蘭霄霄，周志陽，徐欣欣，吳雪清

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325015）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，雖然近年來宮頸癌疫苗和早期篩查的開展使得宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但是宮頸癌仍然在女性癌癥相關(guān)性死亡中占據(jù)一定的比例[1]。FENDRR（FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA）是位于第13號染色體的一段長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lcnRNA），能與多梳蛋白復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）或TrxG/MLL復(fù)合物結(jié)合[2]，對小鼠心臟和體壁的正常發(fā)育具有重要作用[3]。已有研究表明FENDRR能通過影響纖連蛋白1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[4]，但目前尚未見關(guān)于其在宮頸癌中的研究。本研究通過在宮頸癌細(xì)胞中應(yīng)用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）介導(dǎo)的基因干擾技術(shù)特異性干擾FENDRR的表達(dá)，結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、細(xì)胞增殖CCK-8、Transwell以及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，探討FENDRR在宮頸癌發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 宮頸癌細(xì)胞株（SiHa和HeLa，美國ATCC細(xì)胞庫），Advanced MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），siRNA（上海吉瑪生物公司），轉(zhuǎn)染試劑（美國SignaGen公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠（美國Corning公司），Trizol（美國Invitrogen公司），氯仿和異丙醇（美國Sigma公司），PCR引物（北京擎科生物技術(shù)公司）（見表1），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit）、qRTPCR試劑盒（SYBR?Premix Ex Taq?，日本Takara公司），裸鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司），實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009。

表1 qRT-PCR引物的基因序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：宮頸癌細(xì)胞株用含10% FBS、100 ng/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素以及2 μmol/mL谷氨酸鈉的Advanced MEM細(xì)胞培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%～90%融合度時進(jìn)行傳代。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染前1 d接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至6孔板，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度接近50%。轉(zhuǎn)染特異性干擾FENDRR的siRNA為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染空白對照siRNA為對照組。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：①轉(zhuǎn)染前30 min在上述鋪好細(xì)胞的6孔板中換上1 mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基；②用100 μL稀釋好的1×轉(zhuǎn)染緩沖液溶解5 μL siRNA，混勻后再加入4 μL轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻后室溫孵育15 min；③將配好的含有siRNA的試劑加入6孔板的相應(yīng)孔中，輕輕混勻；④培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)將6孔板置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑤轉(zhuǎn)染24～48 h后進(jìn)行siRNA干擾沉默效果及細(xì)胞功能檢測。

1.2.3 qRT-PCR：①提取細(xì)胞總RNA：運(yùn)用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA。測定RNA濃度及OD260/OD280在1.8～2.0之間，符合要求。RNA保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②反轉(zhuǎn)錄：每組各取1000 ng總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。③qRT-PCR：利用qRT-PCR試劑盒對反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體擴(kuò)增體系為：SYBR?Premix Ex Taq II（2×）5 μL，ddH2O 3.4 μL，上下游引物混合液0.4 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，cDNA 1 μL。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)：96孔板每孔種植SiHa細(xì)胞2000個，HeLa細(xì)胞2500個，分別于細(xì)胞貼壁后的0、24、48、72、96 h向每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育3 h后用酶標(biāo)儀檢測每孔450 nm波長的吸收值。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)：①細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室的下室中加入500 μL含10% FBS的完全細(xì)胞培養(yǎng)基，上室接種300 μL不含F(xiàn)BS的細(xì)胞懸液（內(nèi)含細(xì)胞25000個），37 ℃培養(yǎng)24 h后取出小室，棄上室殘存培養(yǎng)基，待自然涼干后用甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，用棉簽擦去小室內(nèi)表面殘留的細(xì)胞及染料，顯微鏡觀察穿過小室濾膜的細(xì)胞并計數(shù)（10倍鏡下隨機(jī)選擇5個視野）；②細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將存于-20 ℃的Matrigel置于4 ℃解凍，用預(yù)冷的無FBS培養(yǎng)基按1∶30稀釋Matrigel，在小室的上室中均勻鋪上100 μL稀釋好的Matrigel，37 ℃放置約2 h使其凝結(jié)成膠體。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。以上實(shí)驗(yàn)分別至少重復(fù)3次。

