施軍瓊 王亞琴 張?zhí)烊?馬 玲 桑賢春 何光華,*

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水稻黃綠葉基因Yellow-Green Leaf 6 (YGL6)的表達模式與蛋白定位

施軍瓊1,2王亞琴1張?zhí)烊?馬 玲1桑賢春1何光華1,*

1西南大學水稻研究所 / 轉基因植物與安全控制重慶市重點實驗室, 重慶 400716;2西南大學生命科學學院, 重慶 400716

葉色突變既可作為形態(tài)標記用于雜交稻育種, 又是研究光合系統的結構和功能、葉綠素生物合成及其調控機制的理想材料。EMS (ethyl methane sulfonate)誘變秈稻恢復系“縉恢10號”獲得1個穩(wěn)定遺傳的黃綠葉突變體, 暫命名為(。前期我們通過圖位克隆篩選出候選基因, 通過遺傳互補實驗證實了黃綠葉基因為, BLASTp分析表明基因編碼NAD(P)-結合的Rossmann折疊超家族蛋白質, 屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族, 推斷為異黃酮還原酶、糖脫水酶或mRNA結合蛋白。利用qRT-PCR進行表達模式的分析表明基因僅在綠色組織如心葉、成熟葉、葉鞘和綠色穎殼中表達, 尤其以心葉的表達量最高, 同時基因表達還受光照的誘導。構建亞細胞定位載體, 轉水稻原生質體結果表明YGL6蛋白定位于葉綠體。本研究豐富了水稻突變體庫, 為基因的功能分析奠定了基礎。

水稻(); 黃綠葉;基因; 葉綠體; 表達模式

水稻葉色突變是比較常見的, 突變基因往往直接或間接影響葉綠素的合成和降解, 從而影響水稻光合作用, 造成植株減產甚至死亡。近年來, 大量研究結果顯示, 葉色突變體是植物光合作用機制、葉綠素生物合成途徑、葉綠體的結構功能和遺傳發(fā)育調控機理、作物標記性狀等研究的理想材料[1-3]。

水稻葉綠素缺乏突變類型豐富, 目前已鑒定突變體90多個, 除第12染色體外, 其他染色體均發(fā)現了葉綠素缺乏突變基因(http://www.shigen.nig.ac. jp/rice/oryzabaseV4/)。雖然其大部分已被定位, 但僅少數被克隆, 它們分別參與葉綠素的生物合成、降解和葉綠體的發(fā)育[4,5-12]。葉色突變的機制復雜, 除葉綠素代謝和葉綠體發(fā)育引起外, 還有質-核信號轉導途徑受阻[13]、血紅素的反饋調節(jié)紊亂[14]、光敏色素調控受阻[15]、葉綠體蛋白轉運受阻[16]、ATP轉運蛋白基因[17]等其他突變機制。隨著新的水稻葉色突變體的發(fā)現, 葉色突變相關基因的分子機理研究將更加透徹。

葉綠體RNA結合蛋白是一類定位于葉綠體, 參與葉綠體RNA代謝的由核基因編碼的蛋白。葉綠體RNA結合蛋白與細胞核或細胞質中的RNA結合蛋白具有類似的功能, 包括參與RNA的穩(wěn)定和RNA轉錄后的加工過程等。此外, 葉綠體RNA結合蛋白對細胞核與葉綠體之間的信息傳遞和功能協調起重要作用。本研究利用EMS誘變恢復系縉恢10號, 從其后代中獲得一份穩(wěn)定遺傳的黃綠葉突變體, 該突變體葉片在苗期呈黃綠色, 分蘗后期至成熟期轉為淡綠色。圖位克隆及測序結果表明為候選基因, 遺傳互補實驗證實黃綠葉基因為。根據gramene網站(http://www. gramene.org/)提供的信息, YGL6蛋白屬于RNA結合蛋白類, 利用qRT-PCR分析表明基因僅在綠色組織如心葉、成熟葉、葉鞘和綠色穎殼中表達, 并受光照條件的誘導。構建與的融合表達載體轉化水稻原生質體發(fā)現YGL6與GFP的融合蛋白定位于葉綠體, 因此YGL6極有可能是葉綠體中的RNA結合蛋白, 并參與了水稻葉綠體的發(fā)育過程。本研究初步揭示了的基因功能, 為進一步研究奠定了基礎, 并豐富了水稻突變體庫, 深化了當前對葉綠體發(fā)育過程的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃綠葉突變體由EMS誘變縉恢10號 (Jinhui 10)所得, 經多代培養(yǎng)已遺傳穩(wěn)定?？N恢10號是西南大學水稻研究所選育的優(yōu)良秈稻恢復系, 以其作為野生型對照。

