汪洲濤 游 倩 高世武 王春風(fēng) 李 竹 馬晶晶 闕友雄 許莉萍 羅 俊

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甘蔗品種的AFLP和SSR標(biāo)記鑒定及其應(yīng)用

汪洲濤 游 倩 高世武 王春風(fēng) 李 竹 馬晶晶 闕友雄 許莉萍 羅 俊*

福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002

品種遺傳多樣性和指紋圖譜是育種、品種權(quán)保護(hù)和新品種推廣等工作的重要參考和依據(jù)。本研究選用38個(gè)來自國(guó)家甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)的甘蔗新品種(系), 以9對(duì)AFLP標(biāo)記擴(kuò)增出348個(gè)位點(diǎn), 多態(tài)性位點(diǎn)248個(gè), 多態(tài)性比率為72.26%; 15對(duì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增出180個(gè)位點(diǎn), 多態(tài)性位點(diǎn)176個(gè), 多態(tài)性比率為97.78%。38個(gè)新品種(系)的遺傳相似系數(shù)分布在0.668~0.847之間, 其箱線圖分布特征顯示, 其中的FN、MT、YZ、YG、GT等系列品種(系)遺傳基礎(chǔ)相似。通過UPGMA聚類表明, 可在遺傳相似系數(shù)為0.732處將38個(gè)甘蔗新品種(系)劃分為2個(gè)群體, 其中福農(nóng)09-2201和桂糖06-1492作為一個(gè)子群體最先被劃分出來, 它們?cè)谌后w中的異質(zhì)性較強(qiáng); 另外, 在遺傳相似性系數(shù)為0.770處劃分出一個(gè)子群體a, 其中包含參照品種ROC22、福農(nóng)07-3206、福農(nóng)40、海蔗22、桂糖09-12、柳城07-150等品種(系)。ROC22具有廣適應(yīng)性和高產(chǎn)高糖等優(yōu)良特性, 子群體a中的另外幾個(gè)品種(系)則更有可能擁有這些特性, 具有更高的推廣潛力。本研究選擇60個(gè)SSR位點(diǎn)構(gòu)建了38個(gè)甘蔗新品種(系)的指紋圖譜, 對(duì)品種鑒定及品種權(quán)的保護(hù)具有重要作用, 可望直接應(yīng)用于指導(dǎo)甘蔗種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)價(jià)和分子指紋圖譜鑒定, 并將為這些品種(系)推廣布局或作為雜交親本利用提供參考和借鑒。

甘蔗; 分子標(biāo)記; 種質(zhì)鑒定; 群體劃分; 推廣布局

受人口增長(zhǎng)、物質(zhì)消費(fèi)水平提高、氣候變化、城市化侵占耕地和老齡化導(dǎo)致勞動(dòng)力短缺等因素促使, 糧食安全與能源安全早已成為人類面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1-4]。甘蔗是最主要的糖料作物和重要的能源作物, 其需求量不斷增長(zhǎng)[5-6], 在耕地面積限制的情況下, 需要不斷育成新的優(yōu)良品種來提高甘蔗的產(chǎn)量。從水稻、玉米等糧食作物的生產(chǎn)發(fā)展過程可以看出, 糧食產(chǎn)量的每次重大提升都得益于關(guān)鍵種質(zhì)資源的發(fā)掘與利用, 種質(zhì)資源及其高效利用十分重要[7-8]。甘蔗種質(zhì)資源十分豐富, 在我國(guó)云南國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃中, 保育近2200份, 美國(guó)和印度的世界甘蔗種質(zhì)收集中心保育的分別為近6000和4000多份。如此龐大的種質(zhì)資源群體蘊(yùn)含著巨大的基因潛質(zhì), 對(duì)其鑒定和評(píng)價(jià)是育種工作的重要基礎(chǔ)。形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記等是近些年被廣泛使用的植物種質(zhì)資源鑒定方法, 在甘蔗種質(zhì)鑒定工作中也發(fā)揮著重要作用[9-12]。如Praveen等[13]在2015年報(bào)道了SGDB (Sugarcane Germplasm Database), 該數(shù)據(jù)庫便是根據(jù)形態(tài)特征、農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀、抗病蟲性等信息鑒定劃分甘蔗種質(zhì)資源的, 這些信息很大程度上提高了育種親本的選擇效率。在我國(guó), 自“九五”以來, 育種工作者也主要應(yīng)用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)或生理生化等方法完成了大量甘蔗種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)工作, 獲得一批優(yōu)良特異的甘蔗種質(zhì)[14]。這些鑒定工作對(duì)育種工作具有重要的實(shí)用價(jià)值, 不過這些方法也均存在較多的局限性, 如易受環(huán)境和植物生育時(shí)期影響、標(biāo)記的位點(diǎn)有限等, 其鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較差。DNA分子標(biāo)記技術(shù)從基因水平尋找生物個(gè)體間的遺傳差異, 不受環(huán)境等因素的干擾, 并且標(biāo)記位點(diǎn)豐富[15]。目前, DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為鑒定和評(píng)價(jià)農(nóng)作物種質(zhì)資源最主要的方法, 得到廣泛應(yīng)用[16-18]。

