廉德平,倪宏斌,凌 晨,張 坤,剡根強(qiáng)

(1.新疆阿拉爾新農(nóng)乳業(yè)有限責(zé)任公司,新疆 阿拉爾 843300;2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003)

牛傳染性鼻氣管炎(IBR)又稱“紅鼻病”或“壞死性鼻炎”,病原為牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV),屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)皰疹病毒亞科(Alphaher pesviridae)水痘病毒屬(Varicellovirus)。自1956年 Madin等[1]首次從患牛中分離IBRV以來,美國(guó)、澳大利亞、新西蘭、俄羅斯、墨西哥等國(guó)家相繼出現(xiàn)IBRV感染的報(bào)道;我國(guó)于20世紀(jì)70年代從荷蘭進(jìn)口牛中發(fā)現(xiàn)該病,20世紀(jì)80年代初由周泰沖等[2]首次從新西蘭進(jìn)口的奶牛中分離到IBRV,顏邦芬[3]、鄒世穎[4]等的調(diào)查表明,我國(guó)大部分地區(qū)都已存在IBRV感染;目前只有瑞典、丹麥、芬蘭、奧地利等極少數(shù)國(guó)家沒有IBRV感染或者已宣布成功消除該病[5-6],世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為 B類疾病[7]。臨床感染表現(xiàn)為流鼻涕、呼吸困難、上呼吸道及氣管黏膜發(fā)炎等癥狀,還可引起牛的結(jié)膜炎、乳腺炎、幼牛腦膜炎、膿皰性外陰-陰道炎、龜頭炎、流產(chǎn)等疾病。IBRV可在牛體內(nèi)長(zhǎng)期存在甚至終身帶毒,從而造成牛的持續(xù)性感染,對(duì)奶牛的產(chǎn)奶量、育肥牛的增重、使役牛的使役力及公牛的繁殖力均有較大影響;繼發(fā)細(xì)菌與支原體感染可引起牛的支氣管炎和/或肺炎,治療不及時(shí)往往導(dǎo)致牛的死亡,大大增高了牛群的淘汰率和死亡率?，F(xiàn)在沒有治療IBR的特效藥物,國(guó)內(nèi)也沒有有效的上市疫苗。

牛副流感是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV-3)引起的一種熱性接觸性傳染病。BPIV-3屬于單股負(fù)鏈RNA病毒目副黏病毒科副黏病毒亞科呼吸道病毒屬,又被稱為運(yùn)輸熱病毒。自1959年Reisinger[8]等首次在美國(guó)分離到BPIV-3以來,法國(guó)、日本、前蘇聯(lián)、澳大利亞、加拿大、丹麥、巴拿馬和意大利等國(guó)家也相繼出現(xiàn)該病毒感染的報(bào)道[9];我國(guó)在近期才開始研究該病毒,根據(jù)最近幾年的文獻(xiàn)報(bào)道,BPIV-3己經(jīng)在我國(guó)內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、山東、山西和新疆等地存在[10-11]。臨床感染表現(xiàn)從無明顯的臨床癥狀到嚴(yán)重的呼吸道疾病:大部分感染BPIV-3的牛僅表現(xiàn)出流鼻涕、咳嗽、發(fā)熱等癥狀;但某些存在應(yīng)激的牛則表現(xiàn)出嚴(yán)重的組織損傷和免疫抑制,繼發(fā)細(xì)菌感染則表現(xiàn)為肺炎以及肺部、胸腔的出血性敗血癥;并且該病毒常與牛呼吸道合胞體病毒混合感染,使病情更加復(fù)雜[12]。目前該病在世界范圍內(nèi)流行,尤其是美洲和亞洲,每年都給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[13]。我國(guó)對(duì)該病的研究較少,也沒有相關(guān)有效的疫苗。

