祁春芳，王 婷，劉霞宇，石曉雯，于治芹，劉世芳，梁建萍，賈小云

(1. 山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實驗局，山西大同 037006; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801)

番茄(Lycopersiconesculentum)是世界上最重要的果蔬作物之一[1]，具有基因組數(shù)目較小(950 Mb)、自花授粉、產(chǎn)量高、生長期短等特點，是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的模式植物之一[2-3]。番茄轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)過30多年的研究，尤其是番茄全基因組測序的完成[4]，加快高產(chǎn)和高營養(yǎng)番茄品種的培育，目前已獲得抗寒性強(qiáng)[5]、抗病蟲害[1]、耐貯藏、口感好和高花青素含量[6]的番茄，為田間生產(chǎn)提供一些新的優(yōu)勢種。

植物遺傳轉(zhuǎn)化是指用離體培養(yǎng)的植物組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體作為受體，通過遺傳轉(zhuǎn)化方法向受體內(nèi)轉(zhuǎn)入外源基因，獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物體[7]。常用植物遺傳轉(zhuǎn)化方法有基因槍法、電擊法、顯微鏡注射法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法等。在番茄中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法應(yīng)用較廣泛[8-9]，但轉(zhuǎn)化率不穩(wěn)定和轉(zhuǎn)化效率低是番茄遺傳工程改良的主要問題。影響番茄遺傳轉(zhuǎn)化率的因素包括：外植體、農(nóng)桿菌類型、外源基因的選擇、菌液OD值、侵染、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間等。已有的番茄轉(zhuǎn)化相關(guān)研究表明，當(dāng)外植體為子葉[10-15]、菌株為GV3101[16]、OD600值為0.2～0.6、農(nóng)桿菌侵染時間為5～20 min[8,11]、預(yù)培養(yǎng)時間為2 d[11-12]、共培養(yǎng)時間為48～72 h時轉(zhuǎn)化率較高[8,11]。

為方便篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因植株，大多數(shù)用于遺傳轉(zhuǎn)化的載體中通常含有選擇標(biāo)記基因。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 nptⅡ可使卡那霉素(Kan)發(fā)生磷酸化而失活，進(jìn)而導(dǎo)致植物產(chǎn)生卡那霉素抗性。pC2300-pOT2植物表達(dá)載體中含有Kan抗性基因，因此含此載體的轉(zhuǎn)基因植株在含Kan的環(huán)境中能夠繼續(xù)生長，而非轉(zhuǎn)基因植株則不能存活[17]。雖在小麥、棉花、大豆、水稻、玉米中已使用Kan研究過作物轉(zhuǎn)基因后代的篩選，但是不同物種、同一物種的不同品種、甚至不同外植體對卡那霉素的抗性都不同，因而有必要對篩選轉(zhuǎn)基因植株所用的卡那霉素濃度進(jìn)行研究，以建立篩選轉(zhuǎn)基因番茄Kan抗性株系的有效方法。

花青素是一種水溶性的天然色素，具有抵御疾病、抗炎癥和改善視力等作用。黑莓、藍(lán)莓和枸杞等漿果中含有較高的花青素，但此類漿果生產(chǎn)季節(jié)性強(qiáng)且不耐貯藏。因此通過植物遺傳轉(zhuǎn)化法，對常食用果蔬作物中某些與花青素合成、調(diào)控相關(guān)基因進(jìn)行過表達(dá)或降低表達(dá)，能夠提高花青素的含量。微小(RNA MicroRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)miR828能夠負(fù)調(diào)控蔗糖誘導(dǎo)下擬南芥中花青素的合成。本試驗前期已經(jīng)從模式植物擬南芥中分離到 pri-miR828基因，并構(gòu)建 miR828過表達(dá)載體pC2300-pOT2-At-pri-miR828[18-21]。本研究將以此載體的番茄轉(zhuǎn)化為例，從番茄種子消毒處理方法、無菌苗培養(yǎng)方法、轉(zhuǎn)基因陽性植株Kan篩選濃度、方式和PCR檢測等方法來對番茄的遺傳轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行研究，旨在探索一套快速高效的番茄遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定方法，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良番茄新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

野生型番茄種子‘Ailsa Craig’和農(nóng)桿菌GV3101為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院賈小云教授課題組保存。番茄遺傳轉(zhuǎn)化重組載體pC2300-pOT2-pri-miR828由該課題組前期構(gòu)建，載體攜帶CaMV35S啟動子和 nptⅡ植物選擇標(biāo)記基因。