在甘蔗種質(zhì)資源的分子標(biāo)記技術(shù)鑒定和評(píng)價(jià)等工作中, 目前主要涉及的標(biāo)記技術(shù)有AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)[19]、SSR (Simple Sequence Repeat)[20]、SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)[21]和ISSR (Inter-simple Sequence Repeat)[22]等。AFLP和SSR標(biāo)記相對(duì)于其他DNA分子標(biāo)記, 具備檢測(cè)成本低、多態(tài)性位點(diǎn)豐富、在植物基因組中分布廣泛且均勻等優(yōu)點(diǎn), 已被眾多學(xué)者深入討論[23-26]。利用AFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記開展甘蔗種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究已有諸多報(bào)道, 如劉新龍等[27]運(yùn)用AFLP標(biāo)記技術(shù)研究了41份甘蔗近緣屬植物滇蔗茅()無性系, 發(fā)現(xiàn)滇蔗茅的遺傳多樣性與地理分布有著明顯的關(guān)系; Lima等[28]將基于AFLP標(biāo)記獲取的79個(gè)甘蔗品種的遺傳相似系數(shù)對(duì)比甘蔗品種的系譜關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn), 前者能比后者提供更多的甘蔗品種間血緣的信息。這與先前Barret等[29]比較AFLP標(biāo)記法和系譜法評(píng)價(jià)小麥遺傳多樣性效用的研究結(jié)論一致; Singh等[30]對(duì)印度亞熱帶地區(qū)割手密和商業(yè)種的SSR標(biāo)記鑒定顯示, 割手密的變異水平遠(yuǎn)高于商業(yè)種, 而這些高變異的割手密材料并未有效應(yīng)用于甘蔗育種中, 該結(jié)果為目前甘蔗育種親本的開拓提供了方向; 齊永文等[31]運(yùn)用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)中美甘蔗品種的遺傳距離評(píng)估表明, 中美種質(zhì)間遺傳基礎(chǔ)差異較明顯, 我們不僅要注重美國(guó)種質(zhì)的引進(jìn), 也要重視中國(guó)種質(zhì)的發(fā)掘利用, 協(xié)同拓寬中國(guó)甘蔗品種的遺傳基礎(chǔ)。另外, 利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建甘蔗指紋身份證或指紋圖譜也有諸多報(bào)道, 如劉新龍等[32]通過篩選多態(tài)性豐富、品種聚類區(qū)分率高、易統(tǒng)計(jì)的引物組成核心引物, 構(gòu)建了云南自育的27個(gè)品種與10個(gè)蔗區(qū)主栽品種的分子身份證, 為品種間的區(qū)分提供了精準(zhǔn)快捷的依據(jù); 姚春雪等[33]利用SSR標(biāo)記研究崖城89-9和昆明蔗茅及其67份雜交后代(F1、BC1和BC2)材料, 構(gòu)建各份材料的DNA指紋圖譜, 為追蹤蔗茅野生種血緣在不同世代中的傳遞情況及其在甘蔗育種中的進(jìn)一步利用提供科學(xué)依據(jù)。

農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)是新育成品系正式成為推廣品種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[34]。目前, 新品種推廣主要依據(jù)AMMI模型或GGE-Biplot分析生成的新品種豐產(chǎn)性、穩(wěn)定性和適應(yīng)性等指標(biāo)[35-36], 還未見從分子水平為甘蔗新品種推廣布局提供建議的報(bào)道。本研究主要應(yīng)用9個(gè)AFLP和15個(gè)SSR標(biāo)記分析來自三輪國(guó)家甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)(以下簡(jiǎn)稱“區(qū)試”)的參試品種的遺傳多樣性并繪制SSR標(biāo)記指紋圖譜, 同時(shí)從分子水平的分析結(jié)果出發(fā)討論甘蔗新品種的推廣布局策略。本研究可以讓我們了解38個(gè)新育成甘蔗栽培品種(系)的共祖度(遺傳背景相似度), 從而間接評(píng)估目前甘蔗育種所用親本的遺傳基礎(chǔ); 區(qū)試品種(系)也是種質(zhì)資源的重要部分, 今后可作為育種親本的選用對(duì)象, 研究結(jié)果對(duì)今后育種的親本選擇有一定的參考價(jià)值; 同時(shí), 本研究嘗試從實(shí)際的品種推廣工作出發(fā), 從分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的角度, 討論新品種(系)可能的推廣策略, 為區(qū)試品種的推廣工作提供參考; 通過品種(系)指紋圖譜的繪制, 為品種身份鑒別及品種權(quán)保護(hù)等工作提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及其DNA提取

38個(gè)供試甘蔗新品種(系)(附表1)由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。其中10個(gè)來自第10輪區(qū)試, 10個(gè)來自第11輪區(qū)試, 17個(gè)來自第12輪區(qū)試, 以及參照品種ROC22 (全國(guó)推廣面積最大的品種), 均屬于栽培種。在福建農(nóng)林大學(xué)大學(xué)城試驗(yàn)基地種植所有材料, 在甘蔗分蘗期選取每個(gè)品種(系) 3片無病蟲健康完全展開葉片, 用保鮮袋包裝后帶回實(shí)驗(yàn)室, 液氮速凍后置–80℃低溫冰箱保存, 用于提取DNA樣品。使用天根DNA提取試劑盒提取甘蔗基因組DNA, Synergy HT多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)DNA質(zhì)量, 選擇1.8

