朱榮榮，李 玲，王 靖，張莉莉，王 琪，王 冰，張偉榮

（上海中醫(yī)藥大學中藥學院教學實驗中心 上海 201203）

冠心?。–oronary heart disease,CHD）是造成世界死亡的主要原因之一[1]。根據(jù)WHO，截至2008年，世界范圍內(nèi)7 254 000例死亡由冠心病造成[2]。冠心病是冠狀動脈粥樣硬化或（和）功能性改變致使血管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。缺血再灌注造成的心肌損傷是冠狀動脈疾病原發(fā)性病理表現(xiàn)的原因[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療的不良反應、復發(fā)率及致死率居高不下；而中醫(yī)藥從整體的觀點出發(fā)，辨證施治，通過補氣活血[4]等方法，可克服現(xiàn)代醫(yī)學治療的不足。

中藥復方心脈通為臨床多年應用的有效驗方，全方由君藥茶樹根，臣藥益母草，以及三七、川芎、瓜蔞五味藥材組成，具有強心利尿，活血化瘀，開胸散結之功效，臨床上用于治療冠心病心肌缺血，效果明確。為了克服傳統(tǒng)湯劑單次口服劑量大、服用與攜帶不便的缺點，擬將本處方制備成便于攜帶、保存與服用的顆粒劑。本文采用正交試驗優(yōu)化復方水提工藝，以單因素實驗初步考察顆粒劑成型工藝，并測定顆粒劑中主要有效成分的含量，對顆粒劑中有關藥材進行薄層鑒別并檢查顆粒劑的粒度、水分、溶化性。通過復方提取優(yōu)化及顆粒劑主要輔料篩選實驗，本文將為后續(xù)心脈通復方藥效研究提供提取物制備工藝，為制劑工藝優(yōu)選實驗提供輔料選擇的前期數(shù)據(jù)，并為該復方新藥的開發(fā)及應用提供一定依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Cary 8454紫外-可見分光光度計（安捷倫科技有限公司）；JH202電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；X105BDU梅特勒-托利多電子精密天平（北京歐信勝科技有限公司）；ZNHW-II型2000毫升電熱套（鞏義市予華有限責任公司）；TDL-50B離心機（上海精密儀器儀表有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；IKA?Vortex 3型圓周振蕩器（上海萊貝科學儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥材

原花青素對照品（批號：wkq16051402，四川省維克奇生物科技有限公司）；鹽酸水蘇堿對照品（批號：16072510，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司）；人參皂苷Rg1（批號：22427-39-0，上海詩丹德生物技術有限公司）；阿魏酸（批號：1135-24-6，上海詩丹德生物技術有限公司）；乳糖、可溶性淀粉、糊精（玉米）、聚乙烯吡咯烷酮K-30等輔料與甲醇、乙醚、硫酸、鹽酸、95%乙醇等試劑為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水為實驗室自制。

茶樹根為山茶科山茶屬植物茶Camellia sinensis(L.)O.Kuntze的干燥根。益母草為唇形科植物益母草Leonurus Japonicus Houtt.的干燥地上全草。三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥根。川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的根莖。瓜蔞為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥成熟果實。藥材飲片均購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰尽?/p>

2 實驗方法

2.1 正交試驗優(yōu)化復方水提工藝

2.1.1 吸水率測定

稱取茶樹根、益母草等1倍處方量的藥材，稱重，加8倍量的水浸泡90 min使透心，濾去藥材表面的水后，稱重并計算增加的質(zhì)量占總藥材質(zhì)量的比例，平行3次，經(jīng)計算吸水率為91.96%（n=3，RSD=1.0%）。因此，在后續(xù)浸泡時，按藥材吸水率補足加水總量。

2.1.2 正交實驗優(yōu)化提取工藝

選擇正交試驗考察復方水提工藝，采用L9(34)正交試驗表，對加水量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）三個因素進行考察，各因素水平設計見表1。稱取1倍處方量飲片，按正交試驗設計方案，加水（補足吸水量）浸泡90 min，煎煮，過濾，合并提取液，離心（4 000 rpm，10 min）取上清液，結合有關文獻[5-9]，采用80℃減壓真空濃縮，濃縮液加蒸餾水定容至1 g生藥·mL-1，作為樣品溶液。用UV法測定君藥茶樹根有效成分原花青素、臣藥益母草有效成分總生物堿的含量，對原花青素含量、總生物堿含量、干膏得率三個指標進行綜合評分，得到復方最優(yōu)水提工藝。取最優(yōu)處方水提工藝條件進行驗證試驗。