Marker DL1000、TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司，PCR引物和其他藥品試劑由生工生物工程(上海)有限公司合成或購買該公司BBI系列產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 番茄種子的消毒和無菌苗的培養(yǎng) 取適量番茄種子于50 mL離心管中，用φ=75% C2H5OH浸種5 min，無菌水沖洗1次；飽和Na3PO3浸泡20 min(每2 min振蕩1次)，無菌水沖洗3次；φ=1% NaClO水溶液浸泡10 min，無菌水沖洗4～6次，至純凈無泡沫。將消毒處理后的種子放入裝有約25 mL無菌水的50 mL離心管中，置于恒溫振蕩搖床于180 r·min-1、25 ℃黑暗下震蕩培養(yǎng)7 d，每天更換1次無菌水。

震蕩培養(yǎng)結(jié)束后將種子播種于MS培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基組分詳見表1)，置于人工氣候培養(yǎng)箱(1 800 lx、26 ℃、16 h光照/8 h黑暗)培養(yǎng)7 d。

1.2.2 番茄遺傳轉(zhuǎn)化 預(yù)培養(yǎng)：切取8～10 d苗齡的番茄子葉，去除尖端，放入盛有M17的培養(yǎng)皿中浸泡12 h后置于M1預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。

搖菌：將500 μL含 miR828過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種到裝有5 mL液體LB培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)12 h；然后于4 200 r·min-1下低溫離心5 min，將沉淀用等體積的APM培養(yǎng)基重懸，再次于4 200 r·min-1下離心5 min；最后用約50 mL 液體MS培養(yǎng)基重懸振蕩培養(yǎng)至OD600值為 0.2～0.3。

侵染與共培養(yǎng)：將預(yù)培養(yǎng)的子葉放入上述用MS重懸的農(nóng)桿菌中培養(yǎng)15 min，然后用M17沖洗殘留農(nóng)桿菌，濾紙吸去多余的菌液，侵染后的子葉放入鋪有新濾紙的預(yù)培養(yǎng)基M1上，弱光下共培養(yǎng)2 d。

選擇培養(yǎng)：子葉轉(zhuǎn)移到M13篩選培養(yǎng)基中，弱光培養(yǎng)7 d后更換培養(yǎng)基為正常光照培養(yǎng)，2周更換新的M13培養(yǎng)基。

芽誘導(dǎo)及伸長培養(yǎng)：待外植體長成直徑1～2 cm 愈傷組織時，切去死去的部位，用滅菌濾紙吸干其上的水份，轉(zhuǎn)移到M4中，使愈傷繼續(xù)生長變大、長芽。

根誘導(dǎo)培養(yǎng)：待長成3～5 cm的小苗時，從芽與愈傷接觸的最底部切下插入M16培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。

移苗：番茄苗長至8 cm時(基本與組培瓶口相平)，將整棵植株移植到放置于溫室中的花盆內(nèi)，上面鋪塑料膜，在幼苗恢復(fù)期逐漸揭開塑料膜，待繼續(xù)生長到10～15 cm后從溫室移植到大田中直至開花結(jié)果收獲種子。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因番茄Kan最適質(zhì)量濃度的篩選 向直徑90 mm的培養(yǎng)皿中平鋪2層濾紙，加入約15 mL 質(zhì)量濃度分別為0、50、75、100 mg·L-1的Kan溶液，每皿中擺放20粒已消毒的野生型番茄種子，培養(yǎng)5～7 d后比較種子發(fā)芽和生長情況，確定轉(zhuǎn)基因番茄的最適Kan篩選質(zhì)量濃度。每個質(zhì)量濃度設(shè)置2組重復(fù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因番茄Kan抗性篩選方式的確定 土壤澆灌Kan溶液篩選法：將經(jīng)震蕩培養(yǎng)后的野生型番茄種子種植到土壤中，待種子露白并長出1～2片子葉時分別澆灌無菌水和100 mg·L-1的Kan溶液，培養(yǎng)6～8 d觀察幼苗的伸長情況。每處理35株幼苗。

MS培養(yǎng)基中添加Kan篩選法： 取已消毒的野生型和轉(zhuǎn)基因番茄種子分別播種于含Kan質(zhì)量濃度為100 mg·L-1和不含Kan的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后觀察種子在培養(yǎng)基的發(fā)芽生長情況。

蛭石澆灌Kan溶液篩選法：取2個直徑120 mm培養(yǎng)皿，蒸餾水沖洗后表面鋪一層蛭石，分別用無菌水和100 mg·L-1的Kan溶液將蛭石潤濕，然后將震蕩培養(yǎng)后的野生型和轉(zhuǎn)基因番茄種子分別種植于蛭石中，觀察、記錄種子的變化情況。

表1 番茄遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方Table 1 The media of tomato genetic transformation

注Note:R3V(R3 vitamins):1 g·L-1VB1,0.5 g·L-1VB3,0.5 g·L-1VB6.