1.2.6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：2～3周的雌性裸鼠，每組5只。收集指數(shù)增長期的細(xì)胞用無FBS的培養(yǎng)基和Matrigel按1∶1的比例制備細(xì)胞懸液，在每只裸鼠的腋下皮下種植含2.5×106個HeLa細(xì)胞的細(xì)胞懸液100 μL（左側(cè)種植對照組細(xì)胞，右側(cè)種植實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞）。種植細(xì)胞1周后，每3 d檢測1次腫瘤的大小和裸鼠的體質(zhì)量，4周后取出腫瘤，測量腫瘤質(zhì)量并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5和SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染siRNA后FENDRR的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了特異性靶向FENDRR的siRNA后，宮頸癌細(xì)胞中FENDRR的表達(dá)水平明顯下降，在SiHa細(xì)胞中FENDRR相對表達(dá)水平由（1.013±0.120）降為（0.226±0.024），在HeLa細(xì)胞中FENDRR相對表達(dá)水平由（1.001±0.025）降為（0.099±0.010），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 FENDRR抑制宮頸癌細(xì)胞體外增殖 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，干擾FENDRR的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa的增殖能力明顯增強(qiáng)，SiHa細(xì)胞在48、72和96 h實(shí)驗(yàn)組和對照組的OD分別為： （0.932±0.014）、（1.603±0.012）、 （2.282±0.024）和（0.780±0.005）、 （1.150±0.011）、 （1.693±0.019），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1A。HeLa細(xì)胞在72和96 h實(shí)驗(yàn)組和對照組的OD分別為： （1.175±0.017）、（1.983±0.021）和（0.889±0.014）、 （1.483±0.017），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B。

2.3 FENDRR抑制宮頸癌細(xì)胞體外運(yùn)動能力 為了驗(yàn)證FENDRR對宮頸癌細(xì)胞體外遷移以及侵襲能力的影響，應(yīng)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力。用Leica熒光正置顯微鏡進(jìn)行拍照，結(jié)果顯示，干擾FENDRR后，宮頸癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)（見圖2A-B）。SiHa遷移細(xì)胞數(shù)從（95.2±2.9）增至（212.4±7.4），HeLa遷移細(xì)胞數(shù)從（130.2±6.2）增至（433.8±13.1），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。SiHa侵襲細(xì)胞數(shù)從（39.6±1.9）增至（97.2±7.2），HeLa侵襲細(xì)胞數(shù)從（109.2±4.6）增至（252.4±18.2），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 FENDRR抑制宮頸癌細(xì)胞SiHa（A）和HeLa（B）體外增殖

圖2 FENDRR抑制宮頸癌細(xì)胞遷移能力（A）和侵襲能力（B）（×10）

2.4 FENDRR抑制宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)增殖 為了進(jìn)一步驗(yàn)證FENDRR在宮頸癌中的作用，采用HeLa細(xì)胞進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。連續(xù)監(jiān)測腫瘤大小和裸鼠體質(zhì)量，根據(jù)體積計算公式（體積=1/2長×寬2），發(fā)現(xiàn)干擾FENDRR后HeLa細(xì)胞的成瘤能力增強(qiáng)，腫瘤體積與對照組比從（853.2±59.4）mm3增加到（1155.0±51.5）mm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3A。腫瘤質(zhì)量從（0.544±0.053）g增加到（0.814±0.061）g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

圖3 FENDRR抑制宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)增殖

3 討論

隨著基因芯片和高通量測序等生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們逐漸認(rèn)識到在人類全基因組以及轉(zhuǎn)錄組中蛋白編碼基因僅占了不到2%，超過75%的基因不具備蛋白編碼功能，但后者在各種生物學(xué)過程中同樣發(fā)揮著重要的作用[5]。LncRNA是長度大于200個核苷酸并且不具備蛋白編碼功能的RNA，占據(jù)非編碼RNA的主要部分。近幾年，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與許多生物學(xué)進(jìn)程[6-7]。在癌癥中，lncRNA的表達(dá)具有一定的組織或者腫瘤特異性，并且能與其他生物分子發(fā)生相互作用影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞生存、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞干性等過程，進(jìn)而影響癌癥細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[8]。部分lncRNA也受一些關(guān)鍵抑癌基因或者促癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[9-10]。隨著研究的進(jìn)一步深入，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA能作為一種信號分子反映特異性細(xì)胞狀態(tài)以及作為區(qū)分癌癥等細(xì)胞病理狀態(tài)的標(biāo)志物[11]，為癌癥提供一定的預(yù)后價值，甚至還可以作為一種新的治療選擇。BUSSEMAKERS等[12]對前列腺癌組織和正常組織進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)了首個與癌癥相關(guān)的異常表達(dá)的lncRNA-PCA3（prostate cancer associated 3，PCA3），PCA3在前列腺癌組織中明顯高表達(dá)并且具有很強(qiáng)的組織特異性，在前列腺癌的進(jìn)展中具有重要的作用。目前PCA3已經(jīng)成為臨床上前列腺癌診斷的重要生物學(xué)標(biāo)志物，并且與血清前列腺特異性抗原（PSA）檢測相比具有非侵襲性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)[13]。