1.2 AFLP標(biāo)記

對(duì)Vos等[19]建立的AFLP標(biāo)記方法進(jìn)行部分調(diào)整優(yōu)化, 以9對(duì)多態(tài)性良好、擴(kuò)增條帶清晰的AFLP引物組合(表1)掃描38個(gè)甘蔗新品種(系)基因組。甘蔗基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶I和R I在37℃水浴酶切10 h; 酶切產(chǎn)物在37℃水浴連接特定的I和R I接頭, 反應(yīng)時(shí)間為2 h, 將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍后作為預(yù)擴(kuò)增模板; 使用含有1個(gè)選擇性核苷酸的I和R I的引物在反應(yīng)條件為94℃ 30 s, 56℃ 60 s, 72℃ 60 s, 20個(gè)循環(huán)下預(yù)擴(kuò)增, 將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍作為選擇性擴(kuò)增的模板; 以含3個(gè)選擇性核苷酸的I和R I引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增, PCR條件分為3個(gè)階段, 第1階段94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s, 1個(gè)循環(huán); 第2階段94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s, 12個(gè)循環(huán), 從第2個(gè)循環(huán)開始退火溫度每循環(huán)降低0.7℃; 第3階段以94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 60 s, 23個(gè)循環(huán)結(jié)束。

表1 9對(duì)AFLP標(biāo)記引物組合

1.3 SSR標(biāo)記

表2中, 15對(duì)SSR引物由兩個(gè)主要途徑獲取, 一是根據(jù)潘永保等[37-39]從國(guó)際微衛(wèi)星標(biāo)記聯(lián)盟設(shè)計(jì)的221對(duì)引物篩選出的21對(duì)應(yīng)用于甘蔗研究的引物中, 選擇7對(duì)(編號(hào)1~7)多態(tài)性好的引物; 二是根據(jù)閆學(xué)兵等[40]從National Center for Biotechnology Information網(wǎng)站下載的EST序列設(shè)計(jì)篩選的26對(duì)EST-SSR引物中選擇8對(duì)(編號(hào)8~15)多態(tài)性好的引物。將15對(duì)SSR引物和38個(gè)甘蔗DNA樣品送到北京閱微基因有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Microsoft Excel 2016軟件將變性聚丙烯酰胺電泳結(jié)果和毛細(xì)管電泳結(jié)果都統(tǒng)計(jì)成0/1矩陣格式。SSR標(biāo)記的電泳結(jié)果以吸收峰的形式表示, 參考Cordeiro等[41]的指紋數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方式, 在某位點(diǎn)出現(xiàn)吸收峰記“1”, 未出現(xiàn)記“0”, 統(tǒng)計(jì)范圍為100~350 bp; 對(duì)AFLP標(biāo)記使用“參考線法”記帶, 即在電泳圖上從下到上逐步移動(dòng)參考線, 當(dāng)遇到條帶立即停止, 所停止位置記為一個(gè)位點(diǎn), 在該位點(diǎn)參考線上出現(xiàn)條帶的品種即在其相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)單元格記“1”, 未出現(xiàn)記“0”, 統(tǒng)計(jì)范圍為1~500 bp。

表2 15對(duì)SSR標(biāo)記引物

在數(shù)據(jù)分析與可視化上, 使用NTSYS 2.10e和PowerMarker V3.25軟件計(jì)算各品種間的遺傳相似性系數(shù)[42]、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)以及引物多態(tài)信息含量(Polymorphism Information Content, PIC)[43], 并使用基于Nei氏遺傳距離的非加權(quán)類平均法(UPGMA)繪制聚類圖。

式中,M表示2個(gè)品種共有的條帶數(shù),M+M表示兩個(gè)品種一共被擴(kuò)增出來的條帶數(shù);P和P分別為第個(gè)和第個(gè)等位基因頻率,為等位基因數(shù)。使用R3.3.3繪制遺傳相似性系數(shù)分布箱線圖和甘蔗品種(系)的指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP標(biāo)記與SSR標(biāo)記電泳結(jié)果

從圖1可以清晰地辨識(shí)1~500 bp (統(tǒng)計(jì)區(qū))內(nèi)出現(xiàn)的變異位點(diǎn)。用AFLP標(biāo)記的9對(duì)引物組合共擴(kuò)增出348個(gè)位點(diǎn), 多態(tài)性位點(diǎn)有248個(gè), 多態(tài)性比率為71.26%。

圖2中每個(gè)吸收峰代表1個(gè)擴(kuò)增片段, 共5個(gè)擴(kuò)增片段, 吸收峰所在X軸位置顯示了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度, 具體數(shù)值標(biāo)明在吸收峰的底部; Y軸代表擴(kuò)增片段的濃度, 由吸收峰的高度決定。用SSR標(biāo)記的15對(duì)引物共擴(kuò)增出180個(gè)位點(diǎn), 多態(tài)性位點(diǎn)有176個(gè), 多態(tài)性比率達(dá)到92.78%。

2.2 引物的有效性

由表3可知, SSR標(biāo)記中每對(duì)引物的多態(tài)性條帶的比率都處于很高水平, 12對(duì)引物達(dá)到100%, 其中多態(tài)性條帶的比率最低的引物SMC334BS也達(dá)到83.33%, 表明15對(duì)SSR的引物的多態(tài)性良好, 鑒別品種間遺傳差異的能力較高。另外, 各引物的平均PIC值達(dá)到0.920, 引物SEP84的PIC值最低, 為0.695。組合2的擴(kuò)增片段多態(tài)性較差, 低于60%。PIC值平均水平達(dá)到0.971, 且各個(gè)引物間的PIC值相差很小。在總體統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)上, 可看出SSR標(biāo)記和AFLP標(biāo)記的效用都達(dá)到較高水平, 彼此相當(dāng)。