1.2.5 PCR鑒定法 參照 CTAB 法從幼嫩的番茄葉片中提取 DNA[22]。然后以番茄葉片基因組DNA為模板，野生番茄為陰性對照，pC2300-pOT2-pri-miR828載體為陽性對照，分別擴(kuò)增 At-pri-miR828目的基因，進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。

根據(jù)載體上 At-pri-miR828序列設(shè)計1對能擴(kuò)增出182 bp的特異引物mir828-PF:5′-TCATCATCTCTCTTACTCTCATGGTG-3′和mir828- PR:5′-TCCCACTTCCAAACATTGCT-3′。反應(yīng)程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 34個循環(huán)； 72 ℃ 終延伸10 min。 PCR反應(yīng)體系(20 μL)：模板2.0 μL，10× Buffer 2 μL,2.5 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL,10 μmol·L-1正反向引物各0.8 μL，5 μmol·L-1TaqE 0.4 μL，ddH2O 13.6 μL。PCR產(chǎn)物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子消毒處理對發(fā)芽率的影響

種子消毒采用C2H5OH、Na3PO3及NaClO分別浸泡及無菌水反復(fù)沖洗的方法，能使污染率減少到5%以下。

2.2 震蕩培養(yǎng)對番茄種子發(fā)芽和生長的影響

野生型番茄種子的發(fā)芽結(jié)果見圖1。圖1-A顯示直接將經(jīng)過消毒的種子接于培養(yǎng)基15 d后發(fā)芽率僅為約50%且生長勢不一致。圖1-B為消毒的種子經(jīng)7 d震蕩培養(yǎng)露白后再接種于培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d后的生長情況。全部種子基本都發(fā)芽且生長勢一致。

圖1 震蕩培養(yǎng)對番茄種子發(fā)芽和生長的影響Fig.1 Effect of shock culturing on germination and growth of tomato seeds

2.3 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

番茄遺傳轉(zhuǎn)化過程如圖2所示。用OD600值為0.2～0.3的農(nóng)桿菌侵染番茄幼苗子葉15 min，然后置于含有濾紙的M1預(yù)培養(yǎng)基上2 d(圖2-A)，再置于M13選擇培養(yǎng)基上待愈傷組織逐漸分化并增大(圖2-B和2-C)。

當(dāng)愈傷組織長至1～2 cm時，切割叢生芽并轉(zhuǎn)移到M4芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。當(dāng)叢生芽長至3～5 cm時(圖2-D)轉(zhuǎn)移到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使植株長出茂盛的叢生根(圖2-E)。當(dāng)植株繼續(xù)長至10 cm 左右時(圖2-F)，打開瓶口煉苗生長3～5 d，然后將植株移植到裝有營養(yǎng)土的花盆中。移植后先用透明的塑料膜蓋住上部以保持濕度，再循序漸進(jìn)地揭開膜，待番茄幼苗健壯成活后轉(zhuǎn)移到大田中，開花結(jié)果后收獲果實，獲得種子(圖2-G、2-H、2-I)。本試驗共轉(zhuǎn)化子葉200個，獲得65個Kan抗性株系，轉(zhuǎn)化效率為32.5%。

A.共培養(yǎng) Co-culture；B.選擇再生 Selective regeneration；C.抗性愈傷分化 Resistance callus differentiation；D.抗性芽生長 Resistance shoot growth；E.根生長 Root growth；F.煉苗生長 Seedling growth；G.花盆移栽 Flowerpot transplanting；H.溫室培養(yǎng) Greenhouse culture；I.田間收獲 Field harvesting

