費云燕 楊 杰,2,* 范方軍,2 王芳權(quán),2 李文奇,2 王 軍,2 朱金燕,2 仲維功,2

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水稻咪草煙抗性的遺傳分析及其緊密連鎖分子標記的篩選與應用

費云燕1楊 杰1,2,*范方軍1,2王芳權(quán)1,2李文奇1,2王 軍1,2朱金燕1,2仲維功1,2

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所, 江蘇南京 210014;2揚州大學 / 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚州 225009

抗除草劑水稻的培育及推廣能夠提高除草效率, 取得巨大經(jīng)濟效益。本研究中金粳818為抗咪草煙資源, 以其與常規(guī)粳稻蘇墾118雜交產(chǎn)生的F2群體對抗性基因進行遺傳分析與分子定位表明, 其抗性表型受1對顯性核基因控制, 位于水稻第2染色體SSR分子標記RM7413和RM7426之間。對該區(qū)間候選基因預測和測序發(fā)現(xiàn), 咪草煙靶基因-乙酰乳酸合酶基因()在重要功能位點發(fā)生1個堿基的突變(G變?yōu)锳), 導致一個氨基酸由絲氨酸(S)突變?yōu)樘於０?N), 初步確定是抗性表型的重要候選基因。標記RM7413、RM7426與的物理距離分別為165 kb、1612 kb。以金粳818與南粳9108為親本, 檢測標記RM7413在輔助育種實踐中的應用潛力, 對雜交種及其自交后代進行連續(xù)表型及標記選擇, F7群體能夠穩(wěn)定遺傳抗咪草煙性狀, 表明RM7413在粳稻抗咪草煙輔助育種中具有巨大應用潛力。本研究結(jié)果為粳稻抗除草劑分子標記輔助改良奠定了基礎(chǔ)。

粳稻; 分子標記輔助育種; RM7413; 金粳818; 咪草煙

草害是影響水稻產(chǎn)量的主要因素之一。雜草不僅與作物爭奪水分、光照等, 同時易于寄生病蟲害, 影響作物生長發(fā)育, 降低作物產(chǎn)量、品質(zhì), 影響收獲效率, 造成巨大經(jīng)濟損失[1-2]。近年, 由于免耕、直播、拋秧、旱育秧等栽培技術(shù)的推廣, 使稻田雜草危害加劇[3]?；瘜W除草劑作為一種快速、有效、經(jīng)濟、實用的除草措施, 為全球農(nóng)作物高產(chǎn)做出了巨大貢獻。而除草劑對常規(guī)作物同樣具有殺害性, 一定程度上限制了其使用范圍, 培育和利用抗除草劑作物是推動化學除草劑發(fā)展的動力, 除草劑和抗性作物的配合使用是目前最為經(jīng)濟有效解決稻田雜草問題的方式。

培育抗除草劑作物的方法主要包括自然選擇、人工誘變、雜交育種及轉(zhuǎn)基因育種等。目前, 在抗不同種類除草劑的作物中, 只有抗草甘膦、草銨膦及抗咪唑啉酮類除草劑作物獲得大面積的種植[4], 最受人們青睞的為用非轉(zhuǎn)基因手段獲得的抗咪唑啉酮類除草劑作物, 商業(yè)化的該類抗性作物主要有水稻、玉米、油菜、小麥和向日葵[5]。咪唑啉酮類除草劑由美國氰胺公司開發(fā), 已有6個商業(yè)化品種, 包括咪唑煙酯、咪唑乙煙酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草煙、甲基咪草煙和咪草酸。這是一類廣譜性除草劑, 通過抑制靶標酶——乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase, ALS), 影響植物體內(nèi)支鏈氨基酸合成, 進而影響植物生長, 具有活性高、殺草譜廣、用量少、對哺乳動物低毒等特點[6]。咪草煙是咪唑乙煙酸家族成員, 可播前混土使用, 也可苗前、出苗后及插秧后使用, 適用于水稻整個生育期[7]?？惯洳轃熕酒贩N主要包括XL729、XL745、XP756和XP534[8], 美國通過推廣抗咪草煙水稻獲得巨大收益, 至2011年抗咪草煙水稻及其雜交稻已占美國水稻的50%[8], 該類水稻品種應用潛力巨大。