為了調(diào)查阿克蘇地區(qū)是否存在IBRV和BPIV-3的感染,本試驗(yàn)從該地區(qū)兩個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)采集18份可疑發(fā)病犢牛鼻液樣品,通過采用雙抗體夾心ELISA、PCR、RT-PCR的方法來檢測(cè)兩種病毒,為兩種疫病的防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品 于2015年2月從阿克蘇兩個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)采集1月齡以內(nèi)表現(xiàn)呼吸道癥狀的犢牛鼻液樣品18份,其中A場(chǎng)11份,B場(chǎng)7份,保存于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 主要試劑 IBRV、BPIV-3抗原雙抗體夾心ELISA試劑盒(TSZ)。購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;病毒DNA提取試劑盒(Cat:9766)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒,購(gòu)自TaKaRa公司;TRIZol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)有限公司;引物合成于北京華大基因科技有限公司;PCR MIX、DNA Marker,購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 將樣品從-80℃低溫冰箱取出,置于4℃冰箱融化。向裝有采樣棉簽的5 mL凍存管中加2 mL的生理鹽水,充分振蕩搖勻,使棉簽上的鼻液完全溶解,吸取1.2 mL的鼻液懸液于

1.5 mL的離心管中,10 000 r/min(4℃)離心 15 min,取全部上清液,經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾,得到待分離病毒樣品,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗原ELISA檢測(cè) 采用商品化牛傳染性鼻氣管炎病毒與牛副流感病毒3型抗原雙抗體夾心ELISA試劑盒,按照試劑盒說明書進(jìn)行具體操作。

1.3.3 IBRV PCR檢測(cè)

1.3.3.1 病毒DNA提取 將處理好的病毒樣品從-80℃低溫冰箱取出,置于4℃冰箱融化。IBRV DNA使用TaKaRa公司病毒提取試劑盒(Cat:9766)提取。(1)取200 μL處理過的樣品溶液裝于1.5 mL 的 EP 管中,加入 200 μL Buffer VGB、20 μL Proteinase K 和1.0 μL Carrier RNA,充分混勻后,放入56℃水浴鍋溫浴反應(yīng)10 min;(2)加入200 μL無水乙醇,用移液槍充分吸打均勻;(3)將Spin Column安置于 Collection Tube上,溶液移至 Spin Column中,12 000 r/min離心2 min,棄濾液;(4)將500 μL的Buffer RWA加入至Spin Column中,12 000 r/min離心1 min,棄濾液;(5)將700 μL的Buffer RWB沿管壁加入至Spin Column中,12000 r/min離心1 min,棄濾液;(6)重復(fù)步驟(5);(7)將Spin Column安置于Collection Tube上,12000 r/min離心2 min;(8)將Spin Column安置于新的1.5 mL Rnase free collection tube上,再向Spin Column膜的中央加入30～50 μL的Rnase free dH2O,室溫靜置5 min;(9)12 000 r/min離心2 min洗脫DNA,即得到病毒DNA。

1.3.3.2 引物合成 參考倪宏斌等設(shè)計(jì)的IBRV gD基因引物合成一對(duì)檢測(cè)引物,上游:5′-ACTGAACGCTGGCACACTAC-3′,下游:5′-TAGCCCTTCGACTCCTCAAA-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段大小為671 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3.3 gD基因的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)組分:PCR Mix 10 μL,上、下游引物各 0.5 μL,模板 3 μL,ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95℃5 min,變性94℃ 45 s,退火58℃ 45 s,延伸 72℃1 min,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.4 BPIV3 RT-PCR檢測(cè)

