黃 沁

（廣東省深圳市光明新區(qū)動植物檢驗檢測中心，廣東 深圳 518107）

牛結(jié)核病是一種人畜共患傳染病，被我國列為二類動物疫病，給牛業(yè)生產(chǎn)特別是奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害，并對人類的健康也造成了嚴(yán)重的威脅。為加強(qiáng)奶牛養(yǎng)殖場結(jié)核病的高效監(jiān)測，我實驗室人員嚴(yán)格按照農(nóng)業(yè)部發(fā)布的動物疫病監(jiān)測計劃，每年定期對轄區(qū)內(nèi)的奶牛進(jìn)行結(jié)核病檢疫監(jiān)控。近年來，隨著全球科技的高速發(fā)展，牛結(jié)核病的檢測方法也逐步完善，現(xiàn)行的檢測方法包括結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗和γ-干擾素檢測試驗。其中皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是我國標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18645-2002）規(guī)定的牛結(jié)核病檢測方法，而γ-干擾素檢測試驗是OIE規(guī)定的國際貿(mào)易指定使用的檢測方法，為了驗證此兩種方法在實際工作中的檢測效果，我實驗室運用兩種檢測方法對轄區(qū)內(nèi)A,B奶牛養(yǎng)殖場的12月齡以上奶牛進(jìn)行了檢測比對試驗。

1 牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗

1.1 試驗材料

（1）試驗對象：來自A養(yǎng)殖場的131頭奶牛，B養(yǎng)殖場的1505頭奶牛。

（2）試驗試劑：提純牛型結(jié)核菌素，購于哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；75%酒精。

（3）試驗器材：一次性5mL的注射器，卡尺，酒精棉。

1.2 試驗過程

（1）注射部位及術(shù)前處理：在牛只編號后在頸側(cè)中部上1/3處剪毛，直徑約為10cm。

用卡尺測量中央皮皺厚度，作好記錄。

（2）注射劑量：用生理鹽水將提純牛型結(jié)核菌素凍干粉稀釋成0.1mL/頭（含20000IU）使用，一律皮內(nèi)注射。

（3）注射方法：以75%酒精消毒術(shù)部，后皮內(nèi)注射定量的牛型結(jié)核分枝桿菌PPD，注射后局部應(yīng)出現(xiàn)小皰

（4）試驗結(jié)果的觀察：皮內(nèi)注射后經(jīng)72h判定，觀察局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，后用卡尺測量每頭牛皮皺厚度，做好記錄。

1.3 結(jié)果判定

計算出每頭奶牛的皮厚差（皮厚差=反應(yīng)后皮厚-原皮厚度）。陽性：局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差大于或等于4.0mm；疑似：局部炎性反應(yīng)不不明顯，皮厚差大于或等于2.0mm，小于4.0mm；陰性：無炎性反應(yīng)，皮厚差在2.0mm以下。

2 牛結(jié)核γ-干擾素檢測試驗

2.1 試驗材料

牛全血。用一次性肝鋰素真空管收集牛血，每管至少5mL，輕輕顛倒幾次混合全血，使肝素溶解。

試劑盒。牛結(jié)核γ-干擾素ELISA檢測試劑盒，購于青島瑞爾生物技術(shù)有限公司。

試驗耗材及主要設(shè)備。微量移液槍、無菌24孔組織培養(yǎng)板、酶標(biāo)儀、37℃培養(yǎng)箱試驗過程。

（1）血液分裝。將采集的抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)液，每頭動物加三孔，每孔1.5mL。

（2）加入刺刺激抗原。無菌加入100μL牛PPD、禽PPD、PBS液至相應(yīng)的孔。

（3）孵育。將組織培養(yǎng)板放置37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育16～24h。