1.2 基因組互補載體的設計、構建與轉化

由于pCAMBIA1301上的單酶切位點在基因的基因組DNA序列均存在, 并且擴增片段較長, 則采用重組酶的方法進行。引物6HBF1和6HBR2分別與載體pCAMBIA1301H I和d III酶切后的片段有15 bp的重疊; 引物6HBR1和6HBF2有15 bp的重疊用于連接前后2個擴增片段的重疊片段。引物6HBF1、6HBR2、6HBF2、6HBR1的序列分別為5￠-cggtacccggggatcAACATGGTCAGGCACA GTGATGAGAT-3￠、5￠-AGATAGGAGATGGTAGCAG GAGGCTG-3￠、5￠-TACCATCTCCTATCTCTGACTTC AGTAGTGC-3￠和5￠-GGCCAGTGCCAAGCTGGTC AAGCTCCCTGGTGAGGCTAT-3￠。載體參照Shi等[18]的方法構建與轉化。

1.3 YGL6蛋白的進化分析

參照Ren等[19]的方法分析YGL6蛋白的進化。

1.4 基因表達分析

參照Shi等[18]的方法進行RNA的提取和純化、cDNA的合成和qRT-PCR的表達分析。

1.5 光合色素含量的測定

以野生型、突變體和互補植株為材料, 上午9:00在種植小區(qū)中間隨機選擇長勢相對一致的5個單株, 測定葉片中部的光合色素含量。稱取0.1 g葉片剪碎裝入離心管, 加25 mL丙酮∶無水乙醇(1∶1, v/v) 混合液封口暗處理24~48 h, 其間經常搖動, 每個樣品重復3次。用分光光度計測定470 nm、645 nm和663 nm的光吸收值, 參考Lichtenthaler[20]的方法計算。

1.6 亞細胞定位

選擇載體pTCK303為載體骨架, 其上的Ubiquitin為啟動子,H I和I為雙酶切位點。設計引物擴增基因的整個CDS片段, 前引物ATG前加入來自pTCK303H I酶切后Ubiquitin側15 bp, 后引物不含終止密碼子。再設計1對引物擴增基因的整個CDS片段, 前引物與的后引物有15 bp的重疊, 后引物加入來自pTCK303I酶切后NOS側15 bp堿基。引物6OEPF1、6OEPR1、6GFPF1和6GFPR1的序列分別為5￠-tacttc tgcaggatcATGGCAGCAACAGCCTCCCT-3￠、5￠-tcacc atgacgctgaCGAGCTTCTTGCC-3￠、5￠-tcagcgtcatggtga GCAAGGGCGAGGA-3￠和5￠-CAAATGTTTGAAC GGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3￠。參照Ren等[19]轉水稻原生質體的亞細胞定位方法。

2 結果與分析

2.1 YGL6基因組互補驗證

為了驗證通過圖位克隆篩選出的候選基因就是基因[18], 構建了基因組互補載體, 將野生型中基因組片段包括上游3500 bp、編碼框和下游1500 bp序列利用重組酶整合到pCAMBIA1301表達載體中, 然后通過農桿菌介導法遺傳轉化突變體。在T0獲得的轉基因植株中, 共觀察到12株轉基因植株的突變體表型得以恢復(圖1-A, B)。同時通過提取DNA后測序比對發(fā)現, 12株轉基因植株在突變位點均出現了雙峰, 證實互補載體成功轉入突變體, 使其表型得以恢復正常(圖1-C)。分析表明恢復表型的轉基因植株的葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量均達到了野生型的色素含量水平(圖1-D)。

圖1 YGL6基因的互補驗證

A: WT、和轉基因互補植株; B: WT、和轉基因互補植株的葉片; C: WT、和轉基因互補植株突變位點的測序結果; D: WT、和轉基因互補植株的色素含量。*表示在0.05水平上差異顯著。

A: phenotypes of WT,mutant,and transgenic plant (/); B: leaves of WT,mutant, and transgenic plant; C: thesequencing of WT,mutant, and transgenic plant; D: pigment contents of WT,mutant, and transgenic plant. *﹤0.05.

