丁 愷 ，麻鵬達(dá)，賈彥彥，裴天林，白朕卿，梁宗鎖，2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)為藥用模式植物，其水溶性的酚酸是發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)[1-3]，在臨床醫(yī)學(xué)研究中被用于治療心腦血管疾病[4]。酚酸類物質(zhì)的生物合成途徑已經(jīng)得到較為清晰的闡明[5-7]。轉(zhuǎn)錄因子可以同時(shí)調(diào)控代謝途徑中多個(gè)基因，所以它成為植物次生代謝途徑遺傳改良的熱點(diǎn)。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育、次生代謝、響應(yīng)生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮重要作用[8-10]。R2R3-MYB可調(diào)控丹參的次生代謝，在丹參中過表達(dá)AtMYB75、SmPAP1或Rosea1，顯著提高苯丙烷代謝途徑基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而提高迷迭香酸和丹酚酸B的含量[11-13]。在丹參毛狀根中過表達(dá)ZmC1或ZmC1/R，降低酚酸的含量[14]。

擬南芥和丹參分別有125個(gè)[15]和110個(gè)R2R3-MYB[16]。根據(jù)進(jìn)化分析，擬南芥中R2R3-MYB分成22個(gè)亞族[9,15]，擬南芥和丹參的所有R2R3-MYB共分成37個(gè)亞族[16]，同一亞族的R2R3-MYB往往在代謝中發(fā)揮相似的作用[10]。Liu等[10]結(jié)合結(jié)構(gòu)分析和功能分析，歸納總結(jié)不同亞族的R2R3-MYB對于植物苯丙烷代謝的影響，大多數(shù)第4亞族成員對苯丙烷代謝途徑發(fā)揮抑制作用。例如，SmMYB39可抑制丹參酚酸代謝途徑基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制迷迭香酸和丹酚酸B的積累[17]。因此，結(jié)構(gòu)分析對于探討MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能十分有參考價(jià)值。

轉(zhuǎn)錄因子的功能與其定位情況密切相關(guān)[18]，轉(zhuǎn)錄因子可在細(xì)胞核中調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，也有一些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核外發(fā)揮作用[18-19]。細(xì)胞質(zhì)是許多生理過程發(fā)生的場所，比如質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄過程。轉(zhuǎn)錄因子的功能或定位情況可能會(huì)受到其他轉(zhuǎn)錄因子的影響[19]。例如，擬南芥的AtMYC1單獨(dú)定位在細(xì)胞質(zhì)，GL1單獨(dú)定位在細(xì)胞核，AtMYC1和GL1之間可以互作；當(dāng)進(jìn)行AtMYC1和GL1共定位研究時(shí)，二者之間出現(xiàn)互作，且這種互作導(dǎo)致GL1重新定位到細(xì)胞質(zhì)[19]。在發(fā)揮調(diào)控作用時(shí)，R2R3-MYB可單獨(dú)作用，也可與bHLH和WD轉(zhuǎn)錄因子形成MBW復(fù)合體發(fā)揮作用[20-22]。因此，了解轉(zhuǎn)錄因子的定位情況和是否存在自激活活性，可以為探索轉(zhuǎn)錄因子的功能奠定基礎(chǔ)。

本研究從進(jìn)化、亞細(xì)胞定位和自激活活性分析3個(gè)角度對SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的功能進(jìn)行探討，為進(jìn)一步研究3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 選用當(dāng)季新鮮洋蔥用于亞細(xì)胞定位試驗(yàn)。

丹參種子由陜西天士力公司商洛基地提供。丹參種子先用自來水浸泡12 h，再用流動(dòng)自來水沖洗12 h；經(jīng)過預(yù)處理的種子在超凈臺中進(jìn)行消毒，先用乙醇溶液(φ=75%)浸泡30 s，無菌水沖洗2次；再用HgCl2溶液(w=0.1%)浸泡15 min，無菌水沖洗7次；用鑷子將種子均勻平鋪在MS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)于組培間(溫度約為25 ℃，光照度約為2 000 lx，光照時(shí)間為14 h)。選用2周齡丹參無菌苗，使用RNA提取試劑盒提取其總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行基因克隆。