FENDRR基因是2009年最先鑒定，定位于染色體3q13.31，毗鄰FOXF1，有4個外顯子，編碼一個長3099個核苷酸的lncRNA[2]。目前對FENDRR的研究較少，其表達(dá)和功能異常與腫瘤相關(guān)的報道更是罕見，其在子宮頸癌中的作用也尚不清楚。XU等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織和細(xì)胞相比，F(xiàn)ENDRR在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著下調(diào)，并且其低表達(dá)與胃癌的高分期、深侵襲和高轉(zhuǎn)移相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FENDRR通過降低纖維連接蛋白1和MMP2/MMP9的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)胃癌的遷移和侵襲能力，提示FENDRR在胃癌中具有一定的預(yù)后預(yù)測價值，并且還可能成為治療的新靶點(diǎn)。MIAO等[14]對非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）及其正常對照組織進(jìn)行基因芯片分析發(fā)現(xiàn)FENDRR在NSCLC中明顯低表達(dá)，而過表達(dá)FENDRR使得肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。此外，F(xiàn)ENDRR還能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡[15]。為了探索FENDRR對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，本研究通過siRNA介導(dǎo)的基因干擾技術(shù)特異性干擾FENDRR在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)合細(xì)胞增殖和Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)干擾FENDRR后宮頸癌細(xì)胞的體外增殖和遷移、侵襲能力均有所增強(qiáng)。此外，本研究還通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了干擾FENDRR能增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力，說明FENDRR在宮頸癌中確實(shí)發(fā)揮了一定的抑癌作用，但具體機(jī)制目前還不清楚。PRC2是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，能甲基化H3K27以抑制特異性基因的轉(zhuǎn)錄，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾和基因活性調(diào)節(jié)中具有重要作用[16-18]。研究表明，許多l(xiāng)ncRNA功能的發(fā)揮都在一定程度上依賴于其與染色質(zhì)修飾復(fù)合物PRC2之間的相互聯(lián)系，其中研究得比較深入的是lncRNA HOTAIR。GUPTA等[19]通過對正常人類乳腺上皮細(xì)胞、原發(fā)性乳腺癌以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)HOTAIR在原發(fā)性乳腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表達(dá)水平增高，并且HOTAIR高表達(dá)與乳腺癌患者后期的轉(zhuǎn)移和死亡密切相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR主要通過結(jié)合PRC2發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移作用。同樣地，近期研究發(fā)現(xiàn)FENDRR能夠結(jié)合PRC2或TrxG/MLL復(fù)合體，后兩者均為染色質(zhì)修飾復(fù)合物，能促進(jìn)靶基因啟動子的甲基化，沉默靶基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的作用[3，20]，還有研究表明FENDRR可能通過與PRC2復(fù)合物中的EZH2發(fā)生相互作用進(jìn)而調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、多能性以及轉(zhuǎn)移功能[14]。因此，我們推測FENDRR可能也是通過與染色質(zhì)修飾復(fù)合物PRC2結(jié)合，沉默相應(yīng)的靶基因，進(jìn)而改變宮頸癌細(xì)胞的表型，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)FENDRR對宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性具有抑制作用，干擾FENDRR的表達(dá)能增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖能力和體外遷移、侵襲潛能，說明FENDRR可能在宮頸癌的進(jìn)展中具有重要的抑癌作用。結(jié)合目前關(guān)于lncRNA的研究，我們推測FENDRR有可能成為一個新的生物標(biāo)志物，為將來宮頸癌的診斷和治療提供新的思路。

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