張瑩鈺,張迎春,王青青,胡建軍,王 娜,彭安業(yè),張婉琪,崔 鑫

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師畜牧獸醫(yī)工作站,新疆 阿拉爾 843300;3.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)引起成年牛冬痢、新生犢牛腹瀉和呼吸道疾病的主要病原。成年牛冬季嚴(yán)重水樣腹瀉,發(fā)病率高、死亡率低,而犢牛感染多見(jiàn)于1周齡內(nèi),腹瀉常發(fā)生于7～10日齡,以水樣性腹瀉為主要表現(xiàn),嚴(yán)重影響犢牛生長(zhǎng)性能。牛冠狀病毒與輪狀病毒感染相似,且兩者容易混合發(fā)生,進(jìn)而導(dǎo)致死亡率升高。感染冠狀病毒的患畜可通過(guò)糞便向環(huán)境排毒,即使癥狀恢復(fù)后18個(gè)月的時(shí)間里,仍可排出具有侵襲力的病毒[1],給養(yǎng)牛業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重影響。

近年來(lái),隨著新疆養(yǎng)牛業(yè)不斷發(fā)展,犢牛腹瀉發(fā)病率呈上升趨勢(shì),該病已經(jīng)成為危害養(yǎng)牛業(yè)的主要傳染病之一。因此,開(kāi)展?fàn)倥８篂a病原鑒定對(duì)疫病防控具有重要意義。本研究采用HCT-8細(xì)胞系,從新疆南疆某規(guī)模牛場(chǎng)疑似感染BCoV的犢牛糞便樣品中分離到1株病毒,依據(jù)冠狀病毒基因組中高度保守N基因作為基因分型基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物,運(yùn)用RT-PCR進(jìn)行基因分型鑒定,為該病的診斷、防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 新疆南疆某規(guī)?；?chǎng),犢牛春、冬季出現(xiàn)嚴(yán)重性腹瀉、脫水,呈淡黃色或灰白色水樣性糞便,并混有腸黏膜。病理剖檢,腸黏膜脫落、腸系膜淋巴結(jié)腫大。發(fā)病犢牛經(jīng)抗生素治療無(wú)效。無(wú)菌采集病死犢牛腸系膜淋巴結(jié)、腸內(nèi)容物等樣品,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 病毒檢測(cè)用RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;GoTap Green Master Mix,購(gòu)自Promega生物技術(shù)有限公司;RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit,購(gòu)自Thermo科技有限公司;HCT-8細(xì)胞,購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;胰蛋白酶、胎牛血清、1640營(yíng)養(yǎng)液、PBS等,購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。

1.3 冠狀病毒參考毒株 文章中涉及的冠狀病毒參考株均下載于NCBI中GenBank。

1.4 樣品處理 無(wú)菌取腹瀉犢牛腸道內(nèi)容物,PBS處理成10%懸液,經(jīng)4 000 r/min(4℃)離心10 min取上清,通過(guò) 0.22 μm的濾膜過(guò)濾兩次。儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒分離培養(yǎng) HCT-8細(xì)胞復(fù)蘇并傳至形態(tài)穩(wěn)定,且細(xì)胞密度約80%左右時(shí)棄去營(yíng)養(yǎng)液,PBS清洗2次,棄去清洗液。取1.5 mL處理后的樣品于無(wú)菌離心管中加1.5 μL胰蛋白酶,CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1 h,再接種于HCT-8細(xì)胞上,CO2培養(yǎng)箱中37℃作用2 h,期間每隔20 min輕輕搖晃1次,最后向細(xì)胞瓶加入10 mL維持液,置于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。每隔12 h觀察1次。72 h收獲培養(yǎng)液。收獲液反復(fù)凍融3次,再接種于HCT-8細(xì)胞,連續(xù)盲傳4～5代。每12 h鏡檢觀察細(xì)胞病變(Cytopathic Effect,CPE),待細(xì)胞病變后脫落面積達(dá)到50%左右收毒,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 樣品RNA的提取 取病毒CPE培養(yǎng)液,-80℃反復(fù)凍融3次,參照“病毒檢測(cè)用RNA提取試劑盒”說(shuō)明書操作提取RNA,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 cDNA第一鏈的合成 取模板RNA 2 μL加入離心管中,oligo(dT)18引物 1 μL、無(wú)核酸酶的ddH2O至12 μL,65℃孵育5 min,冰上冷卻,離心。按照順序加入:5X Reaction Buffer 4 μL、RiboLockTMRNA 酶抑制劑 (20 U/μL)1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAidTMM-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL,總體積 20 μL。 42 ℃孵育 60 min,70 ℃加熱5 min終止反應(yīng)。