表1 因素水平表

2.2 顆粒劑成型工藝考察

參考有關文獻[10]，結合預實驗結果，以顆粒劑的成品率與外觀性狀為指標，對稀釋劑的種類、用量以及粘合劑的濃度進行考察。

2.2.1 稀釋劑考察

按最優(yōu)水提工藝提取該復方，于80℃減壓濃縮藥液濃度至約1 g生藥·mL-1，60℃真空干燥，粉碎，過100目篩，備用。取等質(zhì)量干浸膏粉若干份，加入不同比例的乳糖、可溶性淀粉或糊精等常用稀釋劑，再加入0.2 mL·g-1的乙醇溶液潤濕與分散物料，加入0.2 mL·g-1的5%PVP乙醇溶液制軟材，以12目篩制粒。濕顆粒于60℃干燥1 h，以12目篩整粒，即得。

2.2.2 粘合劑考察

該復方浸膏粉易于吸濕，預實驗表明乙醇溶液無法誘發(fā)干浸膏粉產(chǎn)生適合制軟材、制粒的適宜粘性，而采用5%PVP的乙醇溶液制粒效果較好。因此，對不同濃度的PVP乙醇溶液對軟材制備與顆粒成型性的影響進行考察。取等質(zhì)量干浸膏粉3份，加入篩選的稀釋劑，加入0.2 mL·g-1的乙醇潤濕物料，再分別加入0.2 mL·g-1的10%PVP乙醇溶液、5%PVP乙醇溶液及95%乙醇溶液作為粘合劑按照2.2.1中的方法制粒、干燥、整粒，即得。

2.3 顆粒劑的質(zhì)量評價

2.3.1 含量測定方法

（1）原花青素的含量測定

取原花青素標準品約5 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲至完全溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻得原花青素對照品溶液[11]。精密移取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。以甲醇為空白對照，于280 nm處測吸光度A。以質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為：

取樣品溶液適量，離心（4000 rpm，10 min），精密移取上清液0.15 mL，80℃水浴蒸干，精密加入5 mL甲醇，超聲20 min（功率250 W，頻率40 kHz），離心（4 000 rpm，10 min），取上清液用甲醇定容至50 mL，即得。以甲醇為空白對照，于280 nm處測吸光度A，代入標準曲線，計算復方中原花青素的含量。

分別取3批顆粒劑各約0.3 g，精密稱定，加入甲醇10 mL超聲20 min，離心（4 000 rpm，10 min），重復提取3次，合并上清液至50 mL容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，精密吸取溶液1 mL，以甲醇定容至10 mL，即得供試品溶液。按照2.1.3項下的原花青素含量測定方法，測吸光度A，代入標準曲線，計算顆粒劑中原花青素含量。

（2）總生物堿的含量測定

益母草取鹽酸水蘇堿標準品約5 mg，精密稱定，置于10 mL棕色容量瓶中，加入0.1 mol·L-1的鹽酸溶液適量，超聲至溶解完全，繼續(xù)加入0.1 mol·L-1的鹽酸溶液至刻度線，搖勻，得鹽酸水蘇堿對照品溶液[11]。精密加入對照品溶液0，0.2，0.4，0.8，1.6，2.4 mL置于25 mL容量瓶，再依次精密加入2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，以0.1 mol·L-1的鹽酸溶液定容至刻度線，搖勻，置暗處冰浴1 h，濾過，取續(xù)濾液，以0.1 mol·L-1的鹽酸溶液為空白，在525 nm處測定吸光度。以空白試劑吸光度減去各對照品溶液的吸光度得△A，以質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標，△A為縱坐標繪制標準曲線?；貧w方程為Y=2.9×10-3X-4.6× 10-3，r=0.9939，線性范圍0-56.064 μg·mL-1。精密移取樣品溶液1 mL至干燥蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干，60℃真空干燥，得干膏。加入70%乙醇5 mL溶解干膏，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，再以70%乙醇5 mL潤洗蒸發(fā)皿并合并入離心管內(nèi)，超聲（功率250 W，頻率 40 kHz）提取20 min，離心（4 000 rpm，10 min），吸取上清液，向沉淀物中加入10 mL新鮮溶劑再重復提取2次。合并提取液，水浴蒸干，得殘渣。以20 mL的 0.1 mol·L-1的鹽酸溶液溶解殘渣并洗滌容器，洗滌液轉(zhuǎn)入25 mL錐形瓶中，加入活性炭0.5 g，沸水浴30 min，冷卻至室溫，過濾至25 mL棕色容量瓶中。以少量 0.1 mol·L-1鹽酸溶液洗滌燒杯與濾器，洗滌液合并入容量瓶中。按上述方法測定吸光度并計算△A，帶入標準曲線計算復方中益母草總生物堿的含量。

