郭晴晴，鄭 康，趙雨坤，劉 學(xué)，邱雪梅，樊丹平，呂愛(ài)平，何小鵑＊＊

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京 100700；2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031；3.香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 香港 999077）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性、系統(tǒng)性的自身免疫疾病，特征為多關(guān)節(jié)、對(duì)稱(chēng)性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，多發(fā)于手、足小關(guān)節(jié)，常伴有關(guān)節(jié)外器官受累[1,2]。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人關(guān)節(jié)的主要病理特征表現(xiàn)為滑膜增生、關(guān)節(jié)腔變小、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的破壞等[3,4]。除了關(guān)節(jié)的病理變化，還會(huì)出現(xiàn)多種關(guān)節(jié)外病變，例如心臟病變、肺部病變、腎臟損害等[5]。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)病變一般只能致殘，致死罕見(jiàn)，但是關(guān)節(jié)外的損害有致死的可能。因此，全面了解類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)有利于我們對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎全貌的認(rèn)識(shí)，有利于避免誤診，早期治療，改善預(yù)后。

多種類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建立促進(jìn)了我們對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制及病理變化的研究和認(rèn)識(shí)，特別是對(duì)關(guān)節(jié)病理的研究，但是利用動(dòng)物模型研究類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)外病變的較少。小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型在臨床表現(xiàn)和病理機(jī)制等方面與人的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有很多相似之處，是研究類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制的較理想模型[6]。因此，我們采用牛II型膠原混合完全弗氏佐劑誘導(dǎo)DBA/1小鼠，觀察小鼠各個(gè)重要臟器的病理變化，以期觀察該模型是否可用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)外病變的研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只DBA/1小鼠，雄性，7-8周，18-22 g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，在恒溫（24±2）℃、光照周期12 h環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：完全弗氏佐劑（Chondrex，Lot：150034）、牛II型膠原（Chondrex，Lot∶140519）、Mayer蘇木素染色液（LEAGENE，Lot∶0911A15）、伊紅染色液（LEAGENE，Lot∶0810A15）、UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，Lot∶CA04KA4108）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)（Takara，Lot∶AK3401）、SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)（Takara，Lot∶AK7103）。

主要儀器：小型高速離心機(jī)（eppendorf，型號(hào)：Cen?trifuge 5430）、渦旋振蕩儀（其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：QL-902）、熒光定量PCR儀（Applied Biosys?tems，型號(hào)：ABI7500）、包埋機(jī)（Thermo Scientific，型號(hào)：Shandon Histocentre 3）、切片機(jī)（Thermo Scientific，型號(hào)：Shandon Finesse ME+）、展片機(jī)（Thermo Scientific，型號(hào)：Tissue Flotation Bath）、烤片機(jī)（Thermo Scientific，型號(hào)：Hotplate）、正置生物顯微鏡（LEICA，型號(hào)：DM6000B）、微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，型號(hào)：Nanodrop 2000）。

1.3 引物合成及序列

TGF-β1、TNF-α及內(nèi)參基因GAPDH的上下游引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成。TGF-β1 上游引物：5′-ATTGGCCAGCATCCATCTCTTG-3′，下游引物：5′-TGCCACCATCATAGACTAG?ATTC-3′；TNF-α上游引物：5′-AGGCACTCCCCCAA AAGAT-3′，下游引物：5′-CAGTAGACAGAAGAGCGT?GGTG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGCCGGTGCTGAG?TATGTC-3′，下游引物：5′-TGCCTGCTTCACCACCTT CT-3′。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的制備

將DBA/1小鼠隨機(jī)分成2組，分別為正常對(duì)照組和模型組，每組10只。模型組小鼠按以下方法造模：濃度為2 mg·mL-1的牛Ⅱ型膠原溶液和完全弗氏佐劑以1∶1（體積比）的比例混合，將牛Ⅱ型膠原逐滴加入完全弗氏佐劑中，整個(gè)過(guò)程在冰浴中進(jìn)行，邊滴邊用勻漿器乳化，每轉(zhuǎn)3 min，停止1 min，直至將乳化劑滴至水中，若不擴(kuò)散說(shuō)明已充分乳化。乳化劑需現(xiàn)用現(xiàn)配，Day 0于尾根部皮內(nèi)注射，100 μL/只，Day 21用同樣的方法加強(qiáng)免疫[7]。