1.8 引物 根據(jù)GenBank上BCoV U00735 Mebus參考毒株,利用DNA Star和Prime 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)針對(duì)BCoV高度保守基因N基因的特異性引物,序列如下:BCV-P1:5′-GAGCGTCCTTTGGAAATCGT-3′;BCV-P1:5′-GCTTAGTTACTTGCTGTGGC-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為730 bp,引物序列由上海先工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.9 RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系 以 BCV-P1、BCV-P2引物進(jìn)行PCR反應(yīng),采用50 μL反應(yīng)體系:Go Tap Green Master Mix 25 μL,引物 P1、P2 各1 μL,模板 cDNA5 μL,ddH2O18 μL 混勻后瞬時(shí)離心。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;95℃變性50 s,56℃退火45 s,72℃延伸50 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像儀中觀察,確定所擴(kuò)增片段大小。

1.10 PCR產(chǎn)物純化回收、克隆及測(cè)序 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳切膠后,按照DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。取膠回收RT-PCR產(chǎn)物連接到pGEMT載體上,再轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中得到重組菌,挑取白色單菌落,進(jìn)行PCR鑒定,陽(yáng)性菌落搖菌,提取質(zhì)粒。樣品送北京金锘銳杰基因科技有限公司測(cè)序。

1.11 序列分析 測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blastn,利用DNAStar軟件對(duì)BCV-Aks-01株與GenBank參考株N基因的核苷酸及氨基酸同源性進(jìn)行比較分析,并繪制N基因遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀、病理變化 病牛表現(xiàn)體弱消瘦,初期有輕度發(fā)熱,后期體溫變低。厭食,精神沉郁,水樣腹瀉,糞便為淡黃色或乳白色帶有黏液。病理剖檢,可見(jiàn)腸系膜淋巴結(jié)腫大,腸道黏膜脫落?？股刂委煙o(wú)效,嚴(yán)重者出生一周內(nèi)死亡。

2.2 病毒分離結(jié)果 病毒接種于HCT-8細(xì)胞第1代未出現(xiàn)CPE變化,第4代后開(kāi)始出現(xiàn)單層細(xì)胞大小不一的空洞,細(xì)胞變圓呈拉網(wǎng)狀,形成漂流體(圖1,a),而對(duì)照組則無(wú)CPE出現(xiàn)(圖1,b)。

圖1 BCV分離培養(yǎng)

2.3 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)提取RNA,采用冠狀病毒N基因特異性引物(BCVP1/BCVP2),RT-PCR擴(kuò)增,電泳得到730 bp大小的片段,與預(yù)期的目的片段大小相符(圖2)。

圖2 BCV-Aks-01株的RT-PCR鑒定

2.4 BCV-Aks-01株N基因核苷酸同源性分析 應(yīng)用DNAStar軟件,將下載的15個(gè)冠狀病毒科參考株N基因與BCV-Aks-01株的N基因片段進(jìn)行核苷酸同源性比較(見(jiàn)表1)。結(jié)果顯示,BCV-Aks-01片段與下載BCoV毒株的N基因核苷酸同源性為97.5%～98.6%,同BCoV參考毒株 Mebus同源性為97.8%,與國(guó)內(nèi) BCoV-YC(中國(guó)/2006,牛,FJ556872.1)、BCoVHLJ14(中國(guó)/2014,牛,KM985634.1)核苷酸同源性分別為97.5%、97.9%。而與其他參考序列相比,核苷酸同源性不足50%。將本試驗(yàn)所得測(cè)序序列提交到NCBI中 GenBank,獲得登錄號(hào):KT247647.1,命名為BCV-Aks-01。

2.5 BCV-Aks-1N基因遺傳進(jìn)化樹分析 根據(jù)冠狀病毒N基因序列核苷酸同源性比較分析,構(gòu)建BCVAks-1株與冠狀病毒科參考株N基因遺傳進(jìn)化樹,如封二彩版圖3所示。BCV-Aks-1與BCoV-YC、BCoVHLJ14、BCoV-F04(法國(guó)/2008,牛,KT318086.1)、BCoV-V270(德國(guó)/2006,牛,EF193074.1)、BCoVMebus(Mebus/2003,牛,U00735.2)、BCoV-Quebec(加拿大/1999,牛,AF220295.1)、BCoV-0502(韓國(guó)/2008,牛,EU401981.1)、BCoV-DB2(美國(guó)/1983,牛,DQ811784.2)毒株親緣關(guān)系均較近,屬于Betacoronavirus;而 MCoV-HKU13(中國(guó)香港/2015,文鳥,NC011550.1), 屬于 Deltacoronavirus;IBVBeaudette(英國(guó)/2002,雞蛋,M95169.1)、TCoV-ATCC(美國(guó)/2008,雞蛋,EU022526.1)、BWCoV-SW1(美國(guó)/2008,白鯨,EU111742.1),屬于 Gammacoronavirus;FCoVVR2202(美國(guó)/1979,貓,DQ010921.1)、TGV-MAD(美國(guó)/2005,豬,AJ271965.2)、CCoV-NTU336(中國(guó)臺(tái)灣/2010,犬,GQ477367.1),屬于 Alphacoronavirus。