2.3 遺傳相似性系數(shù)的分布特征

從圖3可以看出, 著色部分為箱體, 箱體的上邊框稱為第三四分位數(shù)(Third Quartile), 下邊框稱為第一四分位數(shù)(First Quartile), 箱體內(nèi)部靠近中部的線為中位數(shù)線(Median), 整個(gè)箱體部分表示數(shù)據(jù)的主要集中趨勢(shì)。圖中總體(ALL) 38個(gè)甘蔗新品種(系)和各系列(FN、MT、YZ、YG和GT)甘蔗品種(系)內(nèi)部的遺傳相似性系數(shù)都向0.725~0.770集中。虛線軸的最頂部為上限值(upper extreme), 最底部為下限值(lower extreme), 上下限值之間的范圍就代表整個(gè)相似性系數(shù)的分布范圍[44-45], 6組數(shù)據(jù)的分布范圍都在0.680~0.830之間。FN系列品種(系)相似度水平的集中趨勢(shì)和YZ系列接近, 并且與38個(gè)甘蔗品種總體的相似水平集中趨勢(shì)接近; 另外, GT系列品種(系)的相似系數(shù)集中區(qū)域低于其他幾個(gè)系列的品種, YG系列品種(系)的相似系數(shù)集中區(qū)域高于其他幾個(gè)系列的品種。

圖1 AFLP標(biāo)記聚丙烯酰胺電泳圖

圖2 SSR標(biāo)記毛細(xì)管電泳圖

表3 24對(duì)引物的高效性評(píng)價(jià)

(續(xù)表3)

ALL系列和FN系列品種(系)的箱線圖上下邊緣外存在異常值(黑色實(shí)心小圓點(diǎn), Outlier), 異常值代表該組品種內(nèi)部存在遺傳距離很近(異常值處于上限值上部)或很遠(yuǎn)(異常值處于下限值下部)的極端情況(相對(duì)于本組數(shù)據(jù)而言), 這是表現(xiàn)相似系數(shù)分布特征的重要方面。在總體品種中(ALL), 因?yàn)槠贩N數(shù)量多, 出現(xiàn)高相似組合或低相似組合的可能性更大, 也因此比FN系列出現(xiàn)了更多異常值。箱線圖在比較不同群體的遺傳相似系數(shù)的分布范圍時(shí)具有較強(qiáng)的簡(jiǎn)明性, 同時(shí)各個(gè)群體的遺傳相似系數(shù)的分布特征也能得到很好的體現(xiàn)(圖3)。

圖3 遺傳相似性系數(shù)的分布特征

縮寫同附表1。The abbreviations are the same as those given in Supplementary table 1.

2.4 聚類分析

從圖4可以看出, 38個(gè)甘蔗新品種(系)遺傳基礎(chǔ)較為狹窄, 彼此間遺傳距離接近。在遺傳相似性系數(shù)為0.732處可將38個(gè)甘蔗品種(系)分為A、B兩個(gè)群體。群體A包含4 (福農(nóng)09-2201)和32 (桂糖06-1492)兩個(gè)品種(系), 這2個(gè)品種(系)最先被劃分出來, 說明它們?cè)谡麄€(gè)群體中異質(zhì)性較強(qiáng); 群體B包含剩下的36個(gè)品種(系)。在相似性系數(shù)為0.770處分割群體B, 可獲得一個(gè)小的子群體a, 該子群體含有參照品種38 (ROC22)、2 (福農(nóng)07-3206)、3 (福農(nóng)40)、29 (海蔗22)、33 (桂糖09-12)和35 (柳城07-150), 說明這些品種(系)與參照品種ROC22同質(zhì)性較高。從附表1可知, 29 (海蔗22)和35 (柳城07-150)的親本中包含品種ROC22, 但2 (福農(nóng)07-3206)、3 (福農(nóng)40)和33 (桂糖09-12)的親本不包括品種ROC22。以不同的遺傳相似系數(shù)水平劃分38個(gè)甘蔗品種的群體可以得到不同的子群體或不同的劃分類型, 在不同群體間或類型間選擇親本搭配的組合, 其血緣關(guān)系的同質(zhì)性相對(duì)于同一群體內(nèi)或同一劃分類型內(nèi)的品種(系)組合會(huì)相對(duì)減小, 因此更有可能選育出優(yōu)良品種。

圖4 38份甘蔗品種(系)的聚類分析

2.5 主成分分析

從圖5可以看出, MT系列、YZ系列和DZ系列甘蔗品種集中水平較高, 它們主要分布在主成分C中, 說明福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所、云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所、云南德宏州甘蔗科學(xué)研究所選用的甘蔗育種親本具有較高的同質(zhì)性, 也可能是育種者選擇親本時(shí)具有一定的偏好性。FN系列品種(系)分布在主成分A、C和D中, YG系列分布在B和C中, GT系列分布在B、C和D中, 它們的分散范圍較廣, 說明福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所、廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選用親本的遺傳范圍較廣, 育種者親本的選擇偏好性不強(qiáng)?？傮w來看, 各系列品種(系)的主成分區(qū)域都彼此靠近, 有些具有部分重合甚至完全重合, 可推測(cè)各個(gè)育種單位所選用的育種親本的遺傳背景接近, 不存在明顯的差異性或者選擇的偏向性。我們也可以依據(jù)圖5進(jìn)行親本的選擇, 依據(jù)分布距離與血緣同質(zhì)性的關(guān)系, 圖中距離較遠(yuǎn)(或分布于不同主成分中)的品種(系)都將是較為理想的親本組合。

圖5 38個(gè)甘蔗新品種(系)二維主成分分析

縮寫同附表1。The abbreviations are the same as those given in Supplementary table 1.