1.1.2 質(zhì)粒和菌種 質(zhì)粒pA7-GFP由中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物庫研究中心實(shí)驗(yàn)室(以下簡稱本實(shí)驗(yàn)室)保存；質(zhì)粒pDONR207和pDEST-GBKT7由John Innes Centre的Cathie Martin教授贈(zèng)予；克隆載體pMD19-T購自Invitrogen公司；酵母菌株AH109也由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)購自康為試劑公司。

1.1.3 主要試劑 RNA提取試劑盒購自北京天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；Gateway重組反應(yīng)試劑盒購自Invitrogen公司；氨芐青霉素、慶大霉素和卡那霉素購自Amerosco公司；腺苷酸、組氨酸、色氨酸、3-氨基-1,2,4-三氮唑(3AT)和DAPI購自北京索萊寶公司；Taq聚合酶、T4連接酶和各限制性內(nèi)切酶(SmaI、BamH I、XhoI和SpeI)購自Thermo Fisher公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和基因克隆 根據(jù)NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫收錄的SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93序列，使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增上述3個(gè)基因，引物序列詳見表1，其中下劃線標(biāo)注的序列為酶切位點(diǎn)或接頭引物序列。根據(jù)RNA提取試劑盒說明書，提取2周齡丹參小苗的全部RNA并以此為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用上述模板和引物(F33/R33、F54/R54或F93/R93)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測；根據(jù)膠回收試劑盒說明書回收目的片段，分別連接克隆載體pMD19-T和轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過PCR驗(yàn)證后送Invitrogen公司測序驗(yàn)證。對測序驗(yàn)證結(jié)果正確的菌株提取質(zhì)粒，并分別命名為pMD19-T-SmMYB33、pMD19-T-SmMYB54和pMD19-T-SmMYB93。

1.2.2 載體構(gòu)建 使用上述質(zhì)粒(pMD19-T-SmMYB33、pMD19-T-SmMYB54或pMD19-T-SmMYB93)為模板，用表1中的引物(F332/R332、F542/R542、F932/R932、F333/R333、F543/R543、F933/R933)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳檢測并回收。

使用SmaI和BamHI分別雙酶切pA7-GFP和F332/R332擴(kuò)增得到的片段；使用XhoI和SpeI分別雙酶切pA7-GFP、F542/R542和F932/R932擴(kuò)增得到的片段。電泳檢測并回收目的條帶，使用T4連接酶將回收的載體和目的片段進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用含氨芐青霉素的平板篩選陽性菌株；經(jīng)過PCR驗(yàn)證后送Invitrogen公司測序驗(yàn)證。對測序結(jié)果正確的菌株提取質(zhì)粒，并分別命名為pA7-GFP-SmMYB33、pA7-GFP-SmMYB54和pA7-GFP-SmMYB93。

根據(jù)Gateway重組反應(yīng)試劑盒說明書，將引物(F333/R333、F543/R543或F933/R933)擴(kuò)增回收得到的片段分別與pDONR207進(jìn)行BP重組反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用含慶大霉素的平板篩選陽性菌株；經(jīng)過PCR驗(yàn)證后送Invitrogen公司測序驗(yàn)證，對測序結(jié)果正確的菌株提取質(zhì)粒，并分別命名為pDONR207-SmMYB33、pDONR207-SmMYB54和pDONR207-SmMYB93；將上述質(zhì)粒分別與pDEST-GBKT7進(jìn)行LR重組反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用含卡那霉素的平板篩選陽性菌株；經(jīng)過PCR驗(yàn)證后送Invitrogen公司測序驗(yàn)證，對測序結(jié)果正確的菌株提取質(zhì)粒，并分別命名為pDEST-GBKT7-SmMYB33、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDEST-GBKT7-SmMYB93。

表1 用于基因擴(kuò)增的引物Table 1 Primers used for gene amplification

注:酶切位點(diǎn)序列用下劃線標(biāo)注；同源重組臂序列用斜體標(biāo)注。

Note:Underlined sequences represent restriction enzyme sites; the italic sequences represent homologous recombination arm sequences.