2.3.2 薄層色譜鑒別

（1）三七藥材薄層色譜鑒別

取人參皂苷Rg1適量，加甲醇制制含人參皂苷Rg1濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液。取三七對照藥材適量，加甲醇25 mL超聲15 min，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得對照藥材溶液。取復方顆粒劑與缺三七陰性顆粒劑適量，同法制得供試品溶液與陰性樣品溶液。

分別取對照品溶液、藥材溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液2 μL，2 μL，8 μL，8 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液展開。待展開完全后取出。晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液（1→10），立即于105℃加熱至斑點顯色清晰[13]。

（2）川芎藥材薄層色譜鑒別

取阿魏酸適量，加甲醇配制含阿魏酸1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。取川芎對照藥材適量，加0.1 mol·L-1的鹽酸溶液10 mL溶解，以乙醚提取3次，每次30 mL。合并乙醚層，蒸干，殘渣加乙醇溶解得對照藥材溶液。取復方顆粒與缺川芎陰性顆粒劑，同法制得供試品溶液與陰性樣品溶液。

分別取上述四種溶液2 μL，4 μL，10 μL，10 μL，點于同一硅膠GF254薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（6∶1∶0.5）展開，展開完全后取出，晾干，置紫外光365 nm與254 nm下檢視[14]。

2.3.3 檢查

參照2015版《中國藥典》第四部通則（0104顆粒劑）項下的相關規(guī)定[15]，取3批復方顆粒劑分別進行性狀、粒度、水分、溶化性等有關檢查。

3 結果與討論

3.1 復方的提取工藝

茶樹根為方中君藥，具有強心利尿、抗菌消炎、收斂止瀉的功效，臨床上用于治療風濕性、高血壓性及肺原性心臟病，冠心病，心律不齊等疾病[16]。研究表明[17]，原花青素具有抗氧化和消除自由基的生理活性與抗高血壓、內(nèi)皮依賴性血管舒張活性、抗缺血-再灌注損傷等作用。益母草為臣藥，總生物堿是益母草抗心肌缺血的有效部位之一[18]。故將原花青素與總生物堿的含量作為水提工藝優(yōu)選的指標。

該復方在臨床上以煎湯劑的形式服用，醇沉操作可能造成有效成分的損失，為保證與臨床使用方式一致，采用水提法進行提取。本研究采用正交試驗優(yōu)選水提工藝，采用單因素實驗篩選制劑成型工藝，并采用綜合評分的方法以做出客觀、全面的評價。直觀分析結果見表2，方差分析見表3。

各因素對水提工藝的影響順序為C＞B＞A，最佳工藝搭配為A2B2C2。其中因素B、C對提取效果有顯著性影響（P＜0.05），因素A對提取效果則無顯著性影響，見表3。結合生產(chǎn)成本考慮，確定最佳水提工藝為A1B2C2，即加8倍量水，提取2次，每次1.5 h。

取1倍處方量藥材共3份，按所優(yōu)選的水提工藝條件進行驗證實驗，3批樣品中平均原花青素含量為21.81 mg·g-1（RSD=4.3%），平均總生物堿含量為345.36 μg·g-1（RSD=2.9%），平均干膏得率為17.25%（RSD=1.3%）。結果表明，所確定的提取工藝穩(wěn)定可行、重復性較好。