2.2 關(guān)節(jié)炎評(píng)分

造模后每周進(jìn)行一次關(guān)節(jié)炎評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分=無(wú)紅腫；1分=小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分=趾關(guān)節(jié)和小趾關(guān)節(jié)腫脹；3分=踝關(guān)節(jié)以下部位腫脹；4分=整個(gè)足爪腫脹（包含踝關(guān)節(jié)）。每次記錄小鼠四肢的評(píng)分，累計(jì)最高評(píng)分為16分[8]。

2.3 病理學(xué)觀察

于Day63處死小鼠，分離心、肝、脾、肺、腎和踝關(guān)節(jié)。將臟器置于10%福爾馬林緩沖液中固定，將踝關(guān)節(jié)剔除周?chē)浗M織后置于4%多聚甲醛中固定。踝關(guān)節(jié)固定48 h后，置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣，以1 mL注射器針頭能刺入關(guān)節(jié)骨內(nèi)為脫鈣完全。將脫鈣好的踝關(guān)節(jié)用不同濃度的梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，石蠟包埋，制作病理切片（4 μm），經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色后，顯微鏡下觀察各組織病理學(xué)變化。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平

按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取小鼠肺總RNA，使用Nanodrop 2000測(cè)量RNA的純度和濃度。按照Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒中的說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-time PCR按照SYBR?Premix Ex Taq?II(Tli RNase H Plus)試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 30 sec，（95℃ 5 sec，60℃ 40 sec）×45個(gè)循環(huán)，95℃15 sec，60℃1 min，95℃15 sec。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 CIA小鼠體征觀察情況

DBA/1小鼠造模成功后，毛發(fā)逐漸失去光澤，前肢、后肢陸續(xù)出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，功能障礙，活動(dòng)減少，體重下降，Day42-63為腫脹高峰期，發(fā)病率達(dá)100%。圖1為正常小鼠和CIA發(fā)病小鼠的關(guān)節(jié)比較圖。

3.2 CIA小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分結(jié)果

CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分見(jiàn)圖2，分析可知，小鼠于Day28左右開(kāi)始發(fā)病，然后關(guān)節(jié)炎評(píng)分逐漸增高，Day42-63為疾病高峰期，最高評(píng)分可達(dá)12分。

3.3 CIA小鼠踝關(guān)節(jié)和心、肝、脾、肺、腎的組織病理變化

3.3.1 踝關(guān)節(jié)病理表現(xiàn)

圖1 正常小鼠和CIA發(fā)病小鼠的關(guān)節(jié)比較圖

圖2 CIA小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分

正常小鼠和CIA小鼠的踝關(guān)節(jié)HE染色病理圖見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示：正常小鼠的踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，關(guān)節(jié)腔內(nèi)干凈，關(guān)節(jié)表面光滑平整，滑膜細(xì)胞1-2層，排列整齊，軟骨和骨非常完整。CIA小鼠的踝關(guān)節(jié)可見(jiàn)滑膜增生，關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，有關(guān)節(jié)腔積液，大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成，軟骨和軟骨下骨均有侵蝕現(xiàn)象。

3.3.2 心臟病理學(xué)表現(xiàn)

正常小鼠和CIA小鼠的心臟HE染色病理圖見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示：正常小鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維細(xì)長(zhǎng)，呈圓柱形，心肌纖維間有少量的結(jié)締組織。CIA小鼠的心臟病理結(jié)果和正常小鼠的相似，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的病理變化。

3.3.3 肝臟病理學(xué)表現(xiàn)

正常小鼠和CIA小鼠的肝臟HE染色病理圖見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示：正常小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。CIA小鼠的肝臟未出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。

3.3.4 脾臟病理學(xué)表現(xiàn)

正常小鼠和CIA小鼠的脾臟HE染色病理圖見(jiàn)圖6，結(jié)果表明：正常小鼠的脾臟結(jié)構(gòu)特征清晰完整，白髓和紅髓的界限比較明顯，能清楚的看到淋巴小結(jié)中央動(dòng)脈以及動(dòng)脈周?chē)牧馨颓剩馨图?xì)胞密集。CIA小鼠的脾臟沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。

