任德強(qiáng)，張立恒，宋新剛

（哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025）

豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)是引發(fā)豬細(xì)小病毒病的病原體，可引起胚胎的感染、死亡，母豬不表現(xiàn)比較明顯臨床癥狀的繁殖障礙性疾病。目前接種疫苗仍是解決本病的最好方案。為生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的疫苗，需要摸索PPV毒株在不同細(xì)胞系上的增殖情況，如不能掌握其規(guī)律，生產(chǎn)出足夠的抗原，將難以用于生產(chǎn)。PPV只能在豬的細(xì)胞和人的某些傳代細(xì)胞中增殖，且在不同細(xì)胞上的生物學(xué)特性也不盡相同。通過培養(yǎng)比較，獲得培養(yǎng)該病毒滴度高、病變明顯的細(xì)胞及培養(yǎng)條件，為生產(chǎn)高水平疫苗提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病 毒 PPV H株，實(shí)驗(yàn)室鑒定、保管和供應(yīng)，經(jīng)PK15細(xì)胞增殖，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細(xì) 胞 ST傳代細(xì)胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；PK15細(xì)胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；豬睪丸、豬腎原代細(xì)胞取自初生健康仔豬，無菌取睪丸、腎，按常規(guī)方法消化，制備原代細(xì)胞。

1.1.3 培養(yǎng)基與胰酶 購自GIBCO公司；新生牛血清（NBCS）購自GIBCO公司；胰酶(1：250為GIBCO公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱 (HF240型)，HealForce公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning公司；倒置顯微鏡(TS100)，Nikon 公司。

1.2 方 法

1.2.1 病毒增殖 待細(xì)胞長至30%～50%單層時(shí)，棄去營養(yǎng)液，將毒種接種至試驗(yàn)細(xì)胞，吸附1h，換含2%血清的維持液至病毒收獲。并同時(shí)設(shè)未接毒對照細(xì)胞，至37℃ 5%CO2培養(yǎng)。每天觀察并記錄CPE情況，當(dāng)70%～80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，凍融3次，-70℃冰柜保存?zhèn)溆?，按此方法試?yàn)3次。

1.2.2 HA測定 紅細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法用pH7.2 PBS配成0.6%豚鼠紅細(xì)胞懸液備用。測定以上4種細(xì)胞培養(yǎng)的病毒液的血凝價(jià)。

1.2.3 TCID50測定 96孔微量培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液100μL，將待測病毒液分別作 10-1～10-7倍梯度稀釋，每稀釋度6孔，每孔加入不同稀釋度的病毒液 100mL，細(xì)胞對照組加100μL細(xì)胞稀釋液。置37℃ 5%CO2培養(yǎng)，逐日記錄CPE出現(xiàn)孔，觀察到120h，按Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病變情況

PPV-H株接種ST細(xì)胞后24h開始出現(xiàn)病變，細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性顆粒，36h空斑明顯增多，48h左右，細(xì)胞出現(xiàn)空斑、拉網(wǎng)、脫落現(xiàn)象。CPE可達(dá)80%左右，而同時(shí)對照組細(xì)胞未出現(xiàn)CPE。PPV-H株接種PK15細(xì)胞后24h開始出現(xiàn)病變，細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性顆粒，40h空斑明顯增多，60h左右，細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、脫落現(xiàn)象。CPE可達(dá)80%左右，而同時(shí)對照組細(xì)胞未出現(xiàn)CPE。PPV-H株接種豬睪丸、豬腎原代細(xì)胞后24h開始出現(xiàn)病變，細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性顆粒，48h左右，細(xì)胞出現(xiàn)空斑、拉網(wǎng)、脫落現(xiàn)象。72h CPE可達(dá)80%左右，而同時(shí)對照組細(xì)胞未出現(xiàn)CPE。

2.2 病毒滴度與血凝價(jià)測定結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 PPV H株在不同細(xì)胞上增殖的TCID50和HA

3 討論與結(jié)論

PPV可在多種細(xì)胞上生長并導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生CPE。本研究采用ST、PK15、豬睪丸和豬腎原代細(xì)胞增殖該病毒，找到病毒在細(xì)胞上的病變特性和規(guī)律，確定收毒最佳時(shí)機(jī)，比較其增殖能力，對疫苗研制和生產(chǎn)起著極重要作用，為該病防控奠定基礎(chǔ)。

血凝試驗(yàn)是病毒鑒定和血清學(xué)分析的常用手段。PPV對豚鼠紅細(xì)胞有凝集活性。決定這一特性的是PPV血凝素。PPV凝血活性間接反映其生物活性。為了全面評價(jià)不同條件下PPV活性，本研究同時(shí)測定病毒含量和其血凝效價(jià)。由于PPV增殖需要利用細(xì)胞S期的DNA聚合酶。本研究表明PPV接種最佳期是在ST細(xì)胞形成30%～50%單層時(shí)進(jìn)行接種，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期的多數(shù)細(xì)胞處于細(xì)胞合成期，這時(shí)細(xì)胞多聚酶有利于病毒的復(fù)制。另外，牛血清過多會(huì)引起免疫豬的過敏反應(yīng)，用異步法接毒可以降低這種影響，還會(huì)保持接毒時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)穩(wěn)定。

本研究結(jié)果顯示，該P(yáng)PV毒株在ST細(xì)胞上出現(xiàn)CPE時(shí)間較早，病毒含量和血凝價(jià)高，且比其他3種細(xì)胞上CPE出現(xiàn)的時(shí)間均較早，節(jié)省時(shí)間和培養(yǎng)成本。因此本試驗(yàn)建議將ST細(xì)胞作為增殖PPV-H毒株的首選細(xì)胞，這將為疫苗大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。

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[2]殷華平.等.豬細(xì)小病毒(PPV)SCl株的分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006，7：63-65.

[3]朱紹輝等.豬細(xì)小病毒X株在不同細(xì)胞上增殖效果比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，6：6-10.