屈平平，李 濤，胡士林，田文儒

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109)

目前，熱應(yīng)激抑制早期胚胎發(fā)育的作用機(jī)理還不是很清楚。研究表明這可能是由以下兩方面引起的，一方面熱應(yīng)激本身作為細(xì)胞損傷因子對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生直接的細(xì)胞毒效應(yīng)，如破壞DNA分子的完整性[1,2]、改變蛋白質(zhì)圖譜[3,4]、促進(jìn)自由基的產(chǎn)生[4]、干擾細(xì)胞有絲分裂[5]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]等；另一方面胚胎抵抗熱應(yīng)激的防御系統(tǒng)不夠完善，如缺乏抵抗氧化應(yīng)激、保護(hù)蛋白質(zhì)正確組裝及降解變性蛋白的能力、不能有效的抵抗或修復(fù)熱應(yīng)激對(duì)胚胎的損傷。正常的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)是細(xì)胞器發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)和保證。因此，通過透射電子顯微鏡觀察熱應(yīng)激后胚胎線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，為判斷熱應(yīng)激對(duì)胚胎發(fā)育能力的影響提供更為準(zhǔn)確的依據(jù)，并為探索熱應(yīng)激抑制哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的作用機(jī)理提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為8～9周齡性成熟昆明種(KM)小鼠，體重25±5 g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼喂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料(購(gòu)于康大飼料有限公司)，自由飲水，并進(jìn)行光照控制(6:00～18:00光照，18:00～6:00黑暗)；溫度控制在18～25℃。適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，用于超數(shù)排卵。

1.2 試驗(yàn)藥品

NaCl、KCl、NaHCO3、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、EDTA、HEPES、BSA、谷氨酰胺、乳酸鈉、丙酮酸鈉、青霉素、硫酸鏈霉素、瓊脂糖等均購(gòu)自Sigma公司；PMSG和hCG購(gòu)自寧波三生藥業(yè)；25%戊二醛、鋨酸(0.5 g包裝)、Epon-812樹脂包埋試劑盒均購(gòu)自SPI公司；30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮；0.01 mol/L PBS等。

1.3 試驗(yàn)器材

體視顯微鏡(SZX-12，日本OLYMPUS公司)；

超純水系統(tǒng)(Synyhes，法國(guó)Milli-Q公司)；

CO2培養(yǎng)箱(Galaxy B，德國(guó) MMM 公司)；

透明加熱板(PW-1，日本富士平公司)；

超薄切片機(jī)(LKB-V，瑞典)；

透射電子顯微鏡(JEM-1200EX，日本)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 小鼠胚胎體外培養(yǎng)

2.1.1 小鼠超數(shù)排卵 將雌性小鼠于16:00腹腔內(nèi)注射PMSG(10IU/只)，48 h后腹腔注射hCG(10IU/只)，雌鼠注射hCG后立即與成熟雄鼠1:1合籠。所用雄鼠必須是至少在5d內(nèi)沒交配過的健康雄鼠。次日8:00檢查陰道栓，有陰栓者備用

2.1.2 CZB培養(yǎng)液的配制 試驗(yàn)以CZB系列培養(yǎng)液進(jìn)行小鼠胚胎體外培養(yǎng)。CZB系列培養(yǎng)液的配方見附錄7。Hepes-CZB用來(lái)沖胚和清洗胚胎。透明質(zhì)酸酶溶液的配制是在Hepes-CZB配方中不添加牛血清白蛋白(Bovine Aerum Albumin，BSA)的基礎(chǔ)上，按照0.1～0.3 mg/mL添加透明質(zhì)酸酶，用來(lái)除去受精卵周圍的卵丘細(xì)胞。胚胎培養(yǎng)液分為CZB和葡萄糖-CZB(G-CZB)兩種。G-CZB是在CZB培養(yǎng)液中添加1 mg/mL葡萄糖配制而成。4-細(xì)胞期前胚胎在CZB培養(yǎng)液培養(yǎng)，以免引起2-細(xì)胞期胚胎發(fā)育阻滯。4-細(xì)胞期以后的胚胎在G-CZB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2.1.3 小鼠原核胚收集及體外培養(yǎng) 在檢出陰栓當(dāng)天19:00左右，用脫臼法處死雌鼠，取出輸卵管和部分子宮角，在體視顯微鏡下，用1 mL注射器針頭將輸卵管壺腹部撕破，原核期胚胎連同顆粒細(xì)胞一起逸出。再將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至透明質(zhì)酸酶中，反復(fù)吹打，去除原核胚周圍的顆粒細(xì)胞。將形態(tài)完好的原核胚在Hepes-CZB中沖洗5次后，轉(zhuǎn)移至50μL預(yù)平衡6～12 h的CZB培養(yǎng)液微滴中，每個(gè)液滴放置30枚胚胎，置于37℃、5%CO2、100%RH的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)胚胎發(fā)育至4-細(xì)胞期時(shí)，將胚胎轉(zhuǎn)移至G-CZB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至早期囊胚，用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 小鼠囊胚分期 根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵出程度將囊胚分成1～6級(jí):

