3 Comparison of extraction efficiency of different extraction solvent volumes

圖1 不同提取方式和提取時間的比較Fig.1 Comparison of different extraction methods and extraction time

2.1.2提取方式與時間的優(yōu)化 本實驗考察了振蕩和超聲2種提取方式，提取時間分別為5、10、20、30、40、60 min，提取效率示于圖1。超聲提取的提取效率略優(yōu)于振蕩提取，當(dāng)提取時間達到20 min后，繼續(xù)延長提取時間，提取效率沒有明顯變化。因此選擇超聲提取20 min。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1內(nèi)標(biāo)的選擇 實驗選取了煙草檢測中常用的苯甲酸丙酯、丙酸苯乙酯、十七烷、苯甲酸芐酯為研究對象，考察各化合物作為內(nèi)標(biāo)物對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果示于圖2?？梢?，十七烷和苯甲酸芐酯與目標(biāo)物保留時間差別較大，不適合作為內(nèi)標(biāo)物；苯甲酸丙酯和丙酸苯乙酯與目標(biāo)物保留時間較接近，且相對響應(yīng)較高，可作為內(nèi)標(biāo)物。本實驗選用丙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)物。

2.2.2色譜柱與程序升溫條件的確定 實驗分別考察了弱極性的HP-5MS UI、中極性的DB-35MS和強極性的HP-INNOWAX(規(guī)格均為30 m×0.25 mm×0.25 μm)3種毛細管柱對7種酚類化合物的分離效果。結(jié)果表明，HP-INNOWAX色譜柱能夠?qū)崿F(xiàn)間甲酚和對甲酚的完全分離，但鄰、間、對苯二酚的相對響應(yīng)較弱；HP-5MS UI和DB-35MS色譜柱均不能實現(xiàn)間甲酚和對甲酚的完全分離，但各酚類化合物的峰形較好、相對響應(yīng)較強，DB-35MS色譜柱目標(biāo)物保留時間比HP-5MS UI更長。因此，選取HP-5MS UI色譜柱為分析柱。

實驗中優(yōu)化后的升溫程序為：從80 ℃以6 ℃/min升溫至140 ℃，再以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min。在該條件下，僅間甲酚和對甲酚不能得到有效地分離，其余各物質(zhì)均能較好地分離，且出峰較快，結(jié)果示于圖3。由于間甲酚和對甲酚不能完全分離，本實驗將二者的釋放量合并計算。

2.2.3質(zhì)譜條件的確定 首先采用全掃描(Scan)模式確定內(nèi)標(biāo)物和目標(biāo)物的母離子，然后采用產(chǎn)物離子掃描(Product ion analysis)模式優(yōu)化碰撞能量及產(chǎn)物子離子，對每組母離子/子離子分別選擇碰撞能量為5、10、15、20、25、30、35、40 V進行掃描，選擇子離子響應(yīng)最強的碰撞能量，在此基礎(chǔ)上進行微調(diào)，得到最優(yōu)碰撞能量。最后采用MRM模式對內(nèi)標(biāo)物和目標(biāo)物進行定性、定量分析。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件列于表1。

2.3 分析方法評價

2.3.1工作曲線、檢出限與定量限 在優(yōu)化條件下，對酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進行GC-MS/MS測定，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，分別以3倍和10倍信噪比確定檢出限(LODs)和定量限(LOQs)，結(jié)果列于表4。結(jié)果表明，化合物的相關(guān)系數(shù)均在0.998 6以上，線性關(guān)系良好；定量限為0.012～0.021 μg/cig。

2.3.2回收率和精密度 選擇烤煙型和混合型卷煙樣品各1個，將7種酚類化合物的3種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樣品捕集后的濾片中，進行加標(biāo)回收率實驗，每個添加水平重復(fù)5次，并進行6次日內(nèi)和5次日間的平行測定，結(jié)果列于表5。該方法的回收率為91.1%～107.7%，平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～6.6%，表明該方法具有良好的精密度。

表4 7種酚類化合物的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of 7 phenols

表5 方法的加標(biāo)回收率和精密度Table 5 Spiked recoveries, intra-day and inter-day precisions of the method