3.3.5 肺臟病理學(xué)表現(xiàn)

正常小鼠和CIA小鼠的肺臟HE染色病理圖見(jiàn)圖7，結(jié)果顯示：正常小鼠的肺組織中肺泡的結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡腔和支氣管腔非常干凈，有少量的紅細(xì)胞。CIA小鼠的肺部有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，肺泡腔中有炎性浸出物，部分肺泡變小。

圖3 小鼠踝關(guān)節(jié)的HE染色圖（×200）

圖4 小鼠心臟的HE染色圖（×200）

圖5 小鼠肝臟的HE染色圖（×400）

圖6 小鼠脾臟的HE染色圖（×400）

圖7 小鼠肺臟的HE染色圖（×200）

3.3.6 腎臟病理學(xué)表現(xiàn)

圖8 小鼠腎臟的HE染色圖（×400）

圖9 小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA表達(dá)水平

正常小鼠和CIA小鼠的腎臟HE染色病理圖見(jiàn)圖8，結(jié)果顯示：正常小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)正常，有皮質(zhì)和髓質(zhì)之分，可見(jiàn)大量的泌尿小管，以及由少量結(jié)締組織、血管、神經(jīng)等構(gòu)成的腎間質(zhì)，腎小管上皮細(xì)胞完好。CIA小鼠的腎臟未見(jiàn)明顯的病理變化。

3.4 小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA表達(dá)水平

由圖9可知，模型組小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平明顯高于正常組小鼠的肺組織（P＜0.01）。

4 討論

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作為以滑膜炎和關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性疾病，經(jīng)常伴有一些關(guān)節(jié)外損害[9]。本文采用牛II型膠原混合完全弗氏佐劑誘導(dǎo)DBA/1小鼠，成功建立了小鼠CIA模型，并觀察小鼠各個(gè)重要臟器的病理變化，以期觀察該模型是否存在關(guān)節(jié)外的并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，造模成功的DBA/1小鼠除肺部有明顯病變外，肝、心、脾、腎未出現(xiàn)明顯的病理變化。

據(jù)臨床觀察及文獻(xiàn)報(bào)道，肺臟是RA患者除關(guān)節(jié)外最易受累的器官，這與肺內(nèi)部豐富的結(jié)締組織及血液供應(yīng)有很大關(guān)系。RA的肺部并發(fā)癥包括肺間質(zhì)病變、細(xì)支氣管炎、慢性支氣管擴(kuò)張、胸腔積液、類(lèi)風(fēng)濕結(jié)節(jié)等[1]。RA并發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病在RA患者死因中位居第二位，且近年來(lái)其死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，其中由于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎間質(zhì)性肺?。≧A-ILD）引起的肺泡炎性肺纖維化是其死亡的直接或間接原因[10]。RA-ILD的高死亡率是由于肺部病變?cè)缙诎Y狀不明顯易被忽略，晚期出現(xiàn)癥狀后預(yù)后差[11]。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療RA合并肺部并發(fā)癥有重要意義。

間質(zhì)性肺病早期肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生急性肺泡炎，炎癥和免疫效應(yīng)細(xì)胞不斷增生、募集與活化，隨著病情發(fā)展，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)膠原紊亂，大量纖維組織增生，肺泡隔被破壞，形成囊性化，病變不可逆[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠的肺部出現(xiàn)明顯的炎性病變，肺間質(zhì)內(nèi)有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，肺泡腔中有炎性浸出物，這與RA肺部并發(fā)癥的病理變化有相似之處。

RA-ILD的發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞、細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)等因素的相互作用有關(guān)，過(guò)程復(fù)雜，仍有待進(jìn)一步闡明[13]。據(jù)報(bào)道，肺富含TGF-β，誘導(dǎo)TGF-β活性高表達(dá)是肺間質(zhì)纖維化進(jìn)程啟動(dòng)的重要因素之一[14,15]。此外，TNF-α等細(xì)胞因子可刺激肺內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，進(jìn)而損傷肺組織，形成肺間質(zhì)纖維化[16,17]。本研究采用Real-time PCR法分別檢測(cè)病變的CIA小鼠肺組織和正常的肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)病變肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平顯著高于正常肺組織。