表2 正交試驗統(tǒng)計結果及極差分析

表3 正交試驗方差分析表

3.2 顆粒劑的成型性考察

本方臨床用藥劑量較大，浸膏得率較高（17.25%），服用量較大（1倍處方得膏9.5 g），將其制成顆粒劑以外的劑型難度較大，因此將本方制成顆粒劑。中藥濕法制粒傳統(tǒng)的稀釋劑有糖粉、糊精、淀粉[19]，其中糖粉有明顯吸濕性，會干擾某些藥物成分，降低療效，而且使許多老年和糖尿病患者用藥受到限制[20]；淀粉水溶性較差，不適合作為顆粒劑的稀釋劑。而新開發(fā)的優(yōu)良稀釋劑乳糖、甘露醇、木糖醇等，由于其來源有限、價格較高等原因，目前使用還不太廣泛。實驗結果顯示，以乳糖和可溶性淀粉為稀釋劑制得的軟材過粘，顆粒吸濕性強，尤其是乳糖，所制顆粒明顯粘結成塊。根據(jù)表4中的1-3號實驗結果，選用吸濕性小、可溶于熱水、價格低廉的玉米糊精作為稀釋劑；3-5號實驗結果，確定干浸膏粉與糊精的最佳質(zhì)量比為1∶1。預試驗確定潤濕劑為0.2 mL·g-1的乙醇溶液，根據(jù)表4中5-7號實驗結果，確定粘合劑為0.2 mL·g-1的5%PVP乙醇溶液。

表4 心脈通顆粒的成型工藝研究(n=2)

按照上述篩選結果，顆粒劑處方及制備工藝為：稱取1份糊精，加入1份浸膏粉，充分混合，加入0.2 mL·g-1的乙醇溶液潤濕與分散物料，加入0.2 mL·g-1的5%PVP乙醇溶液制粒，60℃干燥1 h，以12目篩整粒，即得。

3.3 顆粒劑質(zhì)量評價

3.3.1 茶樹根中原花青素含量測定

以最優(yōu)工藝制備得的顆粒劑中的原花青素含量，結果見表5。

表5 心脈通顆粒中原花青素的含量(n=3)

3.3.2 三七與川芎藥材的薄層色譜鑒別

三七成分供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾，結果見圖1。川芎成分供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的藍色斑點，陰性樣品無干擾，結果見圖2。

復方水提物不同于單味藥材，脂溶性成分含量少，其薄層鑒別如完全按照藥典中單味藥材的方法就有可能不能復現(xiàn)。由于薄層鑒別是為了確認復方中的是否投入待鑒別藥材，因此使用藥材中專屬性較強的成分及對照藥材對復方顆粒進行控制即可。2015版《中國藥典》在三七的薄層鑒別中采用的顯色劑為10%的硫酸水溶液，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)該溶液粘度較低，霧化效果不佳；按照有關文獻更換顯色劑為（10%的硫酸乙醇溶液）與展開劑[氯仿-甲醇-水（13:7:2）10℃以下放置的下層溶液]后，顯色效果較好，斑點圓整清晰。2015版《中國藥典》在川芎的薄層鑒別中所使用的對照品為歐當歸內(nèi)酯A，提取方法為乙醚回流提取，該成分在水提物中無法鑒別出。結合有關文獻的報道，改用0.1 mol·L-1鹽酸酸化后乙醚提取，使用對照品阿魏酸，能夠順利對水提物中的川芎藥材進行鑒別。

圖1 在日光（A）和紫外光365 nm（B）條件下三七的薄層色譜圖

圖2 在紫外光365 nm（A）和254 nm（B）條件下川芎的薄層色譜圖

表6 心脈通顆粒檢查項結果(n=3)

3.3.3 檢查項

以最優(yōu)工藝制備得的顆粒劑的水分、溶化性、粒度等指標均符合2015版《中國藥典》第四部通則項下的相關規(guī)定，結果見表6。

經(jīng)實驗研究，本文的臨床驗方的最優(yōu)提取工藝為：取處方量藥材，加8倍量水（按吸水率補足吸水量），提取2次，每次提取1.5 h，過濾，合并水提液，于80℃濃縮，于60℃真空干燥，得干浸膏。將干浸膏粉碎，過100目篩，加入1份玉米糊精，充分混勻，加入0.2 mL·g-1的乙醇潤濕，再加入0.2 mL·g-1的5%PVP乙醇溶液制粒，60℃干燥，12目篩整粒，即得。所得顆粒外觀較好，粒度、水分、溶化性均符合2015年版《中國藥典》第四部制劑通則有關規(guī)定。按照處方量計算，復方顆粒的服用劑量為18.78 g·天-1。

4 結論

本文將臨床治療冠心病心肌缺血的有效驗方，通過水提工藝優(yōu)化、濕法制粒技術制備為顆粒劑，不僅解決了湯劑煎煮不便的問題，而且為后續(xù)動物藥效試驗提供了原料制備工藝，為顆粒劑處方及工藝參數(shù)的優(yōu)選、質(zhì)量標準研究、穩(wěn)定性考察等提供前期研究數(shù)據(jù)，并為本復方后期的新藥研發(fā)提供借鑒。

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