符群，李卉，王振宇，王路

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090）

薇菜，學(xué)名紫萁（Osmunda japonica Thunb.），民間俗稱野雞頭、大巢菜、掃帚菜，古時(shí)名為“巢菜”或“野豌豆”。紫萁科（Osmundaceae）紫萁屬（Osmunda）多年生真蕨類植物。薇菜味苦性涼并富含多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及微量元素[1]，薇菜整株均可食，具有抗菌、凝血、消炎退熱[2]、抗氧化、增進(jìn)人體免疫力、抗癌防癌及延緩衰老的作用，其中促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)等功效明顯[3]。

超微粉碎，是指利用機(jī)械或流體動(dòng)力的方法克服固體內(nèi)部凝聚力使之破碎，從而將3 mm以上的物料顆粒粉碎至10～25 μm的操作技術(shù)，分為干法粉碎和濕法粉碎，干法粉碎有氣流式、高頻率震動(dòng)式、旋轉(zhuǎn)球（棒）磨式、錘擊式和自磨式等幾種形式，濕法主要是用膠體磨和均質(zhì)機(jī)粉碎[4]。超微粉碎具有速度快、時(shí)間短、粒徑細(xì)、分布均勻、節(jié)省原料、提高生物利用率的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)選擇干法粉碎中的球磨法及濕法粉碎中高壓均質(zhì)法對(duì)薇菜粉體原料進(jìn)行處理，考察不同超微粉碎方法對(duì)薇菜粉體的影響。

胃腸道消化是很多營養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要部分之一，胃內(nèi)有特殊的酸性環(huán)境，對(duì)少部分呈弱酸性的成分有很好的吸收作用。黃酮、多酚均具有弱酸性。某些黃酮類物質(zhì)可以在胃部直接吸收，如：槲皮素[5]、大豆素和染料木素等[6]而多酚中的花色苷[7]也可以在胃部快速吸收，且黃酮苷元和多酚具有疏水性，可以通過被動(dòng)擴(kuò)散透過生物膜而被吸收[8]。近年一些研究發(fā)現(xiàn)通對(duì)食品的特定處理能顯著改善活性成分在人體腸胃中的生物利用率[9]。通過體外模擬胃腸道消化可有效觀察超微粉碎對(duì)薇菜營養(yǎng)物質(zhì)的釋放量和生物利用率的影響，為薇菜產(chǎn)品的加工提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薇菜，吉林長白山。

MD34MM透析袋，美國Viskase；胃蛋白酶、胰蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；牛黃膽酸鹽，上海金穗生物科技有限公司；Folin-酚試劑，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；無水乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、Na2CO3均為分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JMF-80型膠體磨，溫州市膠體磨廠；SRH60-70型高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；ND7-2L行星球磨機(jī)，南京南大天尊電子有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器公司；BILON-6000Y型噴霧干燥機(jī)，上海比朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 薇菜粉體的常規(guī)碎處理

薇菜原料置于 60 ℃烘箱中烘干至殘余水分低于3%。以間歇式高速粉碎機(jī)粉碎至60目，樣品袋封閉于干燥器中放置備用。

1.3.2 薇菜超微粉碎處理

1.3.2.1 行星球磨法制備超微粉碎工藝

參照楊宏志[10]等人的方法并稍加修改，在瑪瑙罐中裝入處理好的常規(guī)粉碎薇菜樣品10 g和直徑9 mm剛玉材質(zhì)小球100 g，球料質(zhì)量比為10:1（g/g），轉(zhuǎn)速為270 r/min。粉碎時(shí)間分別為7 h，所得薇菜粉末過200目篩，至于干燥器中備用。

1.3.2.2 高壓均質(zhì)法制備超微粉碎工藝

膠體磨預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取16 g常規(guī)粉碎處理后的薇菜粉并加入去離子水?dāng)嚢?，料液濃度?2%，通過膠體磨預(yù)處理（10 min）。