1.3.4.1 總RNA提取 使用TRIZol對(duì)全部處理過的樣品提取病毒總RNA。(1)取200 μL樣品上清液加入到經(jīng)1‰DEPC水浸泡且高壓滅菌過的1.5 mL離心管中,加入1 mL TRIZol,充分振蕩混勻,冰上放置15 min;(2)加入200 μL氯仿,混勻,冰上放置8 min,12 000 r/min(4℃)離心15 min;(3)將離心產(chǎn)生的上清液全部用移液槍移入一新的1.5 mL離心管內(nèi)(注意不要吸到沉淀),體積的異丙醇加入到離心管中,冰上放置20 min,12 000 r/min(4℃)離心15 min,棄上清,超凈臺(tái)內(nèi)干燥20 min;(4)沿管壁加入75%DEPC水乙醇1 mL,7 500 r/min(4℃)離心5 min,棄乙醇;超凈臺(tái)中干燥30 min;(5)向離心管中加入15 μL DEPC水,溶解后即得到病毒RNA,-40℃凍存?zhèn)溆没蛑苯佑梅崔D(zhuǎn)錄。

1.3.4.2 反轉(zhuǎn)錄 使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒,具體操作如下:(1)DNA的除去反應(yīng),反應(yīng)組分見表1。

(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)組分見表2。

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組分

(3)85℃瞬時(shí)熱激5 s即得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品。

1.3.4.3 引物合成 參考倪宏斌等設(shè)計(jì)的BPIV-3 gM基因引物合成一對(duì)檢測(cè)引物,上游:5′-TGATGATGCCCATATAACCAGA-3′, 下 游:5′-ATTCAAAATCCCCAAGTCCA-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段大小為394 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.4.4 gM基因的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)組分:PCR Mix 10 μL,上、下游引物各 0.5 μL,模板 3 μL,ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性 95℃ 5 min,變性94℃ 30 s,退火56.6℃ 30 s,延伸72℃45 s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)結(jié)果 使用IBRV抗原雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)出4份陽性樣品,檢出率為22.23%,使用BPIV-3抗原雙抗體夾心ELISA方法未檢測(cè)出BPIV-3。

2.2 IBRV PCR檢測(cè)結(jié)果 將采集的樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到預(yù)期671 bp大小的基因片段,見圖1。PCR方法檢測(cè)出13份陽性樣品,其中A場(chǎng)8份,B場(chǎng)5份,總檢出率為72.22%。

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 BPIV-3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 將采集的樣品經(jīng)RT-PCR檢測(cè),可擴(kuò)增得到預(yù)期394 bp大小的基因片段,見圖2.RT-PCR方法檢測(cè)出8份陽性樣品,檢出率為44.44%;其中4份同時(shí)檢測(cè)出IBRV,檢出率為22.22%。

圖2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 阿克蘇市周邊地區(qū)是南疆奶牛規(guī)?；B(yǎng)殖最集中的地區(qū),約有3萬余頭荷斯坦奶牛,本次調(diào)查僅對(duì)兩個(gè)奶牛場(chǎng)具有呼吸道癥狀的犢牛鼻拭子進(jìn)行了IBRV和BPIV-3檢測(cè),結(jié)果顯示,PCR方法檢測(cè) IBRV,檢出13份陽性樣品,感染率為72.22%;RT-PCR檢測(cè)BPIV-3,檢出8份陽性樣品,感染率為44.44%。說明在阿克蘇地區(qū)存在IBRV和BPIV-3的感染,且IBRV的感染率較高,兩個(gè)牛場(chǎng)均檢出較多的陽性樣本,提示該地區(qū)牛場(chǎng)應(yīng)實(shí)施IBRV疫苗的免疫接種,以有效控制該病的發(fā)生及擴(kuò)散。

3.2 18份樣品中有4份樣品同時(shí)檢測(cè)出IBRV和BPIV-3,說明在阿克蘇地區(qū)存在IBRV和BPIV-3的混合感染,感染率為22.22%。

3.3 抗原雙抗體夾心ELISA方法,IBRV的檢出率為22.22%,BPIV-3的檢出率為0%,遠(yuǎn)低于PCR與RT-PCR方法的檢出率,說明檢測(cè)牛鼻液中的兩種病毒,使用PCR與RT-PCR方法更合適。這種檢測(cè)差異同Socha W.和Rola J.等報(bào)道的一致[14]。

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