（4）血漿樣品的收獲。每孔吸取400μL上層血漿轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。

2.2 牛γ-干擾素免疫試驗

試驗前將所有試劑恢復(fù)至室溫，用0.5mL去離子水溶解陰陽性凍干粉，并平衡15min。加入樣品：加入100μL待測樣品及對照品至相應(yīng)孔中。封板：室溫孵育1h。洗滌4次。加入酶標(biāo)結(jié)合物：每孔加入50倍濃縮酶標(biāo)結(jié)合物。再次封板：室溫孵育1h。洗滌4次。加入底物：每孔加入100mL底物液充分混勻。封板：室溫避光孵育15min。加入終止液：每孔加入50μL終止液。終止后5min內(nèi)讀出OD450nm的值。

3 結(jié)果判定

（1）結(jié)果的讀取及判定標(biāo)準(zhǔn)。讀取每孔的OD值（注意：當(dāng)進(jìn)行重復(fù)孔時，OD值的計算需取平均值）

陽性=牛PPD的OD值-PBS的OD值≥0.1且牛PPD的OD值-禽PPD的OD值≥0.1

陰性=牛PPD的OD值-PBS的OD值＜0.1或牛PPD的OD值-禽PPD的OD值＜0.1

（2）結(jié)果的有效性。只有當(dāng)陽性對照OD值大于0.700，陰性對照OD值小于0.150時該試驗才有效。

4 試驗結(jié)果

（1）牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果

A養(yǎng)殖場的2頭奶牛呈陽性，其余均為陰性；B養(yǎng)殖場的8頭奶牛呈陽性，其余均呈陰性。

（2）牛結(jié)核γ-干擾素檢測試驗結(jié)果。

針對A,B場牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)呈陽性的10頭奶牛進(jìn)行該實驗。A養(yǎng)殖場的1頭奶牛呈陽性，其余均為陰性；B養(yǎng)殖場的5頭奶牛呈陽性，其余均呈陰性。

試驗結(jié)果比對，見表1。

表1 試驗結(jié)果比對

5 結(jié)果分析

從表1中可知，對經(jīng)初檢皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的試驗篩選出的陽性牛進(jìn)行牛結(jié)核γ-干擾素檢測試驗和皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)復(fù)檢試驗，兩試驗檢測符合率較低。

（1）牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗

初檢有2頭結(jié)果呈現(xiàn)陽性的牛，不排除受禽型結(jié)核分枝桿菌等引起非特異性假陽性的影響；復(fù)檢結(jié)果呈現(xiàn)0頭陽性牛的情況，不排除主觀肉眼觀察皮皺差出現(xiàn)誤差的影響。

綜上所述：只靠皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實驗就確診牛結(jié)核病是不科學(xué)合理理的。

（2）牛結(jié)核γ-干擾素檢測試驗

牛結(jié)核γ-干擾素檢測試驗通過用牛PPD和禽PPD分別刺刺激全血，檢測各全血樣品中釋放的γ-干擾素的差異來判斷牛結(jié)核病的陰陽性，排除了禽型結(jié)核桿菌引起的非特異性反應(yīng)的情況。試驗結(jié)果表明：γ-干擾素檢測試驗的陽性率比皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的陽性率高，可能與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)存在假陽性情況有關(guān)。

6 討論

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)牛結(jié)核病檢測方法只有結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，但此法需肉眼觀察皮皺差，主觀性太強(qiáng)，而且受其他型結(jié)核桿菌的干擾極大，假陽性率較高。若實際檢疫工作中用此法判定牛結(jié)核病，可能會有誤判，會直接導(dǎo)致養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)利益受損。γ-干擾素檢測試驗，匹配相應(yīng)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)說明，當(dāng)前實驗室檢測牛結(jié)核工作大多使用國外成熟產(chǎn)品，且該產(chǎn)品靈敏度高，具有較高的特異性，在現(xiàn)實操作中更簡便，結(jié)果判定更直接。鑒于以上優(yōu)點，γ-干擾素檢測試驗用于檢測牛結(jié)核病較現(xiàn)行國標(biāo)方法具有更為廣闊的應(yīng)用前景。