2.6 甘蔗品種(系)指紋圖譜繪制

從圖6可以看出, 該圖譜的指紋分布均勻, 并且品種(系)間都具有較為明顯的差異, 說明構(gòu)建圖譜的位點(diǎn)選擇恰當(dāng), 圖譜的區(qū)分力度強(qiáng)。

3 討論

利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定種質(zhì)資源遺傳多樣性, 首先需要考慮標(biāo)記方法和引物的選擇問題。Creste等[46]對(duì)AFLP、SSR和TRAP鑒定的82個(gè)甘蔗品種遺傳系數(shù)分布結(jié)果比較發(fā)現(xiàn), 3種標(biāo)記鑒定的遺傳系數(shù)分布特征不同, 它們各有自己的正態(tài)分布區(qū)域, SSR標(biāo)記對(duì)整體品種親緣關(guān)系的鑒定效率最高, 而AFLP標(biāo)記更擅長(zhǎng)于親緣關(guān)系相近甘蔗品種的鑒別, 這告訴我們分子標(biāo)記的選擇需要從研究目的考慮, 每種標(biāo)記方法有其自身的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。Mohamed等[47]通過對(duì)比SSR、SRAP和CAPS-SNP標(biāo)記對(duì)柑橘品種多樣性的鑒定結(jié)果, 也指出不同的標(biāo)記各有優(yōu)缺點(diǎn), 并提出不同標(biāo)記的結(jié)合使用對(duì)柑橘品種多樣性的研究更為客觀。位點(diǎn)信息量是影響分子標(biāo)記技術(shù)鑒定結(jié)果穩(wěn)定性最主要的因素, 其次是引物數(shù)量。對(duì)引物位點(diǎn)信息量和數(shù)量的評(píng)價(jià)可以預(yù)估分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[48], 所用引物的多態(tài)信息含量高、數(shù)量足, 得到的品種指紋信息更加豐富, 由此深入探討的結(jié)果才更加可信。本研究的38個(gè)甘蔗新品種(系)的遺傳背景接近, 將AFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記結(jié)合使用, 在保證足夠的引物數(shù)量的同時(shí), 也可以結(jié)合兩種標(biāo)記優(yōu)勢(shì), 減少單分子標(biāo)記鑒定的誤差。另外, 15對(duì)SSR和9對(duì)AFLP引物組合的位點(diǎn)信息量高, 由此得到的甘蔗品種DNA指紋數(shù)據(jù)為后續(xù)的分析提供了可靠基礎(chǔ)。

本研究首次使用箱線圖分析各個(gè)品種(系)間的遺傳相似性系數(shù), 根據(jù)其分布特征判斷和比較38個(gè)甘蔗新品種(系)以及各個(gè)系列甘蔗品種(系)的遺傳基礎(chǔ)。另外, 我們所擁有的種質(zhì)資源群體越大, 越有可能找到極高或極低遺傳差異的不同品種(系)組合, 這一點(diǎn)體現(xiàn)在箱線圖的箱體寬度與異常值數(shù)量的關(guān)系上。38個(gè)甘蔗新品種(系)間相似度集中在0.725~0.780的水平, 說明第10、第11和第12輪甘蔗區(qū)試品種(系)遺傳背景相似度都較高, 親本的共祖度較高, 這也一定程度解釋了為什么近些年來難有特別優(yōu)異的新品種出現(xiàn)。在甘蔗生產(chǎn)中品種的單一化問題日漸嚴(yán)重, ROC系列品種在中國(guó)的種植面積超過80%, 種植時(shí)間已有20余年, 種質(zhì)退化和減產(chǎn)等問題日益突出, 急需新的優(yōu)良品種更新?lián)Q代[49]。

親本選擇是育種的主要步驟, 親本高效鑒定是雜交育種的基礎(chǔ)工作, 對(duì)親本的選擇具有重要的指導(dǎo)作用[50-51]。育種中選擇具有一定的遺傳差異的種質(zhì)資源作親本, 可以提高雜種一代基因型的雜合性。對(duì)作物種質(zhì)資源的遺傳距離評(píng)估有利于鑒定和組合最佳親本, 以產(chǎn)生遺傳變異最大的子代群體和促進(jìn)不同種質(zhì)資源的優(yōu)良基因滲透到新選育品系中,達(dá)到獲取理想雜種優(yōu)勢(shì)的目的[51-52]。前人研究表明, 親本的遺傳距離與F1的雜種優(yōu)勢(shì)呈正相關(guān), 據(jù)此可以預(yù)先評(píng)估新育品系的雜種優(yōu)勢(shì)[53]。本研究的聚類分析中, 4 (福農(nóng)09-2201)和32 (桂糖06-1492)最先被劃分出來, 說明它們與剩下的36個(gè)品種(系)存在較大遺傳差異, 在群體中的異質(zhì)性最強(qiáng), 育種工作中可作為重點(diǎn)選用材料。

圖6 38份甘蔗品種(系)的指紋圖譜

Y軸方向的左邊代表高特異性的擴(kuò)增位點(diǎn)名(共60個(gè)位點(diǎn), 位點(diǎn)名的前半部分是引物名, 后半部分是擴(kuò)增片段長(zhǎng)度, 全部選自SSR標(biāo)記的擴(kuò)增位點(diǎn)), X軸頂部代表各品種(系); 黑色或深灰色(方便相鄰2個(gè)品種間的區(qū)分)的長(zhǎng)方格子代表某品種(系)在該位點(diǎn)處有條帶, 白色表示沒有。

On the left of the Y-axis direction, 60 names of amplification loci with high specificity were listed (Those loci came from the SSR mark. The first half of the locus name is the primer name, and another half corresponds to the length of the amplified fragment). The serial numbers of the varieties (lines) were enumerated on the top of the X-axis direction. Each black or gray rectangular (distinguishes between adjacent varieties) represents an amplification band, and the white indicates no amplification band.