分子標記輔助選擇與傳統(tǒng)表型選擇相比能精確跟蹤目標性狀, 減少育種的盲目性, 選擇過程不受環(huán)境及人為因素影響; 減少田間工作, 節(jié)約育種成本; 且可在作物早世代進行目標性狀的選擇, 節(jié)約時間, 縮短育種周期[9]。分子標記輔助育種與傳統(tǒng)育種手段結(jié)合在各作物的抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等選育中發(fā)揮著重要作用, 抗除草劑作為一種優(yōu)良性狀, 越來越多的研究者著眼于篩選相關(guān)分子標記。胡茂龍等[10]開發(fā)了AP15F/AP18R、AP15F/AP19R標記用于抗咪唑啉酮類除草劑油菜的育種; 李志江等[11]篩選了水稻抗除草劑“拿捕凈”的SSR標記并選育了抗除草劑材料; Bulos等[12]開發(fā)了向日葵抗除草劑的分子標記; Mithila等[13]篩選了芥子抗植物生長素類除草劑的分子標記, 這些標記為作物抗除草劑育種提供了便利。

本研究對篩選得到的抗咪草煙水稻品種金粳818進行遺傳分析, 利用獲得的連鎖標記進行分子標記輔助育種, 并驗證其在長江中下游常規(guī)粳稻中的應用潛力。該研究為粳稻抗除草劑分子標記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金粳818、蘇墾118、南粳9108及91份粳稻(表1)均為長江中下游主要推廣的粳稻品種, 具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等顯著特點, 其中, 金粳818是本團隊鑒定的具有抗咪草煙特性的粳稻品種。

1.2 表型鑒定

于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院試驗基地種植所有材料, 采用完全隨機區(qū)組設(shè)計, 每行10株, 株行距為18 cm′22 cm, 以常規(guī)方法栽培。水稻種子催芽后播種, 在幼苗長至二葉一心時調(diào)查群體抗性, 利用咪草煙(70 g ai hm–2)噴灑篩選, 2周后調(diào)查表型, 將正常生長的幼苗記為抗咪草煙的個體, 將死亡的幼苗記為對咪草煙敏感的個體。

1.3 遺傳分析

以金粳818與蘇墾118雜交獲得的F2群體作為遺傳分析群體, 采用分群法定位基因[14]。根據(jù)F2群體的表型, 分別隨機選取死亡與存活單株各5株, 取等量葉片, 構(gòu)建抗性基因池與感性基因池, 以CTAB法提取DNA[15]。參照Gramene數(shù)據(jù)庫(http://www.gramene.org/)中的SSR引物序列, 隨機選擇500對均勻分布于水稻12對染色體上的SSR分子標記, 篩選多態(tài)性標記。PCR體系(20mL)含2′PCR Green Mix, 10mL; SSR標記引物對(2mmol L–1), 各2mL; 模板DNA, 2mL; dH2O, 4mL。PCR條件為預變性94℃, 5 min; 變性94℃, 30 s; 退火60~50℃ (溫度與引物相關(guān)), 30 s; 延伸72℃, 30 s; 30個循環(huán); 延伸72℃, 5 min; 保溫15℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 快速銀染后觀察[16]。利用多態(tài)性標記隨機檢測F2群體中的100株敏感單株, 構(gòu)建遺傳圖譜。查詢定位區(qū)間內(nèi)所有基因信息, 篩選候選基因, 以日本晴的DNA序列設(shè)計引物, 擴增候選基因并測序, 分析測序結(jié)果。

1.4 連鎖標記在育種中的應用

以金粳818為供體, 南粳9108為受體, 配制雜交組合, 雜交種自交得到F2群體, 利用1.3中連鎖標記對F2群體單株進行鑒定并選擇。對選擇的植株連續(xù)自交并進行表型及標記篩選, 在F7獲得穩(wěn)定材料。隨機選擇F7群體中若干單株進行標記及表型鑒定, 確定連鎖標記在抗咪草煙輔助育種中的可行性。進一步利用連鎖標記對91份常規(guī)粳稻品種(表1)及金粳818進行多態(tài)性分析。若存在多態(tài)性, 則標記可應用于輔助改良常規(guī)粳稻的抗咪草煙性狀, 獲得抗咪草煙粳稻新品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型鑒定

粳稻品種金粳818為抗咪草煙品種, 在幼苗期噴灑除草劑后仍能夠正常生長, 葉片無枯萎變黃現(xiàn)象。常規(guī)粳稻品種為咪草煙敏感品種, 噴灑除草劑后, 植株停止生長, 葉片變黃并逐漸枯萎死亡(圖1)。

表1 長江中下游主要推廣的91份粳稻品種

2.2 遺傳分析

以金粳818為供體, 蘇墾118為受體, 收獲F1種子, F1幼苗長至二葉一心時噴灑咪草煙, 結(jié)果顯示F1植株全部存活, 表明雜種F1抗咪草煙。F2幼苗以相同的方式處理, 580株F2植株中, 430株抗性苗能夠正常生長, 150株敏感苗立即枯萎死亡(圖2), 抗、感植株符合3∶1理論分離比例(χ2=0.1862< χ20.05,1=3.84)。以上結(jié)果說明金粳818抗咪草煙性狀由一對顯性核基因控制。