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將測序得到的核苷酸和氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行BLAST，并與得分最高的序列進(jìn)行比對；使用SMART和SOPMA對其結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；使用MUSCLE法將Rosea1(ABB83826.1)、C1(P10290.1)、SmPAP1(ACZ48688.2)、SmMYB39(AGS48990.1)、SmMYB36和擬南芥的125條R2R3-MYB氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，然后使用MEGA 7.0軟件的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)為默認(rèn)值；使用雙向BLAST法尋找研究基因在擬南芥中的直系同源基因；根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果，選取進(jìn)化上相近的成員進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，使用Clustal X2進(jìn)行序列比對和BoxShade工具呈現(xiàn)比對結(jié)果。

1.2.4 亞細(xì)胞定位分析 參考張順倉[23]的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位試驗(yàn)。選取新鮮洋蔥最內(nèi)層蔥瓣，用手術(shù)刀片將其切至1.5 cm×1.5 cm大小，快速撕取內(nèi)表皮，平鋪于MS固體培養(yǎng)基，25 ℃暗培養(yǎng)24 h。用基因槍法將質(zhì)粒pA7-GFP、pA7-GFP-SmMYB33、pA7-GFP-SmMYB54和pA7-GFP-SmMYB93轉(zhuǎn)化到內(nèi)表皮，25 ℃共培養(yǎng)36 h后，用10 μg/mL DAPI染色20 min，再用pH 7.2的磷酸緩沖液清洗3次，制片，用激光共聚焦掃描顯微鏡在明場、激發(fā)光405 nm和激發(fā)光488 nm下進(jìn)行觀察。

1.2.5 自激活活性分析 分別轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDEST-GBKT7、pDEST-GBKT7-SmMYB33、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDEST-GBKT7-SmMYB93到酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞，使用SD/-Trp培養(yǎng)基篩選菌株；挑取單克隆并使用SD/-Trp液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁到足夠量，提取質(zhì)粒送Invitrogen公司測序驗(yàn)證。將成功轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的菌液分別稀釋到原菌的1、1/10和1/100，分別在3AT濃度為0、5、10、15或20 mmol/L的SD/-Trp或SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上點(diǎn)斑驗(yàn)證，30 ℃暗培養(yǎng)3～4 d后觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆和鑒定

如圖1，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到738 bp的基因 SmMYB33，804 bp的基因 SmMYB54和495 bp的基因 SmMYB93。使用BLAST進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)測序得到序列SmMYB33的核苷酸序列(A363、C438和G654)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF059387.1的序列(G363、T438和A654)有差異；測序得到的序列的氨基酸序列(G217)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為AGN52057.1的序列(D217)也有差異。測序得到序列SmMYB54的核苷酸序列(A278、G281、C429、T504和T702)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF059408.1的序列(T278、T281、T429、C504和G702)有差異；測序得到的序列的氨基酸序列(V255和H258)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為AGN52078.1的序列(G255和Q258)也有差異。測序得到序列SmMYB93的核苷酸序列比數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF059447.1的序列在379～380位之間多6個(gè)核苷酸(CTACTG)，測序得到的序列的氨基酸序列比數(shù)據(jù)庫中登錄號為AGN52117.1的序列在127～128位之間多2個(gè)氨基酸(TA)；此外，測序得到序列SmMYB93的核苷酸序列(G408)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF059447.1的序列(A408)其他位點(diǎn)也存在差異,但氨基酸序列沒有差異。以上差異可能由丹參品系差異造成。綜上所述，所有序列符合預(yù)期。對上述質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果正確。