將預(yù)處理后的原料，加入高壓均質(zhì)機(jī)中，在均質(zhì)壓力為25 MPa，進(jìn)料溫度為60 ℃的條件下均質(zhì)15 min后進(jìn)行噴霧干燥[11]。高壓噴霧干燥進(jìn)料速度為12.5 mL/min，進(jìn)口溫度為190 ℃，出口溫度為80 ℃。所得粉末過200目篩，至于干燥器中備用。

1.3.3 薇菜總黃酮、總多酚的體外消化

1.3.3.1 體外模擬胃腸道消化

參照李俶的方法[12]并稍作修改取3個(gè)100 mL錐形瓶依次加入9 mg/mL NaCL溶液25 mL、0.1 mol/L鹽酸溶液4 mL、4 mg/mL胃蛋白酶溶液4 mL（緩沖溶液：0.1 mol/L鹽酸）混勻，測(cè)定溶液pH在2.0～2.5之間，分別在三個(gè)錐形瓶中加入行星球磨薇菜超微粉、高壓均質(zhì)薇菜超微粉和常規(guī)粉碎薇菜粉各 1 g，于37 ℃，100 r/min水浴震蕩1 h。此過程模擬胃部消化，所得消化液留部分冷藏備用，其余參與下一步腸道消化。

1.3.3.2 體外模擬腸液消化

透析袋預(yù)處理：新袋在蒸餾水中沸水浴 5 min，冷卻，浸泡在50%乙醇溶液中備用[13]。

使用前用生理鹽水反復(fù)沖洗透析袋，清洗好后在透析袋中加入 9 mg/mL NaCL 8 mL，0.5 mol/L NaHCO32 mL，兩端系緊，置于消化胃液中，于37 ℃，100 r/min恒溫水浴45 min，此過程模擬胃部食物從胃部向腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移的過渡階段。

經(jīng)處理后，錐形瓶中pH約在6.5～7.0范圍內(nèi)，在錐形瓶中加入 18 mL胰膽酶混合液（按照胰酶 0.2 mg/mL、膽汁酶1.2 mg/mL比例混合，緩沖溶液：0.1 mol/L碳酸氫鈉），于37 ℃，100 r/min水浴震蕩3 h，將透析袋內(nèi)和錐形瓶?jī)?nèi)液體分別冷藏，待測(cè)。

1.3.4 薇菜活性成分的生物利用率

生物利用率是指食物中的活性成分被人吸收利用的量占其在食物中的百分比[14]。采用超微粉碎方法來處理食品原料，有利于營養(yǎng)物質(zhì)在消化道的溶解、代謝和吸收。黃酮、多酚類物質(zhì)通過腸胃吸收進(jìn)入血液與其他組織器官再轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行分解代謝。通過公式（1）計(jì)算薇菜總黃酮、總多酚的生物利用率。

式中：C透析表示該成分在透析袋中的含量（mg/g）；C非透析表示該成分在腸道內(nèi)的總含量（mg/g）。

1.3.5 總黃酮釋放量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品干燥至恒重后，準(zhǔn)確稱取0.0140 g定容于50 mL容量瓶中，得濃度0.28 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[15]。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.75 mL，搖勻，放置6 min再加入10%的Al(NO3)3溶液0.75 mL，搖勻，放置6 min后再加入4% NaOH溶液10 mL，蒸餾水定容，搖勻，靜置10～15 min后于510 nm處測(cè)定吸光度A，以蘆丁濃度X（mg/mL）對(duì)吸光度Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=0.4367x-0.0006，R2=0.9996。

總黃酮釋放量的測(cè)定：取樣品1 mL按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，于510 nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)回歸方程，按照公式（2）計(jì)算薇菜總黃酮釋放量（以蘆丁當(dāng)量計(jì)）。