2.3 基因定位

隨機選擇500對均勻分布于水稻12對染色體上的SSR分子標記, 對金粳818、蘇墾118、抗、感DNA混合池進行多態(tài)性分析, 發(fā)現(xiàn)位于第2染色體上的SSR標記RM7632、RM7413、RM7426、RM5221在樣本中主條帶清晰, 多態(tài)性明顯, 重復性好, 能夠清楚分辨不同基因型。進一步利用這4對標記篩選F2群體中100株咪草煙敏感(隱性)單株, 發(fā)現(xiàn)重組個體分別為5、1、6和11, 將目標基因定位于RM7413和RM7426之間(圖3)。經(jīng)相關(guān)軟件預測基因, 在定位區(qū)間內(nèi)存在咪草煙靶基因, 測序分析發(fā)現(xiàn)該基因在重要功能位點第1880位堿基處G突變?yōu)锳, 即第627位氨基酸由絲氨酸(Ser, S)突變?yōu)樘於０?Asn, N)(圖3)。

2.4 標記在實際育種中的應用

分子標記輔助育種為目前重要的育種手段, 因此本實驗擬利用獲得的抗咪草煙標記用于實際育種,驗證其利用價值, 鑒于RM7413距離靶基因最近, 因此選其為目的標記。以金粳818為供體, 南粳9108為受體, 雜交組配收獲F1, F1自交獲得F2群體。選取F2個體50株, 利用標記RM7413(F: 5￠-GTCTGG TTGGCAGCTCTCTC-3￠; R: 5￠-CGACACACATCCA CGCAC-3￠)分析單株基因型, 選擇與抗性親本金粳818帶型完全一致的單株, 選擇的單株連續(xù)自交并通過表型及標記選擇, 在F7獲得穩(wěn)定材料。為驗證標記在抗咪草煙輔助育種中的可行性, 對F7群體進行表型分析, 同時對隨機個體進行基因型鑒定, 結(jié)果表明F7植株在咪草煙處理下全部存活且生長良好,利用標記RM7413隨機鑒定的10株苗均呈現(xiàn)與抗性親本金粳818完全一致的帶型(圖5)。上述結(jié)果表明, SSR分子標記RM7413能夠輔助選育抗咪草煙粳稻新品種。

若標記RM7413在常規(guī)粳稻及金粳818中存在多態(tài), 則該標記可用于常規(guī)粳稻的除草劑抗性改良。本試驗選取91份近年來在長江中下游推廣的主要粳稻品種進行多態(tài)性鑒定。鑒定結(jié)果如圖6所示, 91份推廣品種均與金粳818存在多態(tài)性, 表明分子標記RM7413在長江中下游常規(guī)粳稻抗咪草煙改良中具有非常大的應用潛力。

圖1 抗咪草煙水稻和咪草煙敏感水稻的表型

R: 抗咪草煙水稻金粳818; S: 感咪草煙水稻蘇墾118。

R: imazethapyr-resistant rice Jinjing 818; S: imazethapyr-sensitive rice Suken 118.

圖2 親本金粳818、蘇墾118和F2群體中咪草煙抗性及感性苗表型

R: 抗咪草煙幼苗; S: 感咪草煙幼苗。

R: imazethapyr-resistant seedlings; S: imazethapyr-sensitive seedlings.

3 討論

長江中下游粳稻生產(chǎn)方式近年來向機械化、輕簡化、規(guī)模化方向發(fā)展, 直播稻面積逐年擴大, 伴隨直播的雜草稻危害也日趨嚴重, 本試驗鑒定獲得的抗咪草煙粳稻品種金粳818為直播稻田雜草稻防除提供了基因資源, 同時豐富了作物抗除草劑類型, 降低了單一使用草甘膦等除草劑的生態(tài)風險[17]。

長江中下游地區(qū)是我國粳稻主要生產(chǎn)區(qū)之一, 然而在由于育種過程中長期依賴于少數(shù)核心親本, 導致江蘇地區(qū)粳稻間親緣關(guān)系較近, 遺傳相似性較高[18-19]; 另有分析表明黑龍江、寧夏地區(qū), 甚至全國范圍內(nèi)的粳稻材料同樣存在該現(xiàn)象[20-22]; Viviana等[23]對智利的249份粳稻分析表明馴化瓶頸導致粳稻遺傳多樣性較低。這些研究都表明同一生態(tài)區(qū)粳稻遺傳背景相近, 因此在開展粳-粳雜交品種后代的分子標記輔助選擇育種中, 可用的多態(tài)性分子標記較少。本試驗發(fā)現(xiàn)金粳818的咪草煙抗性與RM7413緊密連鎖, 該標記與長江中下游主要推廣的粳稻品種間存在多態(tài)性, 為長江中下游粳稻的抗咪草煙分子育種奠定了基礎(chǔ)。

