佟碩秋，高 潔，鐘 杰，貢 獻，吳擁軍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

細(xì)胞色素P450(cytochromesP450) 加氧酶屬于血紅素硫蛋白基因超家族，在多種多樣的基質(zhì)反應(yīng)中負(fù)責(zé)內(nèi)生和外生底物的新陳代謝，包括甾類激素、膽汁酸、藥物等的合成[1-3]。細(xì)胞色素P450 廣泛存在于各種細(xì)菌、真菌、植物、動物中[4]。Frear[5]于1969 年首次在棉花(GossypiumhirsutumL.)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450s，隨后在其他多種植物中均發(fā)現(xiàn)該酶的存在，如擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)[6]、苜蓿(MedicagosativaL.)[7]、紅豆杉(RicinuscommunisL.)[8]等。細(xì)胞色素P450 在原核生物中為可溶性蛋白；在真核生物中為膜結(jié)合蛋白[9]。該酶的催化效果有環(huán)境依賴性，厭氧條件下能催化一些底物進行還原性代謝；耗氧條件下能活化氧氣，催化底物進行氧化性代謝[10-11]。

煙草(NicotianatabacumL.)是茄科屬植物，為國內(nèi)重要的經(jīng)濟作物之一，還是典型的轉(zhuǎn)基因模式生物，應(yīng)用于分子生物學(xué)和基因工程研究等。2013 年，謝敏敏等[12]利用煙草基因芯片與部分基因的 RT-PCR，發(fā)現(xiàn) 73 個煙草P450 基因，部分基因具有組織特異性。Wang 等[13]發(fā)現(xiàn)了一個煙草腺毛細(xì)胞色素P450 基因，采用反義和正義共抑制方法研究證實，經(jīng)過細(xì)胞色素P450 作用，CBT-ol 的第 6 位碳發(fā)生羥化反應(yīng)形成 α-CBT-diol 和 β-CBT-diol，將腺毛分泌成分西柏三烯一醇轉(zhuǎn)化為西柏三烯二醇，轉(zhuǎn)化煙草植株的抗蟲性有明顯的提高。

真核生物的功能基因在原核細(xì)胞中進行表達，受多種因素的影響，基因本身的性質(zhì)，所用載體和相應(yīng)的宿主細(xì)胞選擇對蛋白表達影響極大。因此，選用合適的載體與相對應(yīng)的宿主細(xì)胞是真核生物基因在原核生物中能否成功表達的關(guān)鍵。本文應(yīng)用 GenBank 數(shù)據(jù)庫中Nicotianabenthamianapolyphenol oxidase mRNA 序列設(shè)計了一對引物，成功從野生型煙草葉片中克隆出了CYP71 基因，再將CYP71 基因插入表達載體 pET-30a 構(gòu)建原核表達載體 pET-30a-CYP71，用 IPTG 誘導(dǎo) CYP71 蛋白質(zhì)的表達，并進行Western-blot檢測，擬通過CYP71 的高效表達獲得目的蛋白，達到其研究抗蟲性功能的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

野生煙草(Nicotianatabacum)新鮮幼葉組織。RNA prep pure Plant Kit 購于北京天根生化科技有限公司；Prime Script TM One Step RT-PCR Kit Ver．dNTPs、Hind III、NdeI、BamH I 、rTaq 酶、10 × PCR Buffer、T4 DNA 連接酶、pGEM-T 載體、pET-30a載體、pET-28a載體、pET-32a載體、Rosetta (DE3) 、DNA Maker、Protein Maker購于寶生物工程大連有限公司；E．Z．N．A．TM Gel Extraction Kit、E．Z．N．A．TM Plasmid Mini Kit I 購于美國 Omega 公司，其它相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自上海生工生物工程公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成

依據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫中Nicotianabenthamianapolyphenol oxidase mRNA 序列，應(yīng)用 DNAstar 軟件設(shè)計特異性引物，上游引物序列：5’- ATGCAACTGAGATTTGAAG -3’，下游引物序列為：5’-TTAACAATCGACAAGCTTAATCTC-3’，由寶生物工程大連有限公司合成，預(yù)擴增片段長1545 bp。