2.2 YGL6蛋白質功能注釋與進化分析

通過比對水稻基因組序列, 在其他位置未發(fā)現與基因高度相似的序列, 表明基因是單拷貝基因。利用NCBI網站對YGL6蛋白質BLASTp分析表明,基因編碼NAD(P)-結合的Rossmann折疊超家族蛋白質, 屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族, 推斷為異黃酮還原酶、糖脫水酶和mRNA結合蛋白等。YGL6蛋白質具有多個保守結構域, 如SDR-a1結構域、NAD(P)-結合位點、UDP-葡萄糖-4-異構酶C末端亞基、短鏈脫氫酶、RNA結合蛋白、NAD依賴的異構酶家族等。

YGL6蛋白在網站gramene (http://www.gramene. org/)預測是一個RNA結合蛋白, 生物信息學分析該蛋白質定位于葉綠體, 系統進化樹分析表明其與其他物種的葉綠體莖環(huán)結合蛋白聚類在一起。從系統進化中可以看出, 該基因屬于高保守低拷貝, 從藻類、苔蘚到高等植物均含有此蛋白, 并且藻類、苔蘚、單子葉和雙子葉植物各自組成一個分支(圖2)。

2.3 YGL6基因的表達分析

通過qRT-PCR檢測,基因在苗期除根外, 心葉、成熟葉和葉鞘中均有表達, 尤以心葉的表達量最高, 達到成熟葉的6倍多(圖3-A); 在孕穗期, 僅在葉片和葉鞘中有表達, 在心葉的表達量最高; 在抽穗期的綠色穎殼中也有表達(圖3-B)。以上結果表明基因在整個生育期的綠色部位表達, 尤以心葉的表達量最高。

2.4 YGL6基因表達受光照的影響

對連續(xù)暗培養(yǎng)14 d的水稻幼苗光照處理表明, 隨著光照時間的延長,基因的表達量不斷上升(圖4-A)。對連續(xù)光培養(yǎng)14 d的水稻幼苗進行黑暗處理表明暗培養(yǎng)0.5 h表達量下降, 但隨后表達量逐漸上升, 在4 h時達到最大表達量, 隨后逐漸下降, 在24 h時降到最低表達量(圖4-B)。以上結果表明基因的表達受光照的誘導。

圖2 YGL6基因的進化分析

圖3 YGL6基因表達分析

A: 苗期基因在WT和的表達分析; B: 孕穗期基因在WT的表達分析。*表示在0.05水平上差異顯著。

A: expression level ofat seedling stage in WT and themutant; B: expression level ofat booting stage in WT. *﹤0.05.

2.5 YGL6蛋白的亞細胞定位

亞細胞定位分析網站(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)預測YGL6蛋白定位于葉綠體, 為了驗證YGL6蛋白是否定位于葉綠體, 構建了35S-ORF-GFP和35S-GFP融合瞬時表達載體。將瞬時表達載體轉化水稻原生質體, 用綠色熒光蛋白GFP做指示。結果表明, 在轉35S-GFP原生質體, 除液泡外綠色熒光信號在整個細胞中均能觀察到(圖5-A~D); 而在轉35S-ORF-GFP的原生質體中, GFP的綠色熒光信號(圖5-E)和葉綠體自發(fā)的紅色熒光信號(圖5-F)重疊為黃色(圖5-H), 說明YGL6蛋白定位在葉綠體。

3 討論

在眾多被鑒定的葉色突變體中, 僅有少數基因被克隆。葉綠素生物合成和葉綠體發(fā)育是一個相當復雜的過程, 目前已克隆的水稻葉色突變基因直接或間接影響葉綠素代謝或者葉綠體的發(fā)育。直接參與編碼葉綠素合成與降解的酶基因有編碼鎂離子螯合酶H、D和I亞基的[7]、和[11]基因, 葉綠素酸酯氧化酶基因、[8], 葉綠素合成酶基因[12]。調控葉綠體發(fā)育的基因有鳥苷酸激酶基因[9-10], 三角狀五肽重復蛋白基因[21], 葉綠體RNA聚合酶基因[22]等。此外已成功克隆出的葉色相關基因還有持綠突變體基因()[23], 葉綠素還原酶基因()[24], 葉綠素還原酶的同源基因[25]等。通過圖位克隆和基因互補實驗表明基因是一個位于第12染色體的SDR超家族基因, 雖然目前已發(fā)現的葉色突變相關基因有90多個, 但在第12染色體鮮有葉色突變的報道, Shi等首次報道了突變體[18], 本研究證實了是一個調控葉色突變的基因。

圖4 光照對YGL6基因表達的分析

A: 連續(xù)黑暗培養(yǎng)后在不同光照時間基因的表達; B: 連續(xù)光照培養(yǎng)后在不同黑暗時間基因的表達。

A: expression level ofin wild-type plants at different hours transferred to continuous light from continuous darkness; B: expression level ofin wild-type plants at different hours transferred to continuous darkness from continuous light.

圖5 YGL6蛋白的亞細胞定位

A~D: 陰性對照(35S-GFP); E~H: YGL6蛋白定位(35S-ORF-GFP)。

A-D: negative control (35S-GFP); E-H: subcellular location of YGL6 protein (35S-ORF-GFP).