綜上所述，膠原誘導(dǎo)的DBA/1小鼠的肺部病變與RA肺部并發(fā)癥的病理變化及發(fā)病機(jī)制有相似之處，可以利用該模型進(jìn)行RA肺部受累的研究，有利于通過(guò)動(dòng)物模型進(jìn)行深入的機(jī)制研究和藥效研究。

1 Gauhar U A,Gaffo A L,Alarcón G S.Pulmonary manifestations of rheu?matoid arthritis.Semin Respir Crit Care Med.2007,28(4):430-440.

2 Chen G,Lu C,Zha Q,et al.,A network-based analysis of traditional Chinese medicine cold and hot patterns in rheumatoid arthritis.Comple?ment Ther Med.2012,20(1-2):23-30.

3 Brzustewicz E,Bryl E.The role of cytokines in the pathogenesis of rheu?matoid arthritis-Practical and potential application of cytokines as bio?markers and targets of personalized therapy.Cytokine.2015,76(2):527-36.

4 趙建平,馮振宇,孟霜,等.風(fēng)濕寧膠囊對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠Th17/Treg平衡和局部炎性因子的影響.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化.2015,17(8):1656-1663.

5 縱瑞凱,劉健.類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)外病變研究進(jìn)展.中醫(yī)藥臨床雜志.2010,22(9):833-835.

6 周茹,楊以阜,左建平.Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建立及影響因素.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào).2006,22(12):1532-1535.

7 Gonzalo-Gil E,Pérez-Lorenzo MJ,Galindo M,et al.Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells ameliorate collagen-in?duced arthritis by inducing host-derived indoleamine 2,3 dioxygenase.Arthritis Res Ther.2016,18:77-86.

8 Bashi T,Shovman O,Fridkin M,et al.Novel therapeutic compound tuft?sin-phosphorylcholine attenuates collagen-induced arthritis.Clin Exp Immunol.2016,184(1):19-28.

9 Turesson C.Extra-articular rheumatoid arthritis.Curr Opin Rheumatol.2013,25(3):360-366.

10 Bongartz T,Nannini C,Medina-Velasquez Y F,et al.Incidence and mortality of interstitial lung disease in rheumatoid arthritis:a popula?tion-basedstudy.Arthritis Rheum.2010,62(6):1583-1591.

11 Yang J A,Lee J S,Park J K,et al.Clinical characteristics associated with occurrence and poor prognosis of interstitial lung disease in rheu?matoid arthritis.Korean J Intern Med.2017,28.doi:10.3904/kjim.2016.349.

12樊任珠.痹痛靈顆粒對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜及肺部病變血管新生影響的研究.南京:南京中醫(yī)藥大學(xué).2011.

13 Cavagna L,Monti S,Grosso V,et al.The multifaceted aspects of intersti?tial lung disease in rheumatoid arthritis.Biomed Res Int.2013,2013：759-760.doi:10.1155/2013/759760.

14 Chu H,Shi Y,Jiang S,et al.Treatment effects of the traditional Chinese medicine Shenks in bleomycin-induced lung fibrosis through regulation of TGF-beta/Smad3 signaling and oxidative stress.Sci Rep.2017,7(1)：2252.

15 Luo Y,Xu W,Chen H,et al.A novel profibrotic mechanism mediated b TGFβ-stimulated collagen prolyl hydroxylase expression in fibrotic lung mesenchymal cells.J Pathol.2015,236(3):384-394.

16 Redente E F,Keith R C,Janssen W,et al.Tumor necrosis factor-αac?celerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by tar?geting profibrotic lung macrophages.Am J Respir Cell Mol Biol.2014,50(4):825-837.

17 Colomb F,Krzewinski-Recchi M A,Steenackers A,et al.TNF up-regu?lates ST3GAL4 and sialyl-Lewisx expression in lung epithelial cells through an intronic ATF2-responsive element.Biochem J.2017,474(1):65-78.