1.3 總RNA 提取及目的片段擴增

取生長 90 d 新鮮煙葉 100 mg，液氮研磨后提取總 RNA.瓊脂糖凝膠電泳檢測后，RT-PCR 擴增，體系為： 2×1 Step Buffer 25 μl，Prime Script 1 μl， Step Enzyme Mix 2 μl，10 μM 上下游引物均為 1 μl，RNA 模板小于 1 μg，ddH2O 補至 50 μl；反應(yīng)程序為 50℃ 反轉(zhuǎn)錄 30 min，95℃ 預(yù)變性 2 min； 95℃ 變性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 90 s， 30 次循環(huán)；72℃ 延伸 10 min，終止反應(yīng)。

1.4 基因克隆

膠回收純化 RT-PCR 產(chǎn)物，與 pGEM-T 載體連接后，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落擴大培養(yǎng)后菌落 PCR 和質(zhì)粒 PCR 驗證，陽性克隆菌液送至寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫對CYP71 基因的氨基酸序列進行BLAST 比對，繪制氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹。采用 ExPASy ProtParam 和 ProtScale 預(yù)測蛋白質(zhì)性質(zhì)，SOPMA 預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，SignalP4.0 與 TMHMM 預(yù)測蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.6 原核表達載體構(gòu)建

由于CYP71 含有跨膜區(qū)序列，利用 Max Codon TM Optimization Program (V13)對CYP71 蛋白氨基酸序列進行優(yōu)化，設(shè)計全長拼接引物，通過限制性酶切位點NdeI 和Hind III 將改造后的CYP71 基因插入到表達載體 pET-30a 中，構(gòu)建 pET-30a-CYP71 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 Rosetta (DE3) 中。提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，雙酶切體系：10×Buffer K 2 μl，NdeI、Hind III 各 1 μl，重組質(zhì)粒 10 μl，ddH2O 補至 20 μl，同時將含有重組質(zhì)粒的菌液送至寶生物工程大連有限公司測序。

1.7 工程菌的誘導(dǎo)和表達

參照張麗麗[14]文章中的方法，進行工程菌的誘導(dǎo)和表達，采用 Gel Image Analysis 分析表達量并進行 Western-blot 驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖 1)顯示，RT-PCR、菌落 PCR 與質(zhì)粒 PCR均在約1545 bp 處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致，說明目的基因已連接并轉(zhuǎn)化成功。將陽性質(zhì)粒送往生物公司測序，結(jié)果證實為目的片段。

M：DL2000 Maker；1：RT-PCR 擴增 CYP71；2：菌落 PCR 擴增CYP71；3：質(zhì)粒 PCR 擴增CYP71

2.2 煙草 CYP71 基因的同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果利用 DNAMAN 軟件分析得到長度為1545 bp 的 ORF，編碼 514 個氨基酸，起始密碼子和終止密碼子位于序列兩端，將基因序列提交至NCBI，獲得登錄號 KC480444.1。BLASTp 發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與其他植物的 NCED 氨基酸有較高的相似性，與辣椒達 100%(Capsicumannuum，XP 016570197.1)，與馬鈴薯(Solanumtuberosum，NP 006350393.1)的相似性為96%，與天仙子(Hyoscyamusalbus，BAN58140.1)的相似性為91%(圖 2)。

圖2 CYP71氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CYP71 sequences

2.3 蛋白質(zhì)性質(zhì)預(yù)測

采用 ExPASy ProtParam 和 ProtScale 預(yù)測蛋白質(zhì)性質(zhì)，該CYP71 蛋白由 514 個氨基酸組成，分子量為58.11 kda，理論等電點為 8.49，不穩(wěn)定系數(shù)：38.04，說明CYP71 為穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)為 97.67，屬于脂溶蛋白。