續(xù)表5

2.4 實際樣品測定

按照本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法[23]分別測定了1R5F、3R4F和CM7等3個參比卷煙主流煙氣中7種酚類化合物的釋放量，結(jié)果列于表6。通過比較發(fā)現(xiàn)，2種方法的測定結(jié)果一致，但相比標(biāo)準(zhǔn)方法，本方法具有分析時間短、檢測限低等優(yōu)點。

應(yīng)用本方法檢測12個不同品牌規(guī)格卷煙樣品主流煙氣中7種酚類化合物，結(jié)果列于表7?？梢姡煌放凭頍煙煔庵蟹宇惢衔锏尼尫帕看嬖谳^大差異，酚類化合物同焦油釋放量成正相關(guān)；混合型卷煙的苯酚釋放量一般低于烤煙型卷煙；相同焦油量卷煙的酚類化合物釋放量差異也較大，主要是由不同的葉組配方、卷煙輔材、加工工藝等造成的。

表6 2種方法檢測參比卷煙主流煙氣中7種酚類化合物的釋放量Table 6 Comparison of 7 phenols content of 3 cigarette samples under different methods

表7 部分市售卷煙主流煙氣中7種酚類化合物的釋放量Table 7 Contents of 7 phenols in the mainsteam smoke of the cigarette samples sold in the market

3 結(jié)論

建立了卷煙主流煙氣中苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚7種酚類化合物的GC-MS/MS檢測方法。通過優(yōu)化前處理和儀器條件，方法定量限為0.012～0.021 μg/cig，加標(biāo)回收率為91.1%～107.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～6.6%。該方法的重復(fù)性和回收率良好、定量限低、操作簡單、分析時間短，適用于大批量卷煙樣品主流煙氣中酚類化合物的快速定量檢測。

參考文獻：

[1] 謝劍平. 卷煙危害性評價原理與方法[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009，90-91.

[2] HOFFMANN D, HOFFMANN I, EL-BAYOUMY K. The less harmful cigarette: a controversial issue. a tribute to Ernst L. Wynder[J]. Chemical Research in Toxicology, 2001, 14(7): 767-790.

[3] FUKUHARA Y, YOSHIDA D, GOTF. Reduction of mutagenic products in the presence of polyphenols during pyrolysis of protein[J]. Agricultural & Biological Chemistry, 1981, 45(5): 1 061-1 066.

[4] HECHT S S, CARMELLA S, MORI H, et al. A study of tobacco carcinogenesis. XX. Role of catechol as a major cocarcinogen in the weakly acidic fraction of smoke condensate[J]. J Natl Cancer Inst, 1981, 66(1): 163-169.

[5] 毛多斌,馬宇平,張峻松,等. 國內(nèi)外混合型卷煙主流煙氣中酚類物質(zhì)的分析[J]. 煙草科技,2002,(4):17-20.

MAO Duobin, MA Yuping, ZHANG Junsong, et al. Analysis of phenolic compounds in mainstream smoke of domestic and foreign blended cigarettes[J]. Tobacco Science & Technology, 2002, (4): 17-20 (in Chinese).

[6] 劉春波,陸舍銘,劉正聰,等. 吹掃捕集-氣相色譜法測定卷煙主流煙氣中揮發(fā)酚[J]. 理化檢驗：化學(xué)分冊,2009,45(3):349-351.

LIU Chunbo, LU Sheming, LIU Zhengcong, et al. GC determination of volatile phenols in mainstream smoke of cigarettes with purge and trap technique[J]. Physical Testing and Chemical Analysis part B: Chemical Analysis, 2009, 45(3): 349-351 (in Chinese).

[7] 路鑫,蔡君蘭,武建芳,等. 全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜用于卷煙主流煙氣中酚類化合物的表征[J]. 化學(xué)學(xué)報,2004,62(8):804-810.

LU Xin, CAI Junlan, WU Jianfang, et al. Characterization of phenols in cigarette mainstream smoke condensate by using comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry[J]. Acta Chim Sinica, 2004, 62(8): 804-810(in Chinese).

[8] VAUGHAN C, STANFILL S B, POLZIN G M, et al. Automated determination of seven phenolic compounds in mainstream tobacco smoke[J]. Nicotine & Tobacco Research, 2008, 10(7): 1 264-1 268.

[9] SHA Y F, HUANG D N, ZHENG S J, et al. Development of microwave-assisted headspace solid-phase microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry for the analysis of phenol in a cigarette pad[J]. Anal Methods, 2013, 5: 4 655-4 659.