M.DL2000 marker；1. SmMYB33基因擴(kuò)增產(chǎn)物 Amplification product of SmMYB33；2. SmMYB54基因擴(kuò)增產(chǎn)物 Amplification product of SmMYB54；3. SmMYB93基因擴(kuò)增產(chǎn)物 Amplification product of SmMYB93

圖1SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93基因的擴(kuò)增
Fig.1AmplificationofSmMYB33,SmMYB54andSmMYB93

2.2 生物信息學(xué)分析

進(jìn)化樹分析表明，SmMYB33聚到第2亞族，SmMYB54和SmMYB93聚到第4亞族，詳見圖2。

在丹參中經(jīng)過驗(yàn)證的R2R3-MYBs用黑色圓點(diǎn)標(biāo)注 R2R3-MYBs which was identified inSalviamiltiorrhizawere emphasized with black dots

圖2SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的進(jìn)化樹
Fig.2PhylogenetictreeofSmMYB33,SmMYB54andSmMYB93

[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R二級結(jié)構(gòu)用紅色方框標(biāo)出，DNEI二級結(jié)構(gòu)用橙色方框標(biāo)出，第2亞族特有二級結(jié)構(gòu)IDxSFW-MxFWFD用綠色方框標(biāo)出 The [D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R motif was emphasized with red box,the DNEI motif was emphasized with orange box,and the IDxSFW-MxFWFD motif specific to subgroup 2 was emphasized with green box

圖3SmMYB33的二級結(jié)構(gòu)分析
Fig.3MotifanalysisofSmMYB33

[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R二級結(jié)構(gòu)用紅色方框標(biāo)出，DNEI二級結(jié)構(gòu)用橙色方框標(biāo)出，第4亞族特有二級結(jié)構(gòu)LxL[E/D]L用藍(lán)色方框標(biāo)出 [D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R motif was emphasized with red box,the DNEI motif was emphasized with orange box,and the LxL[E/D]L motif specific to subgroup 4 was emphasized with blue box

圖4SmMYB54和SmMYB93的二級結(jié)構(gòu)分析
Fig.4MotifanalysisofSmMYB54andSmMYB93

二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明(圖3和圖4)，SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93含有R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子特有的完整的R2和R3重復(fù)區(qū)域，并且每個(gè)重復(fù)區(qū)域含有1個(gè)螺旋—螺旋—轉(zhuǎn)折—螺旋的二級結(jié)構(gòu)。R2和R3重復(fù)區(qū)域的一級結(jié)構(gòu)(-W-(X19)-W-(X19)-W-……-F/I/L/M-(X18)-W-(X18)-W-)與之前報(bào)道相同[9]。二級結(jié)構(gòu)分析表明，SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的R3重復(fù)區(qū)含有[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R二級結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)是負(fù)責(zé)與bHLH蛋白互作的區(qū)域[24-25]，表明這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能與某些bHLH轉(zhuǎn)錄因子存在互作；SmMYB33和SmMYB54含有DNEI結(jié)構(gòu)[26]，這是一個(gè)與調(diào)節(jié)原花青素合成密切相關(guān)的保守二級結(jié)構(gòu)[9]，表明這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能與原花青素合成密切相關(guān)；SmMYB33含有第2亞族特有的IDxSFW--MxFWFD結(jié)構(gòu)[9]；SmMYB54含有第4亞族特有的LxL[E/D]L結(jié)構(gòu)[9]。使用雙向BLAST法找到SmMYB33在擬南芥中的直系同源基因?yàn)?AtMYB15，沒有找到 SmMYB54和 SmMYB93在擬南芥中的直系同源基因。

2.3 亞細(xì)胞定位

如圖5，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均出現(xiàn)空載對照的綠色熒光；融合GFP的SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的綠色熒光在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可以被觀察到，在細(xì)胞核中綠色熒光十分明亮，而在細(xì)胞質(zhì)中綠色熒光呈彌散狀態(tài)。