式中：C表示測(cè)定液總黃酮含量（mg/mL）；N表示稀釋倍數(shù)；V表示為樣品體積（mL）；M表示樣品質(zhì)量(g)。

1.3.6 總多酚釋放量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取0.100 g干燥的沒食子酸用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中，配置成1000 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；同時(shí)分別移取等體積的1.0 mL～7.0 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中并定容，配置成濃度分別為10、20、30、40、50、60、70 μg/mL的工作液。在10 mL棕色容量瓶中分別移取不同濃度的工作液1 mL，各加入10%福林酚試劑5 mL后充分振蕩搖勻，反應(yīng)5 min后加入7.5%的碳酸鈉溶液4 mL并通過蒸餾水定容；置于25 ℃恒溫水浴條件下反應(yīng) 1 h，以蒸餾水為空白對(duì)照于 765 mm波長下測(cè)定混合體系吸光值[16]。以吸光度為縱坐標(biāo) y，沒食子酸濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo) x，得到多酚濃度與吸光度的線性回歸方程：y=0.0045x+0.004，R2=0.9987。

總多酚釋放量的測(cè)定：取樣品1 mL按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，于765 nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)回歸方程，按照公式（3）計(jì)算薇菜總多酚釋放量（以沒食子酸當(dāng)量計(jì)）。

式中：C表示測(cè)定液總多酚含量（mg/mL）；N表示稀釋倍數(shù)；V表示為樣品體積（mL）；M表示樣品質(zhì)量（g）。

1.3.7 可溶性蛋白釋放量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定[17]：考馬斯亮藍(lán)G-250溶液（稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%乙醇溶液中，加入85%磷酸100 mL，用蒸餾水定容于1 L棕色容量瓶中，呈棕紅色），備用。精密稱取牛血清白蛋白14.2 mg，定容于100 mL容量瓶，制得142 μg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，取7支10 mL具塞試管，分別精密吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液于試管中，各管補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL，混勻，室溫放置5 min后在595 nm 處測(cè)定溶液吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量 X（μg）對(duì)吸光度Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=0.0082+0.0054x，R2=0.9998。

樣品中可溶性蛋白含量測(cè)定：稱取三種處理方式的薇菜粉體各40 mg按上述1.3.3方法進(jìn)行體外消化。取供試樣品溶液1 mL，按照1.3.7.1方法進(jìn)行測(cè)定，于595 nm處測(cè)定吸光度，按照公式（4）計(jì)算薇菜樣品中可溶性蛋白的含量。

式中：c表示測(cè)得的樣品溶液的可溶性蛋白質(zhì)量（μg）；m表示樣品質(zhì)量（mg）。

1.3.8 可溶性多糖釋放量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定[18]：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖標(biāo)品0.5 g，用蒸餾水定容至500 mL，得到1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于試管中，補(bǔ)加蒸餾水至3 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，后迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，靜置20 min后于490 nm處測(cè)定吸光值，以吸光度為縱坐標(biāo)y，葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo) x，得到葡萄糖濃度與吸光度的線性回歸方程：y=0.0233+2.5679x，R2=0.9969。

薇菜待測(cè)樣品溶液制備：稱取三種處理方式的薇菜粉體各1 g按上述1.3.3方法進(jìn)行體外消化。取供試樣品1 mL樣液于試管中，加入4 mL蒸餾水，按照公式（5）中方法于490 nm處測(cè)定溶液吸光度，計(jì)算供試樣品中可溶性多糖的含量。

式中：c表示測(cè)得的樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；V表示供試液體積（mL）。

1.4 超微粉碎處理對(duì)薇菜粉體物理性質(zhì)影響

1.4.1 薇菜粉體平均粒徑測(cè)定

采用掃描電子顯微鏡觀察法，通過顯微鏡放大后的圖案觀察粉粒形態(tài)變化，并將顯微鏡放大后的顆粒圖案通過攝像頭及圖形采集卡傳輸計(jì)算機(jī)中，由計(jì)算機(jī)對(duì)圖像進(jìn)行邊緣識(shí)別處理，計(jì)算每個(gè)顆粒的投影面積。統(tǒng)計(jì)出設(shè)定粒徑區(qū)間的顆粒數(shù)量，得到粒度分布情況[19]。

1.4.2 薇菜粉體流動(dòng)性的測(cè)定

采用休止角法，實(shí)驗(yàn)將3 g樣品經(jīng)玻璃漏斗垂直流至玻璃平板上，漏斗尾端距玻璃平板垂直距離 3 cm，流下的樣品在玻璃平板上形成圓錐體，測(cè)定圓錐表面和水平面的夾角即為樣品休止角[19]。