最近有研究表明, 葉綠體有不同的RNA池, 其中有些RNA被翻譯, 而其他的并不被翻譯[26]。細菌RNA轉錄后即被翻譯, 剪切、RNA編輯、內含子剪接等轉錄后加工在細菌中較少存在[27]。然而, 葉綠體的初級RNA產物均需要不同形式的轉錄后加工[28]。細菌的多順反子直接進行翻譯, 而葉綠體的多順反子需要進一步剪切產生更小的多順反子或單順反子RNA, 有些還需要進一步的剪切或編輯產生成熟的RNA[28-29]。多數質體RNA的成熟需要低特異性的核酸酶, 加工的程度通常由RNA結合蛋白和RNA的二級結構決定[28-29]。葉綠體RNA代謝需要數量眾多的RNA結合蛋白的參與, YGL6具有mRNA結合結構域, 亞細胞定位結果顯示YGL6蛋白定位于葉綠體。綜合上述結果可以確定基因是一個新的調控水稻葉綠體RNA代謝的基因, 有助于更進一步理解和完善水稻葉色突變的機制。

利用NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對YGL6蛋白質BLAST分析表明,基因編碼NAD(P)-結合的Rossmann折疊超家族蛋白質, 屬于一個短鏈脫氫酶/還原酶家族 (short-chain dehydrogenase/reductase, SDR), 多數被鑒定的SDR被推斷為異黃酮還原酶、糖脫水酶和mRNA結合蛋白等。Baker等研究表明菠菜一個mRNA結合蛋白CSP41和核苷-糖異構酶及羥類固醇脫氫酶同源[30]。CSP41是一類分子量為41 kD的葉綠體莖環(huán)結合蛋白, 目前已對多個物種的CSP41進行了克隆和功能分析。最早報道的CSP41a在體外可以結合到mRNA的3￠末端, 具有序列特異的莖環(huán)結構結合能力和核酸內切酶活性[31]。隨后研究表明, CSP41蛋白也在質體編碼的RNA PEP (plastid-encoded polymerase)或者質體核糖體中存在, 可能參與RNA的轉錄或翻譯過程[32-33]。但最近的研究卻不能證實CSP41是PEP復合物的一部分[34]。研究表明CSP41缺乏已知的核酸內切酶基序, 但屬于SDR超家族, 實驗表明SDR基序可能是新類型的核酸內切酶基序[35]。CSP41的蛋白功能具有多樣性, 并且已報道的CSP41蛋白均來自其他物種, 在水稻中尚無報道。水稻究竟行使以上的哪種或哪幾種功能, 還是其他的未知功能, 以及YGL6蛋白質是否為CSP蛋白, 需要進一步的相關實驗探究。

4 結論

黃綠葉基因為, 與其他物種的葉綠體莖環(huán)結合蛋白聚類在一起。基因僅在綠色組織如心葉、成熟葉、葉鞘和綠色穎殼中表達, 尤其以心葉的表達量最高, 其表達還受光照的誘導。YGL6蛋白被定位于葉綠體。我們認為通過蛋白產物的RNA結合功能參與葉綠體的發(fā)育過程。本研究為進一步研究的基因功能奠定了基礎, 并豐富了水稻突變體庫, 深化了當前對葉綠體的發(fā)育過程的研究。

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Expression Pattern and Protein Localization of a() Gene in Rice ()

SHI Jun-Qiong1,2, WANG Ya-Qin1, ZHANG Tian-Quan1, MA Ling1, and HE Guang-Hua1,*

1Rice Research Institute, Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Southwest University, Chongqing 400716, China;2School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, China

Leaf color mutants are used not only as morphological markers in hybrid rice breeding, but also as ideal materials in studies on the structure and function of photosystem, chlorophyll biosynthesis and regulation mechanism. A new rice mutant exhibiting stable inheritance was derived from ethyl methane sulfonate (EMS)-treated restorer line Jinhui 10 (), tentatively named as(). Theleaf displayed yellow-green at seeding stage, and pale green at jointing stages. The YGL6complementation experiment implied that theis thegene. The expression pattern analysis indicated thatwas expressed in green tissues including young leaves, mature leaves, sheaths and green glume, with the highest expression level in young leaves. Andexpression was induced by light. Transient expression of theYGL6-GFP protein in rice protoplast showed that YGL6 was localized in chloroplasts. These results provide a foundation for functional analysis of.

rice ();();gene; chloroplast;expression pattern

2017-09-23;

2018-01-08;

2018-01-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.00650

本研究由科技部重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0100201), 重慶市科委項目(CSTCCXLJRC201713, cstc2016shms-ztzx0017)和中央高?；緲I(yè)務費專項(XDJK2016C111)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0100201), Chongqing Science and Technology Commission Project (CSTCCXLJRC201713, cstc2016shms-ztzx0017), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2016C111).

何光華, E-mail: hegh@swu.edu.cn

E-mail: shijunqiong@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180126.1647.024.html