圖2番茄遺傳轉(zhuǎn)化過程
Fig.2Genetictransformationoftomato

2.4 轉(zhuǎn)基因番茄Kan耐受最適質(zhì)量濃度的篩選

由圖3可見，無菌水處理的野生型番茄種子作為對照(0 mg·L-1Kan)，其種子能夠萌發(fā)、健壯生長、根系繁茂。經(jīng)不同質(zhì)量濃度 Kan 處理后，野生型番茄種子萌發(fā)均受到一定程度的抑制，隨著Kan質(zhì)量濃度的增加，生長緩慢、根系疏短、抑制作用逐漸加強(qiáng)。當(dāng)Kan質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時，抑制作用較強(qiáng)，僅有不到30%的種子有萌發(fā)跡象，其余幾乎不萌發(fā)，而且全部種子不能分化出根。后續(xù)試驗證明，進(jìn)一步增加Kan質(zhì)量濃度不僅影響野生型番茄種子的萌發(fā)，具有Kan抗性基因的轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)也會受到抑制。因此，本試驗得出篩選轉(zhuǎn)基因番茄種子的最佳Kan質(zhì)量濃度為100 mg·L-1。

2.5 Kan溶液澆灌土壤篩選法

如圖4所示，種植于土壤中的野生型番茄幼苗分別用無菌水(A)和100 mg·L-1Kan溶液(B)澆灌后，雖然經(jīng)Kan溶液澆灌后的幼苗生長較緩慢而且部分有點黃化，但是幼苗的整體生長情況和野生型差異不大，不太容易辨認(rèn)，說明如果用100 mg·L-1Kan溶液澆灌土培番茄幼苗來篩選轉(zhuǎn)基因植株可能會增加假陽性單株的數(shù)量，影響選擇效果。

A.無菌水澆灌 Sterile water irrigation；B.100 mg·L-1的Kan澆灌 100 mg·L-1 Kan solution irrigation

2.6 MS培養(yǎng)基中添加Kan篩選法

如圖5所示：野生型種子在MS培養(yǎng)基中正常萌發(fā)，生長健壯(5-A)，但在含Kan質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的培養(yǎng)基中基本不萌發(fā)生長(5-B)，而轉(zhuǎn)基因番茄種子在含有Kan的培養(yǎng)基中仍生長健壯且生長勢一致，根系發(fā)達(dá)(5-C)。因此，在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為100 mg·L-1Kan的方法可用來篩選轉(zhuǎn)基因番茄種子。

2.7 Kan溶液澆灌蛭石篩選法

如圖6所示：種植于用無菌水澆灌的蛭石中的野生型番茄種子7 d后可正常萌發(fā)、生長健壯，而用100 mg·L-1Kan溶液澆灌后的蛭石中的野生型番茄種子不萌發(fā)，但轉(zhuǎn)基因番茄種子仍可萌發(fā)并長勢整齊，說明用100 mg·L-1Kan澆灌蛭石培養(yǎng)番茄種子的方法可以用來篩選轉(zhuǎn)基因番茄種子。

A. 野生型番茄MS培養(yǎng)基 Wild-type tomato on MS medium；B. 野生型番茄含Kan培養(yǎng)基 Wild-type tomato MS medium with Kan；C. 轉(zhuǎn)基因番茄含Kan培養(yǎng)基 Transgenic tomato on MS medium with Kan

圖5含Kan培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因番茄種子
Fig.5ScreeningoftransgenictomatobyMSmediumwithKan

A. 野生型番茄無菌水浸泡 Wild-type tomato sterile water soaking；B. 野生型番茄Kan浸泡 Wild-type tomato with Kan soaking；C. 轉(zhuǎn)基因番茄Kan浸泡 Transgenic tomato with Kan soaking

圖6Kan澆灌蛭石法篩選轉(zhuǎn)基因番茄種子
Fig.6ScreeningoftransgenictomatobyseedsoakingwithKan

2.8 轉(zhuǎn)基因番茄PCR鑒定法

選取12株經(jīng)100 mg·L-1Kan篩選的抗性轉(zhuǎn)基因番茄植株的葉片提取DNA，分別標(biāo)為miR828-1、miR828-2、miR828-3、miR828-4、miR828-5、miR828-6、miR828-7、miR828-8、miR828-9、miR828-10、miR828-11和miR828-12。

以野生型番茄植株DNA為陰性對照，以pC2300-pOT2-pri-miR828載體質(zhì)粒 DNA為陽性對照，分別進(jìn)行 At-pri-miR828 PCR擴(kuò)增。如圖7 所示，所檢測的12株番茄植株中除miR828-7、miR828-11以外，其余7株都擴(kuò)增出與陽性對照大小相同的約182 bp的清晰條帶，表明目的基因 At-pri-miR828已經(jīng)成功整合到番茄基因組中。