自1996年轉(zhuǎn)基因作物正式商品化以來, 轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛應用于作物育種, 性狀涉及抗除草劑、抗蟲、抗干旱等, 其中在抗除草劑相關(guān)領(lǐng)域最為成功[24], 但轉(zhuǎn)基因作物一直存在較大的爭議使其不能夠被廣泛接受, 同時通過傳統(tǒng)育種手段獲得的抗除草劑作物極少, 導致中國在抗除草劑作物育種方面存在較大的空白。本試驗結(jié)果證明粳稻資源金粳818與連鎖標記RM7413能夠用于抗咪草煙粳稻常規(guī)育種, 可極大簡化育種過程, 為中國抗除草劑作物育種奠定基礎(chǔ)。

圖3 SSR標記RM7326、RM7413、RM7426、RM5221在咪草煙敏感植株中的基因型(部分圖)

1: 抗性對照金粳818的基因型; 2: 敏感對照蘇墾118的基因型; 其余為咪草煙敏感植株中基因型。

1: the genotype of Jinjing 818; 2: the genotype of Suken 118; others are the genotype of imazethapyr-sensitive seedlings.

圖4 抗咪草煙基因的標記連鎖圖

圖5 SSR標記RM7413在F7的隨機10個個體中的基因型

1: 抗性對照金粳818的基因型; 2: 敏感對照南粳9108的基因型; M: DNA marker; 3~12: 10個隨機個體的基因型。

1: the genotype of Jinjing 818; 2: the genotype of Nanjing 9108; M: DNA marker; 3-12: the genotype of ten seedlings.

圖6 SSR標記RM7413在常規(guī)粳稻中的基因型(部分圖)

1: 抗性對照金粳818的基因型; 2: 敏感對照蘇墾118的基因型; M: DNA marker; 其余為常規(guī)粳稻的基因型。

1: the genotype of Jinjing 818; 2: the genotype of Suken 118; M: DNA marker; others are the genotype of conventionalrice.

4 結(jié)論

金粳818抗咪草煙特性是由單基因控制的顯性性狀, 初步確定乙酰乳酸合酶基因()的突變是金粳818產(chǎn)生抗性的主要原因。篩選獲得的SSR分子標記RM7413與抗性基因緊密連鎖, 該標記與金粳818在抗咪草煙粳稻新品種的選育中應用潛力巨大。

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Genetic Analysis of Imazethapyr Resistance in Rice and the Closely Linked Marker Selection and Application

FEI Yun-Yan1, YANG Jie1,2,*, FAN Fang-Jun1,2, WANG Fang-Quan1,2, LI Wen-Qi1,2, WANG Jun1,2, ZHU Jin-Yan1,2, and ZHONG Wei-Gong1,2

1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops / Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Cultivation and extension of herbicide-resistant rice can increase the efficiency of weed control and obtain great economic benefits. Here, Jinjing 818 was identified as an imazethapyr-resistant line, F2population from the cross between Jinjing 818 and the conventionalrice Suken 118 was used for genetic analysis and gene mapping of the imazethapyr resistance in rice. The imazethapyr resistance in Jinjing 818 was controlled by a single dominant nuclear gene located between SSR markers RM7413 and RM7426 on the chromosome 2. Through gene-predicting and sequencing in this region, we found that the target gene of imazethapyr, acetolactate synthase gene (), had a nucleotide mutation (G mutated into A) in its coding region, leading to the mutation of serine into asparagine. It could be preliminarily deduced thatis the candidate gene for imazethapyr resistance. The physical distances between RM7413, RM7426 andwere 165 kb, 1612 kb, respectively. Jinjing 818 and Nanjing 9108 were used as parents to detect the application potential of RM7413 in molecular marker assisted selection breeding (MAS). On the basis of selecting phenotype and RM7413 in the hybrid and its selfing generation, F7population showed stable imazethapyr resistance, indicating that the great application potential of RM7413 in MAS and breeding for imazethapyr resistant rice. Our results will lay a foundation for breeding herbicide-resistantrice by MAS.

subsp. Keng; Molecular marker assisted selection; RM7413; Jinjing 818; Imazethapyr

2017-07-06;

2018-01-08;

2018-01-23.

10.3724/SP.J.1006.2018.00716

本項目由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0100403), 江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點研發(fā)項目(BE2015355), 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院探索性項目(ZX(17)2014)和江蘇省自然科學基金項目(BK20171326)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program (2017YFD0100403), the Jiangsu Province Key Research and Development Program (Modern Agriculture) (BE2015355), the Exploratory Project of the Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (ZX(17)2014), and the Project of Jiangsu Province Natural Science Foundation (BK20171326).

楊杰, E-mail: yangjie168@aliyun.com

E-mail: suiyiyixinyisi@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180122.1429.034.html