新品種通過審定(鑒定、認(rèn)定或登記)后如何推廣布局, 豐產(chǎn)性、穩(wěn)定性和地區(qū)適應(yīng)性是首先考慮的幾個(gè)因素, 這些因素可由GGE-biplot與AMMI模型分析[5,34,36,49]; 其次, 根據(jù)基因豐富度對(duì)自然環(huán)境變化適應(yīng)能力的關(guān)系原理, 考慮新品種的遺傳背景因素。遺傳背景過于相似的品種搭配推廣, 對(duì)豐富群體的遺傳多樣性貢獻(xiàn)有限, 不利于品種的多系布局[54], 而遺傳差異大的品種在同一地區(qū)推廣, 可以增加作物群體的基因范圍, 增強(qiáng)其抗病抗逆等潛力。即推廣與某地區(qū)甘蔗主栽品種遺傳差異較大的優(yōu)良甘蔗新品種, 不僅可以提高該地區(qū)甘蔗產(chǎn)量, 也可以在一定程度上增加該地區(qū)甘蔗群體的基因豐富度、增強(qiáng)甘蔗抵抗不良環(huán)境的能力和控制病蟲害流行等[55]。合理分布和推廣這些優(yōu)異新品種, 能使甘蔗生產(chǎn)效益和生產(chǎn)安全性得到顯著提高。在評(píng)估新品種的推廣潛力時(shí), 我們應(yīng)該考慮新育成品種與現(xiàn)有的廣受種植戶認(rèn)可的推廣品種的遺傳相似度, 這種相似度越大, 新品種在適應(yīng)性、高產(chǎn)高糖性上越可能與現(xiàn)有優(yōu)良品種接近, 也越容易受到種植戶的接受而增加推廣的機(jī)會(huì)。在本研究中, 2 (福農(nóng)07-3206)、3 (福農(nóng)40)、29 (海蔗22)、33 (桂糖09-12)和35 (柳城07-150)的遺傳背景跟ROC22接近, 與ROC22聚到非常小的子群中的品種(系), 大多含有ROC22的血緣, 遺傳了ROC22的廣適應(yīng)性特性, 產(chǎn)量品質(zhì)與ROC22相當(dāng)或優(yōu)于ROC22, 具有被大面積推廣的潛質(zhì)。關(guān)于新品種推廣或布局的建議和討論, 主要是從遺傳多樣性的角度出發(fā), 在實(shí)際的推廣中還需要結(jié)合區(qū)域試驗(yàn)結(jié)果、抗病性表現(xiàn)和遺傳系譜圖等信息綜合考慮。在2 (福農(nóng)07-3206)、3 (福農(nóng)40)、29 (海蔗22)、33 (桂糖09-12)、35 (柳城07-150)等幾個(gè)品種(系)中, 2 (福農(nóng)07-3206)、3 (福農(nóng)40)和33 (桂糖09-12)的親本不包括ROC22, 但是它們?cè)谟H緣關(guān)系上比10 (閩糖07-2005)、26 (粵甘47)、36 (柳城07-506)等親本組合中包含ROC22的品種(系)更接近ROC22, 其原因可能是甘蔗育種中所使用的親本之間具有較強(qiáng)的血緣同質(zhì)性, 具體還要結(jié)合系譜圖進(jìn)一步分析。

在品種權(quán)保護(hù)、種質(zhì)資源管理、種苗銷售和新品種試驗(yàn)等工作中都需要品種(系)真實(shí)性的鑒定, 甘蔗品種(系)指紋圖譜的繪制在規(guī)范品種和種質(zhì)資源管理、規(guī)范甘蔗種苗市場(chǎng)和保護(hù)品種權(quán)益上都有十分重要的作用[32]。

4 結(jié)論

將SSR和AFLP標(biāo)記技術(shù)結(jié)合使用, 在獲取豐富的甘蔗品種(系)指紋信息的同時(shí), 互補(bǔ)了兩種標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)?；谥讣y信息利用箱線圖研究各品種(系)間遺傳相似性系數(shù)分布特征, 可清晰地展現(xiàn)出整個(gè)研究群體遺傳基礎(chǔ)的范圍, 并可從中判斷是否存在親緣關(guān)系很遠(yuǎn)或很近的品種(系)組合。4 (福農(nóng)09-2201)和32 (桂糖06-1492)等異質(zhì)性較強(qiáng)的品種可作為重點(diǎn)利用的育種材料; 根據(jù)參照品種ROC22在聚類圖中的位置, 可判定與其聚集到越小的群體中的品種(系)有較大可能擁有與其相似的田間優(yōu)良性狀(高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、高糖、抗病等), 從而更容易受到種植戶的認(rèn)可而具有更大的推廣潛力。選擇與參照品種異質(zhì)性較強(qiáng)的品種與ROC22同時(shí)推廣, 可一定程度上擴(kuò)大甘蔗種植品種的多樣性, 增強(qiáng)實(shí)際生產(chǎn)中甘蔗群體抵抗不良環(huán)境或病蟲害等能力。本文在研究甘蔗遺傳多樣性的基礎(chǔ)上討論種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)的判定方法、種質(zhì)資源的劃分與利用方法、新品種的推廣策略以及品種指紋圖譜的構(gòu)建與應(yīng)用, 能給甘蔗育種等相關(guān)科研人員提供參考和借鑒。