M.Marker DL 1000; WT.野生型番茄 Wild type tomato；V.載體pC2300-pOT2-pri-miR828 pC2300-pOT2-pri-miR828 plasmid; 1～12.轉(zhuǎn)基因番茄miR828-1～miR828-12 Transgenic tomatoes miR828-1-miR828-12

圖7轉(zhuǎn)基因番茄的PCR檢測
Fig.7ThePCRidentificationoftransgenictomatoes

3 結(jié)論與討論

植物外植體消毒效率的提高是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。本研究先用φ=75% C2H5OH浸泡5 min，然后再用飽和Na3PO3浸泡20 min，最后用φ=1% NaClO水溶液浸泡10 min后能夠使番茄種子的污染率控制在5%以下，達(dá)到很好的消毒效果。并且飽和Na3PO3能夠殺滅深層霉菌和病毒，與強(qiáng)消毒效果的HgCl2相比，對環(huán)境和種子都沒有傷害。震蕩培養(yǎng)番茄種子露白后再接種于培養(yǎng)基可以使種子發(fā)芽后生長勢一致，從而縮短轉(zhuǎn)基因無菌苗的獲得時間。

不同目標(biāo)基因番茄的轉(zhuǎn)化效率不同。本試驗中，用含有 pri-miR828過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共侵染番茄幼苗子葉，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間為2 d、菌液濃度為OD600=0.2～0.3和侵染時間為15 min時轉(zhuǎn)化效率較高。本試驗轉(zhuǎn)化共使用200個子葉進(jìn)行研究，最終統(tǒng)計獲得65個轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)化效率為32.5%。在含有抗生素的M13培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因后的子葉愈傷組織飽滿，芽點嫩綠生長出很多叢生芽并正常分化(圖2-B和2-C)。在含1.0 mg·L-1IAA的M16培養(yǎng)基中叢生芽生根效果好，最短5 d可生根，但不同個體的生根數(shù)量、時間及粗細(xì)存在差異。另外，子葉在選擇培養(yǎng)基中容易向上卷曲，使部分子葉因營養(yǎng)缺乏而死亡，或者子葉的上翹可能使部分非轉(zhuǎn)化細(xì)胞逃過抗生素的篩選而產(chǎn)生假陽性植株，所以要將子葉斜插入培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基時，注意要將外植體攜帶的原有培養(yǎng)基和水珠用濾紙吸干凈，以防雜菌污染。

Kan是轉(zhuǎn)基因篩選中常用的抗生素。本研究以番茄‘Ailsa Craig’為研究材料發(fā)現(xiàn)，當(dāng) Kan質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時，幾乎全部種子不能正常生長和分化出根，說明100 mg·L-1是遺傳轉(zhuǎn)化時篩選抗性轉(zhuǎn)基因番茄的最佳Kan質(zhì)量濃度，與曹慧穎等[17]的研究結(jié)果相似。

除了在組織培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中添加Kan可以篩選轉(zhuǎn)基因植株外，通過Kan溶液澆灌蛭石、土壤等方法也可以對轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行篩選。本研究發(fā)現(xiàn)：用質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的Kan溶液澆灌蛭石和在MS培養(yǎng)基中添加Kan的方法都可以用來篩選轉(zhuǎn)基因番茄，但用100 mg·L-1Kan溶液澆灌土培番茄幼苗時篩選效果不理想。100 mg·L-1Kan溶液澆灌土壤后，番茄幼苗的整體生長情況和野生型差異不大，不太容易辨認(rèn)，影響選擇效果。

PCR鑒定法是檢測外源基因是否插入植物基因組的直觀有效的手段。本研究對經(jīng)100 mg·L-1Kan篩選的12株抗性轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行外源基因 At-pri-miR828的PCR檢測發(fā)現(xiàn)，10株可檢測到目的基因。由此也表明，利用100 mg·L-1Kan溶液澆灌蛭石和在MS培養(yǎng)基中添加Kan的方法可快速、準(zhǔn)確地篩選轉(zhuǎn)基因番茄植株。

本研究在組織培養(yǎng)的過程中也出現(xiàn)畸形芽、盲芽問題。有的只是長出一片或多片肥厚的葉片、甚至是叢生雜亂的葉片而沒有生長點，有的雖有頂芽，但頂芽矮壯且肥厚，葉片較頂芽大且卷曲。這些畸形芽和盲芽都不能長成健康的植株，具體原因還在研究中。

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