圖3 CYP71蛋白的疏水性分析Fig.3 Hydrophobic analysis of CYP71 proteins

2.4 CYP71 基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA 軟件預(yù)測該煙草CYP71 基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)表明，有 230 個氨基酸參與形成 α-螺旋(alpha helix)，占總氨基酸數(shù)的44.75%；有 46 個氨基酸參與形成 β-轉(zhuǎn)角(betaturn)，；71 個氨基酸參與形成延伸鏈(extended strand)，167 個氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲(random coil)。因此，該CYP71 基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)中含有豐富的 α-螺旋、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

2.5 CYP71蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用 SignalP4.0 與 TMHMM 分別對CYP71 蛋白分析表明，該蛋白含有信號肽，為分泌蛋白，具有信號肽識別功能，在序列 N 端 15-34，47-69 含有 2 個跨膜結(jié)構(gòu)域，1-15 位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)，70-514 位于細(xì)胞外側(cè)。

圖4 CYP71蛋白信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Signal peptide analysis of CYP71 protein

2.6 CYP71 原核蛋白表達

M： DL12000 Maker；1：重組質(zhì)粒雙酶切片段

M：SDS-PAGE Protein marker；1：對照；2：15℃ 誘導(dǎo)過夜CYP71蛋白；3：Western-blot CYP71 蛋白

雙酶切(圖 5)與蛋白表達結(jié)果(圖 6)表明，經(jīng)過優(yōu)化改造的CYP71 重組質(zhì)粒酶切后，出現(xiàn)1371 bp 與5400 bp 兩條條帶，與預(yù)期目的片段大小一致， 出現(xiàn)在49 kda 處的特異蛋白，與預(yù)期蛋白大小一致。證實重組質(zhì)粒pET-30a-CYP71 在 Rosetta (DE3) 中表達出 CYP71 蛋白，蛋白表達量為 1.90 μg/ml。

3 結(jié)論與討論

CYP450是目前植物中最大的酶家族[15]，僅擬南芥中就有 45 個家族[16]。目前幾乎所有已知的P450s都呈現(xiàn)類似的折疊結(jié)構(gòu)，蛋白序列大小平均在 500 個氨基酸殘基左右，并有不同程度的序列保守性，C-末端的血紅素結(jié)合區(qū)域(F××G×××C×G) 是該家族的高度保守的基元。

CYP71作為CYP450 家族的一部分，目前國內(nèi)關(guān)于該基因的相關(guān)研究較少。賀麗虹等[17]發(fā)現(xiàn)在苯丙烷代謝途徑中，CYP71通過參與脂肪族、芳香族碳的羥基化反應(yīng)等，影響黃酮、類黃酮、木質(zhì)素中間物的合成。羅熹等[18]發(fā)現(xiàn)煙草CYP71 與腺毛發(fā)育有關(guān)，并預(yù)測煙草腺毛中的二萜代謝路徑上西柏三烯醇在CYP71的催化作用下羥基化生成西柏三烯二醇(CBT-diol)。謝敏敏等[12]發(fā)現(xiàn)煙草中CYP71 有可能參與組成型的內(nèi)源生理代謝過程，但其基因功能與作用機理未見有相關(guān)報道。

CYP71 在 pET-28a 中目的蛋白不表達、 pET-32a中蛋白微量表達、 pET-30a 中蛋白少量表達，說明真核基因在原核細(xì)胞中表達受多種因素的影響。其中基因自身、載體及其宿主細(xì)胞對蛋白表達影響都很大。因此，提高目的蛋白表達量的策略應(yīng)該為：對目的基因序列進行優(yōu)化，去除跨膜信號肽和蛋白非必需氨基酸序列，對其密碼子偏嗜性進行改造，同時選擇適宜的表達載體。這些舉措與陳穩(wěn)等[19]的相關(guān)報道相符合。本研究首次實現(xiàn)煙草CYP71 基因在原核中的有效表達，為異源基因的表達提供了有力參考，為深入了解該基因在煙草中的功能提供了可能，為煙草的抗性研究提供了良好的理論基礎(chǔ)。

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