3 討論

牛冠狀病毒是致?tīng)倥８篂a的主要病原之一,呈世界性分布。1972年美國(guó)的Mebus等[2]在新生犢牛腹瀉糞便中首次檢出BCoV。國(guó)內(nèi)學(xué)者亦報(bào)道我國(guó)有BCoV的存在。1985年宋廣林[3]等采用電鏡在犢牛腹瀉樣本中檢測(cè)到BCoV存在。姚火春[4]等(1990)在我國(guó)牛群中使用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)牛冠狀病毒杭體,陽(yáng)性率為80.2%,BCoV在我國(guó)普遍存在,同時(shí)也證實(shí)新疆 BCoV也存在。胡傳偉[5]等(2006)在東北三省進(jìn)行冠狀病毒血清學(xué)調(diào)查,BCoV抗體陽(yáng)性率100%。

新疆南疆某規(guī)模牛場(chǎng)新生犢牛出現(xiàn)水樣性腹瀉為主的癥狀,本研究結(jié)合新疆南疆某牛場(chǎng)犢牛腹瀉發(fā)病情況、發(fā)病特征、病理變化,對(duì)腹瀉死亡犢牛的腸內(nèi)容物采用HCT-8細(xì)胞上盲傳4代后出現(xiàn)細(xì)胞病變,收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。以冠狀病毒N基因設(shè)計(jì)特異性引物,RT-PCR檢測(cè),證實(shí)該牛場(chǎng)犢牛存在牛冠狀病毒感染。由于該病毒的樣本來(lái)源于病死犢牛的腸內(nèi)容,牛輪狀病毒與冠狀病毒常混合感染。為了鑒別診斷牛冠狀病毒是否與其他病毒混合感染,本研究同時(shí)應(yīng)用了牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉-黏膜病毒的特異性引物進(jìn)行了RT-PCR鑒別診斷,未獲得目的片段。說(shuō)明該病死犢牛感染冠狀病毒,而未有牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉-黏膜病毒混合感染的現(xiàn)象。張坤[6]等(2015)開(kāi)展的新疆北疆部分地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)致?tīng)倥８篂a冠狀病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查,也證實(shí)北疆地區(qū)規(guī)模牛場(chǎng)腹瀉犢牛存在牛冠狀病毒感染。上述分析說(shuō)明在新疆地區(qū)規(guī)模牛場(chǎng)存在牛冠狀病毒感染的情況。

根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)第九次報(bào)告中確立的冠狀病毒分類地位,冠狀病毒為套式病毒目(Nidovirales),冠狀病毒科(Coronaviridae)。該科下又分為冠狀病毒亞科(Coronavirinae)和環(huán)曲病毒亞科(Torovirinae)。冠狀病毒亞科進(jìn)一步分為Alpha-、Beta-、Gamma-以及新假定的屬Deltacoronavirus共4大類[7]。通過(guò)對(duì)冠狀病毒N基因核苷酸同源性、遺傳進(jìn)化樹的比較及分析,BCV-Aks-01株與參考毒株 BCoV-YC、BCoV-HLJ14、BCoVF04(法國(guó)/2008,牛,KT318086.1)、BCoV-V270(德國(guó)/2006,牛,EF193074.1)、BCoV-Mebus(Mebus/2003,牛,U00735.2)、BCoV-Quebec(加拿大/1999,牛,AF220295.1)、BCoV-0502(韓 國(guó)/2008,牛,EU401981.1)、BCoV-DB2(美國(guó)/1983,牛,DQ811784.2)均屬于Betacoronavirus。

本研究在病毒分離的基礎(chǔ)上[8],采用RT-PCR方法進(jìn)行病毒檢測(cè),提高了鑒定的準(zhǔn)確性。為新疆南疆地區(qū)規(guī)模牛場(chǎng)感染牛冠狀病毒病綜合防控的制定提供了重要參考依據(jù),也豐富了新疆牛冠狀病毒分子流行病學(xué)資料。

參考文獻(xiàn):

[1] Woods R D,Wesley R D.Transmissible gastroenteritis coronavirus carrier sow[J].Adv Ecp Med Biol,1998,440:641-647.

[2] Mebu s C A,St air E L,Rhodes M B.Pathology of neon at al cal f diar rhea induced by a coron aviru s-l ike agent[J].Vet Pathol,1973,10:45-64.

[3] 宋廣林,董惠蘭,滕慶,等.犢牛流行性腹瀉病原研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),1985,16(2):121-122.

[4] 姚火春,杜念興,徐為燕,等.牛冠狀病毒的血清流行病學(xué)調(diào)查[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1990,13(2):117-121.

[5] 胡傳偉,賈赟,簡(jiǎn)中友,等.東北三省冠狀病毒流行病學(xué)調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2006,12:88-89.

[6] 張坤,剡根強(qiáng),王靜梅,等.新疆北疆部分地區(qū)致?tīng)倥８篂a冠狀病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2015,45(12):1 270-1 276.

[7] Virus taxonomy,classification and nomenclature of viruses:ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.San Diego,CA:Academic Press,2012.

[8] 關(guān)新,樸范澤,侯喜林.牛冠狀病毒的分離鑒定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2007,19(2):55-58.