1.4.3 薇菜粉體膨脹力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品，放入帶刻度的玻璃試管中記錄體積Vl，加入10 mL蒸餾水，攪拌均勻后，在室溫下靜止24 h，讀出樣品此時(shí)的體積數(shù)為V2[20]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均平行測(cè)定3次，采用Origin 8.6繪制柱狀圖，SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及Duncans’差異顯著性分析，p＜0.05為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微粉碎處理對(duì)粉體物性的影響

2.1.1 粉體平均粒徑

通過表1可以看出2種超微粉碎方法粉碎后的粉體粒徑與常規(guī)粉碎粉體粒徑差距極其顯著（p＜0.01），普通粉碎方法的粉體粒徑分別是行星球磨法和高均質(zhì)法的47.77倍和60.92倍。說明超微粉碎機(jī)通過機(jī)械力和流體動(dòng)力等物理作用，打破了粉體內(nèi)部分子的凝聚力使薇菜粉體達(dá)到破壁級(jí)別的粉碎。

表1 超微粉碎方法對(duì)粉體平均粒徑的影響Table 1 Effects of three treatment methods on the average particle size of powders

2.1.2 粉體休止角

由表2可看出，通過超微粉碎處理的薇菜樣品與常規(guī)粉碎處理的粉體休止角差異顯著（p＜0.05）經(jīng)過粉碎處理的超微粉休止角比起初篩粉都有所增加，此結(jié)果與陳光靜在冬桑葉超微粉制備[21]中的研究結(jié)果相似。由于超微粉碎后，粉粒的粒徑變小，比表面積增大，孔隙度增加。這使得粉粒表面的聚合力增大，顆粒之間的摩擦力增加，導(dǎo)致其休止角增大。因此，超微處理后的超微粉在流動(dòng)性上稍有欠缺，但可以通過工藝的優(yōu)化以及造粒技術(shù)等進(jìn)行改善。

2.1.3 粉體膨脹力

準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品，放入帶刻度的玻璃試管中記錄體積Vl，加入10 mL蒸餾水，攪拌均勻后，在室溫下靜止 24 h，讀出樣品此時(shí)的體積數(shù)為V2。按照“1.4.4”中所述公式進(jìn)行計(jì)算，所得結(jié)果見表3。

表3 超微粉碎方法對(duì)粉體膨脹力的影響Table 3 Effects of three treatment methods on powder expansion

由表3可看出，經(jīng)超微粉制備后薇菜粉體膨脹力下降。這是由于薇菜原料中的纖維成分較多，粉碎前，較多水分被大量纖維束縛，經(jīng)超微粉碎后，纖維的長鏈大幅度減少而短鏈增多，導(dǎo)致粉末對(duì)水分的束縛力降低，膨脹力減小[22]。高壓均質(zhì)法制備的超微粉膨脹力顯著低于行星球磨法（p＜0.05），這是由于噴霧時(shí)粉粒的團(tuán)聚作用使其呈球形分布，短鏈纖維也隨之減少，從而膨脹力減小。

2.2 超微粉碎法對(duì)薇菜活性成分的影響

2.2.1 薇菜總黃酮、總多酚釋放量

胃腸道是黃酮類物質(zhì)重要的分解代謝場(chǎng)所之一，在植物中黃酮大多與糖結(jié)合，以黃酮苷的形式存在，少部分以游離狀態(tài)存在本試驗(yàn)通過幾種蛋白酶的分解和pH的調(diào)節(jié)，并不能讓黃酮類物質(zhì)完全分解并釋放，但是，通過簡(jiǎn)易模擬也可以直觀的看出超微粉碎方法可以顯著增加薇菜黃酮的釋放量。由圖1可知，將兩種超微粉碎方法處理后的原料粉按照 1.3.3的方法進(jìn)行體外模擬胃腸道消化。結(jié)果表明：以常規(guī)粉碎方法為對(duì)照，通過行星球磨法、高壓均質(zhì)法消化后經(jīng)胃腸液消化薇菜總黃酮釋放量分別增加了 9.47 mg/g和8.24 mg/g，總多酚釋放量分別增加3.07 mg/g和3.23 mg/g。