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附表1 38份來自3輪國(guó)家甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)的品種(系)

Supplementary table 1 Thirty-eight sugarcane varieties (lines) from three rounds of national variety regional testings

編號(hào)No.品種(系)Variety (line)親本組合Parent combination選育單位Breeding institution參試輪次Round系列Series 1福農(nóng)07-2020Funong 07-2020粵糖91-976 × LC 85-384Yuetang 91-976 × LC 85-384福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所SIFAFU10FN 2福農(nóng)07-3206Funong 07-320690-1211 × 77-797福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所SIFAFU10FN 3福農(nóng)40Funong 40福農(nóng)93-3406 × 粵糖91-976Funong 93-3406 × Yuetang 91-976福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所SIFAFU10FN 4福農(nóng)09-2201Funong 09-2201ROC 22 × 桂糖00-122ROC 22 × Guitang 00-122福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所SIFAFU11FN 5福農(nóng)09-7111Funong 09-7111桂糖96-44 × ROC 11Guitang 96-44 × ROC 11福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所SIFAFU11FN 6福農(nóng)09-12206Funong 09-12206CP 65-357 × 崖城97-40CP 65-357 × Yacheng 97-40福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所SIFAFU12FN 7福農(nóng)11-2105Funong 11-2105川蔗89-103 × 云瑞05-770Chuanzhe 89-103 × Yunrui 05-770福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所SIFAFU12FN 8福農(nóng)09-4095Funong 09-4095粵糖93-159 × 云蔗91-790Yuetang 93-159 × Yunzhe 91-790福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所SIFAFU12FN 9閩糖06-1405Mintang 06-1405閩糖92-649 × ROC 10Mintang 92-649 × ROC 10福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIFAAS11MT 10閩糖07-2005Mintang 07-2005崖城73-512 × ROC 22Yacheng 73-512 × ROC 22福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIFAAS12MT 11閩糖09-104Mintang 09-104桂糖90-420 × ROC 10Guitang 90-420 × ROC 10福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIFAAS12MT

(續(xù)附表1)

編號(hào)No.品種(系)Variety (line)親本組合Parent combination選育單位Breeding institution參試輪次Round系列Series 12閩糖02-205Mintang 02-205崖城90-3 × ROC 10Yacheng 90-3 × ROC 10福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIFAAS10MT 13云蔗08-2060Yunzhe 08-2060粵糖93-159 × Q 121Yuetang 93-159 × Q 121云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIYAAS10YZ 14云蔗08-1095Yunzhe 08-1095CP 84 -1198 × 科5CP 84-1198 × Ke5云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIYAAS11YZ 15云蔗09-1028Yunzhe 09-1028云瑞15-178 × 閩糖86-2121Yunrui 15-178 × Mintang 86-2121云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIYAAS12YZ 16云蔗09-1601Yunzhe 09-1601CP 94-1100 × 川糖89-103CP 94-1100 × Chuantang 89-103云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIYAAS12YZ 17云瑞09-315Yunrui 09-315CL 69-52 × 云瑞05-285CL 69-52 × Yunrui 05-285云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIYAAS12YZ 18云瑞07-1433Yunrui 07-1433云瑞99-155 × L 75-20Yunrui 99-155 × L75-20云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIYAAS10YZ 19云瑞10-187Yunrui 10-187ROC 20 × 云瑞05-282ROC20 × Yunrui 05-282云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIYAAS12YZ 20云瑞10-701Yunrui 10-701云瑞08-18 × 云瑞05-704Yunrui 08-18 × Yunrui 05-704云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIYAAS12YZ 21德蔗07-36Dezhe 07-36桂糖92-66 × CP 67-412Guitang 92-66 × CP 67-412云南德宏州甘蔗科學(xué)研究所SRIDY11DZ 22德蔗09-78Dezhe 09-78桂糖94-119 × ROC 10Guitang 94-119 × ROC 10云南德宏州甘蔗科學(xué)研究所SRIDY12DZ 23德蔗09-84Dezhe 09-84桂糖94-119 × ROC 10Guitang 94-119 × ROC 10云南德宏州甘蔗科學(xué)研究所SRIDY12DZ 24粵甘43Yuegan 43粵糖93-213 × 粵糖93-159Yuetang 93-213 × Yuetang 93-159廣州甘蔗糖業(yè)研究所GSIRI10YG 25粵甘46Yuegan 46粵糖00-236 × 桂糖96-211Yuetang 00-236 × Guitang 96-211廣州甘蔗糖業(yè)研究所GSIRI10YG 26粵甘47Yuegan 47粵農(nóng)73-204 × ROC 22Yuenong 73-204 × ROC 22廣州甘蔗糖業(yè)研究所GSIRI11YG 27粵甘48Yuegan 48HOCP 95-988 × 粵糖97-76HOCP 95-988 × Yuetang 97-76廣州甘蔗糖業(yè)研究所GSIRI12YG 28粵甘50Yuegan 50粵糖96-86 × 粵糖99-66Yuetang 96-86 × Yuetang 99-66廣州甘蔗糖業(yè)研究所GSIRI12YG 29海蔗22Haizhe 22粵糖93-159 × ROC 22Yuetang 93-159 × ROC 22廣州甘蔗糖業(yè)研究所GSIRI11YG 30桂糖06-2081Guitang 06-2081桂糖00-122 × 崖城97-47 Guitang 00-122 × Yacheng 97-47廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIGAAS11GT 31桂糖08-1180Guitang 08-1180ROC 26 × ROC 22廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIGAAS11GT 32桂糖06-1492Guitang 06-1492CP 72-1210 × 湛蔗92-126CP 72-1210 × Zhanzhe 92-126廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIGAAS12GT 33桂糖09-12Guitang 09-12ROC 24 × 粵農(nóng)79-780ROC 24 × Yuenong 79-780廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所SRIGAAS12GT