[10] 姬厚偉,張麗,劉劍,等. 超聲萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定卷煙主流煙氣中的6種揮發(fā)酚[J]. 理化檢驗：化學(xué)分冊,2016,52(4):412-416.

JI Houwei, ZHANG Li, LIU Jian, et al. GC-MS determination of 6 volatile phenols in mainstream smoke of cigarettes with ultrasonic extraction[J]. Physical Testing and Chemical Analysis part B: Chemical Analysis, 2016, 52(4): 412-416(in Chinese).

[11] 謝復(fù)煒,趙明月,王昇,等. 卷煙主流、側(cè)流煙氣中酚類化合物的高效液相色譜測定[J]. 煙草科技,2004,(5):6-10.

XIE Fuwei, ZHAO Mingyue, WANG Sheng, et al. High performance liquid chromatographic determination of major phenolic compounds in mainstream and sidestream cigarette smoke[J]. Tobacco Science & Technology, 2004, (5): 6-10(in Chinese).

[12] 陳章玉,張承明,徐若飛,等. 快速高效液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的酚[J]. 色譜,2006,24(2):209-210.

CHEN Zhangyu, ZHANG Chengming, XU Ruofei, et al. High performance liquid chromatographic determination of phenolic compounds in mainstream cigarette smoke[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2006, 24(2): 209-210 (in Chinese).

[13] LIU F, YANG L, CHAO M, et al. Determination of phenol, cresols, and dihydroxybenzenes in mainstream cigarette smoke with ultrasonic extraction and fast HPLC[J]. Tobacco Science & Technology, 2007, 49(11): 66-73.

[14] 李中皓,唐綱嶺,龐永強,等. 超高效液相色譜β-環(huán)糊精流動相添加劑法分析卷煙主流煙氣中7種酚類化合物[J]. 色譜,2010,28(8):790-794.

LI Zhonghao, TANG Gangling, PANG Yong-qiang, et al. Analysis of seven compounds in main stream cigarette smoke by ultra performance liquid chromatography using a β-cyclodextrin mobile phase additive[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2010, 28(8): 790-794(in Chinese).

[15] WU J C, RICKERT W S, MASTERS A. An improved high performance liquid chromatography-fluorescence detection method for the analysis of major phenolic compounds in cigarette smoke and smokeless tobacco products[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1 264: 40-47.

[16] 李小蘭,李英堂,孟冬玲,等. 離子液體雙水相萃取測定卷煙煙氣中酚類物質(zhì)的研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2014,36(4):571-577.

LI Xiaolan, LI Yingtang, MENG Dongling, et al. Two aqueous phase extraction of ionic liquid combined high performance liquid chromatographic for the determination in cigarettes stream[J]. Journal of Yunnan University, 2014, 36(4): 571-577(in Chinese).

[17] HU N, DU W, DAI Y. Determination of major phenolic compounds retained by cigarette filter with high performance liquid chromatography[J]. Tobacco Science & Technology, 2016, 49(11): 66-73.

[18] 肖志翔,楊翠清,丁時超,等. 卷煙主流煙氣中酚類化合物的LC-MS/MS法測定[J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報,2009,32(4):72-76.

XIAO Zhixiang, YANG Cuiqing, DING Shichao, et al. LC-MS/MS determination of major phenolic compounds in mainstream cigarette smoke[J]. Journal of Natural Science of Hunan University, 2009, 32(4): 72-76(in Chinese).

[19] SAHA S, MISTRI R. A rapid and selective method for simultaneous determination of six toxic phenolic compounds in mainstream cigarette smoke using single-drop microextraction followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405(28): 9 265-9 272.

[20] 任志芹,艾小勇,黃志強,等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定卷煙中的兒茶酚[J]. 色譜,2015,33(5):541-544.

REN Zhiqin, AI Xiaoyong, HUANG Zhiqiang, et al. Determination of catechol in tobacco by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(5): 541-544(in Chinese).

[21] GB/T 16450—2004 常規(guī)分析用吸煙機 定義和標(biāo)準(zhǔn)條件[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[22] GB/T 19609—2004 卷煙用常規(guī)分析用吸煙機測定總粒相物和焦油[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[23] YC/T 255—2008 卷煙主流煙氣中主要酚類化合物的測定 高效液相色譜法[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.