2.4 自激活活性分析

如圖6，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDEST-GBKT7、pDEST-GBKT7-SmMYB33、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDEST-GBKT7-SmMYB93的酵母均能夠在含有不同濃度抑制劑的SD/-Trp+3AT培養(yǎng)基正常生長。在含有不同濃度抑制劑的SD/-Trp-His-Ade+3AT培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDEST-GBKT7、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDEST-GBKT7-SmMYB93的酵母均不能生長；轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDEST-GBKT7-SmMYB33的酵母能夠生長，這表明 SmMYB33能夠在酵母中正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，并能夠自己激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，但是隨著抑制劑3AT濃度的增加，酵母的生長受到明顯抑制。這表明SmMYB33有自激活活性，SmMYB54和SmMYB93沒有自激活活性。

1.明場 Bright field；2.綠色熒光蛋白的熒光場 Green fluorescent field of GFP；3.DAPI染料的熒光場 Blue fluorescent field of DAPI；4.擬合結(jié)果 Merged results

圖5SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位結(jié)果
Fig.5SubcellularlocalizationofSmMYB33,SmMYB54andSmMYB93inonionepidermalcells

圖6 SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的自激活活性分析Fig.6 Transactivation analysis of SmMYB33,SmMYB54 and SmMYB93

3 討 論

進(jìn)化樹分析和二級結(jié)構(gòu)分析表明SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93是典型的R2R3-MYB類型的轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子的功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[10]。進(jìn)化樹結(jié)果表明SmMYB33聚到第2亞族，二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)SmMYB33含有第2亞族特有的二級結(jié)構(gòu)，使用雙向BLAST法得到 SmMYB33的直系同源基因?yàn)?AtMYB15，以上結(jié)果表明SmMYB33屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子第2亞族。在擬南芥中過表達(dá) AtMYB15上調(diào)了莽草酸途徑中所有酶基因的表達(dá)，這暗示SmMYB33可能像AtMYB15一樣，能夠調(diào)控苯丙烷代謝通用途徑，影響丹參酚酸類物質(zhì)的積累[27]。SmMYB54聚到第4亞族且含有第4亞族特有的二級結(jié)構(gòu)，這表明SmMYB54屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子第4亞族。SmMYB93聚到第4亞族但不含有第4亞族特有的二級結(jié)構(gòu)，不能確定 SmMYB93屬于哪個(gè)亞族。第4亞族的R2R3-MYB對苯丙烷代謝途徑常發(fā)揮抑制作用[10]，如在丹參毛狀根中過表達(dá) SmMYB39顯著抑制酚酸類物質(zhì)的積累[17]。SmMYB54屬于第4亞族，SmMYB93與第4亞族進(jìn)化距離較近，這暗示這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能對苯丙烷代謝通用途徑有抑制作用，影響丹參酚酸類物質(zhì)的積累。通過對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，找到與它們進(jìn)化距離較近的已知功能的轉(zhuǎn)錄因子，可以為其功能研究提供參考。

亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均可以定位在細(xì)胞核，暗示3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控細(xì)胞核中靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。細(xì)胞質(zhì)是許多生理過程發(fā)生的場所，3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也可能參與蛋白細(xì)胞質(zhì)中的一些生理過程，比如質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄過程。轉(zhuǎn)錄因子的功能或定位情況可能會(huì)受到其他轉(zhuǎn)錄因子的影響[19]。類似地，某些bHLH蛋白可能和上述3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同互作，共同調(diào)控細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的生理過程，但還需要更多的試驗(yàn)來驗(yàn)證這些猜想。

SmMYB33有自激活活性，若想利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與SmMYB33互作的蛋白，需要找到并去除其轉(zhuǎn)錄自激活結(jié)構(gòu)域，并確認(rèn)其失去自激活活性。SmMYB54和SmMYB93沒有自激活活性，二者的載體可用于酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與其互作的蛋白。本研究中的自激活試驗(yàn)為進(jìn)一步探索3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的功能提供依據(jù)。

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