(續(xù)附表1)

編號(hào)No.品種(系)Variety (line)親本組合Parent combination選育單位Breeding institution參試輪次Round系列Series 34柳城07-500Liucheng 07-500粵糖92-1287 × CP 72-1210Yuetang 92-1287 × CP 72-1210柳城縣甘蔗研究中心SRCLC10LC 35柳城07-150Liucheng 07-150粵糖85-177 × ROC 22Yuetang 85-177 × ROC 22柳城縣甘蔗研究中心SRCLC11LC 36柳城07-506Liucheng 07-506粵糖85-177 × ROC 22Yuetang 85-177 × ROC 22柳城縣甘蔗研究中心SRCLC12LC 37贛蔗07-538Ganzhe 07-538ROC 10 × CP 57-614江西省甘蔗研究所SRIJP10GZ 38ROC 22臺(tái)灣糖業(yè)研究所SPRIT參照ROC

FN: 福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所選育的甘蔗品系; MT: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選育甘蔗品系; YZ: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選育的甘蔗品系; DZ: 云南德宏州甘蔗科學(xué)研究所選育的甘蔗品系; YG: 廣州甘蔗糖業(yè)研究所選育的甘蔗品系; GT: 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選育的甘蔗品系; LC: 柳城縣甘蔗研究中心選育的甘蔗品系; GZ: 江西省甘蔗研究所選育的甘蔗品系; ROC: 臺(tái)灣糖業(yè)研究所選育的甘蔗品種。

SIFAFU: Sugarcane Institute, Fujian Agriculture and Forestry University; SRIFAAS: Sugarcane Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences; SRIYAAS: Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences; SRIDY: Sugarcane Research Institute, Dehong, Yunnan Province; GSIRI: Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute; SRIGAAS: Sugarcane Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences; SRCLC: Sugarcane Research Center of Liucheng County; SRIJP: Sugarcane Research Institute of Jiangxi Province; SPRITP: Sugar Processing Research Institute of Taiwan Province. FN: all sugarcane lines bred by SIFAFU; MT: all sugarcane lines bred by SRIFAAS; YZ: all sugarcane lines bred by SRIYAAS; DZ: all sugarcane lines bred by SRIDY; YG: all sugarcane lines bred by GSIRI; GT: all sugarcane lines bred by SRIGAAS; LC: all sugarcane lines bred by SRCLC; GZ: all sugarcane lines bred by SRIJP; ROC: sugarcane variety bred by SPRITP.

Identification of Sugarcane Varieties by AFLP and SSR Markers and Its Application

WANG Zhou-Tao, YOU Qian, GAO Shi-Wu, WANG Chun-Feng, LI Zhu, MA Jing-Jing, QUE You-Xiong, XU Li-Ping, and LUO Jun*

Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

Genetic diversity and fingerprint of varieties are crucial reference for breeding, cultivar right protection and new cultivar extension. We used nine pairs of AFLP markers and 15 pairs of SSR markers to scan 38 new sugarcane varieties (lines) from the national variety regional testings, obtaining abundant fingerprint data. Among the total 348 AFLP bands, 248 were polymorphic, with a polymorphism rate of 72.26 %. In addition, among the total 180 SSR bands, 176 were polymorphic, with a polymorphism rate of 97.78 %. The genetic similarity coefficients of these 38 new varieties (lines) were distributed from 0.668 to 0.847. We explored the distribution characteristics of genetic similarity coefficients using the boxplot, observing the genetic basis of five series (FN, MT, YZ, YG, and GT) of the 38 new sugarcane varieties (lines) was approximately similar. The clustering analysis manifested that these 38 new sugarcane varieties (lines) were divided into two groups at the genetic similarity coefficient of 0.732, with a subgroup including FN09-2201 and GT06-1492 that had high heterogeneity. Moreover, there was a small subgroup containing ROC22 at the genetic similarity coefficient of 0.770. Except for ROC22, the subgroup also contained FN 07-3206, FN 40, HZ 22, GT 09-12, and LC 07-150. ROC22 has wide adaptability, high yield, high sugar content and other excellent characteristics, other varieties (lines) in the same subgroup should be more likely to have these excellent characteristics and higher extention potential. Finally, through selection of 60 efficient amplification sites in the identification of SSR markers, we constructed the fingerprints of these 38 new sugarcane varieties (lines), which should play an important role in variety identification and variety protection. This study is expected to be directly applied to guide the genetic diversity assessment and molecular fingerprinting identification of sugarcane germplasm, and also to provide references for the extention and layout of these varieties or their utilization as hybrid parents.

sugarcane; molecular marker; germplasm identification; group division; variety extension

2017-10-13;

2018-03-15;

2018-03-16.

10.3724/SP.J.1006.2018.00723

本研究由國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-17)和引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃(948計(jì)劃)項(xiàng)目(2014-S18)資助。

This study was supported by China Agriculture Research System (CARS-17) and the Program of Introducing International Super Agricultural Science and Technology (948 Program) (2014-S18).

羅俊, E-mail: sisluojun@126.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180316.0853.004.html