圖1 薇菜超微粉總黃酮、總多酚釋放量Fig.1 Total flavonoids andTotal polyphenols release from Osmunda japonica Thunb

2.2.2 薇菜總黃酮、總多酚的生物利用率

圖2 薇菜總黃酮總多酚的生物利用率Fig.2 Bioavailability of total polyphenols and total flavonoids of Osmunda japonica Thunb

通過圖2可知，通過構(gòu)建一個(gè)簡(jiǎn)單的動(dòng)力學(xué)模型利用透析袋模擬體內(nèi)胃腸道消化吸收，研究超微粉碎對(duì)薇菜營養(yǎng)成分吸收利用的影響[23]。行星球磨法、高壓均質(zhì)法和常規(guī)粉碎后粉體的對(duì)總黃酮類物質(zhì)的生物利用率分別為18.83%、16.32%和12.74%，相比常規(guī)粉碎方法，行星球磨法和高壓均質(zhì)法的總黃酮生物利用率分別提高了 6.09%和3.58%；行星球磨法、高壓均質(zhì)法和常規(guī)粉碎后的對(duì)總多酚類物質(zhì)的生物利用率分別為19.93%、20.24%、13.52%，相比普通粉碎法，行星球磨法和高壓均質(zhì)法的總多酚生物利用率分別提高了6.41%、6.72%。通過SPSS進(jìn)行顯著性分析，所得結(jié)果表明：兩種超微粉碎方法的總黃酮和總多酚生物利用率相比常規(guī)薇菜粉均有顯著（p＜0.05）提升。

圖3 薇菜可溶性成分含量測(cè)定Fig.3 Determination of soluble components of Osmunda japonica Thunb

2.2.3 薇菜可溶性成分含量測(cè)定通過圖3可知通過兩種超微粉碎方法處理后可溶性蛋白、可溶性多糖較常規(guī)粉碎后的樣品釋放量均有提升，薇菜經(jīng)行星球磨法、高壓均質(zhì)法和常規(guī)粉碎處理后可溶性多糖分別為：2.73 g/100 mg、3.21 g/100 mg、2.35 g/100 mg；可溶性蛋白1.55 g/100 mg、2.47 g/100 mg、1.13 g/100 mg。相比常規(guī)粉碎，行星球磨法可溶性多糖和可溶性蛋白分別提高了 0.38 g/100 mg、0.42 g/100 mg；高壓均質(zhì)法提高了0.86 g/100 mg、1.34 g/100 mg。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)通過模擬體外腸道消化，測(cè)定薇菜總黃酮總多酚的釋放量、生物利用率及可溶性成分含量，并對(duì)超微粉碎后的物體物性進(jìn)行比較分析，考察超微粉碎對(duì)薇菜營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用的作用。結(jié)果表明：以常規(guī)粉碎（60目）為對(duì)照，行星球磨法和高壓均質(zhì)法粉碎后薇菜總黃酮的生物利用率分別提高了 6.09%、3.58%；總多酚的生物利用率分別提高了 6.41%和6.72%；總黃酮釋放量分別增加：16.47%、12.24%；總多酚釋放量分別增加：50.07%，50.08%。可溶性多糖提取量分別提高了16.17%、36.60%；可溶性蛋白分別提高：37.17%、118.58%。

3.2 初篩（60目）的薇菜粉體粒徑分別是行星球磨法和高壓均質(zhì)法粉碎后的47.77倍和60.92倍，粉體粒徑變小，比表面積增加，粉體膨脹力顯著（p＜0.05）降低，說明粉體內(nèi)部纖維被破壞，長鏈纖維減少短鏈增多，有利于活性成分溶出。

3.3 綜合分析發(fā)現(xiàn)，通過超微粉碎處理后薇菜粉體活性成分更有理由人體消化吸收，且超微粉碎是常溫物理生產(chǎn)工藝，通過此法破壁不僅有效提高提取量，而且無化學(xué)成分殘留，有利于食品加工安全，可為薇菜或其他原料粉體功能性成分加工提供試驗(yàn)參考依據(jù)。

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