1級(jí)：早期囊胚(Early blastocysts)，囊胚腔體積小于囊胚總體積的一半；

2級(jí)：囊胚(Blastocysts)，囊胚腔體積大于囊胚總體積的一半；

3級(jí)：完全擴(kuò)張囊胚(Full blastocysts)，囊胚腔占據(jù)整個(gè)囊胚；

4級(jí)：擴(kuò)張后囊胚(Expanded blastocysts)，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴(kuò)大，透明帶變?。?/p>

5級(jí)：正在孵化的囊胚(Hatching blastocysts)，囊胚正在從透明帶破裂口孵出；

6級(jí)：孵化出的囊胚(Hatched blastocysts)，囊胚完全從透明帶中脫出。

2.2 熱應(yīng)激處理

將小鼠早期囊胚分別處以39℃、5.5%CO2和41℃、6%CO2熱應(yīng)激處理2 h。分別于熱應(yīng)激結(jié)束后立即收集胚胎和經(jīng)37℃、5%CO2恢復(fù)2 h時(shí)收集胚胎，制備透射電鏡樣品。對(duì)照組小鼠早期囊胚在37℃、5%CO2下培養(yǎng)。胚胎處理同熱應(yīng)激組。

2.3 制備透射電鏡樣品藥品配制

2.3.1 0.2mol/L pH7.4磷酸緩沖液(PB) 稱取53.65 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·7H2O)，溶解于雙蒸水，然后定容至1 000 mL，配制成0.2 mol/L 磷酸氫二鈉貯備液(A液)。再稱取27.60 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)，溶解于雙蒸水，然后定容至1 000 mL，配制成0.2 mol/L 磷酸二氫鈉貯備液(B液)。分別量取40.5 mL A液和9.5 mL B液，充分混和后即得到0.2 mol/L pH7.4 PB。

2.3.2 0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS) 稱取8.5～9 g NaCl，溶解于50 mL 0.2 mol/L PB中，然后加重蒸水，定容至1 000 mL。充分搖勻即可得到0.01 mol/L pH7.4 PBS。

2.3.3 2.5%戊二醛 量取10 mL 25%戊二醛溶液與50 m; 0.2 M PB(pH7.4)充分混和，然后再加蒸餾水定容至100 mL，即得到2.5%戊二醛固定液。

2.3.4 1%OsO4先用自來(lái)水洗去OsO4安瓿瓶上的標(biāo)簽，再用濃洗液浸泡4～8 h，用自來(lái)水清洗后再用蒸餾水清洗，然后用砂輪在安瓿瓶上劃痕，洗凈后再放入瓶中，蓋好瓶塞，用力撞擊安瓿，或者用清潔的玻璃棒敲碎安瓿。待其破后用25 mL重蒸水稀釋。將原液瓶封密，用黑紙包好于通風(fēng)櫥或者冰箱中待其完全溶解，即為2%OsO4儲(chǔ)存液。在通風(fēng)櫥中，取5 mL 2%OsO4儲(chǔ)存液和5 mL 0.2mol/L PB( pH7.4)，充分混和后，用黑紙包好于4℃冰箱中保存。

2.3.5 Epon-812包埋劑 先量取10 mL Epon-812，在磁力攪拌的攪拌下，緩慢加入16 mL DDSA，待充分混勻，得到A液；再量取10 mL Epon-812，在磁力攪拌的攪拌下，緩慢加入8.9 mL MNA，待充分混勻，得到B液；A液和B液按比例混合，(冬天1:4；夏天1:9)，待上述二液混勻后再按1.5%～2%的體積比，在充分?jǐn)嚢柚械渭覦NP-30。

2.3.6 硼砂甲苯胺藍(lán)染液 稱取1 g硼砂(四硼酸鈉)，用100 mL雙蒸水加熱溶解，再加入1 g甲苯胺藍(lán)，待全部溶解過濾，濾液即為甲苯胺藍(lán)染色液。

2.3.7 醋酸鈾染色液(飽和液) 稱取2 g醋酸鈾，溶解于100 mL 50%～70%乙醇，即得到pH4.2的醋酸鈾飽和液。

2.3.8 檸檬酸鉛染色液 分別稱取1.33 g硝酸鉛和1.76 g檸檬酸鈉，再加入30 mL雙蒸水，用力振蕩30 min，待化學(xué)反應(yīng)生成檸檬酸鉛，溶液呈現(xiàn)為乳白色的檸檬酸鉛混懸液，然后加入1 N氫氧化鈉8 mL，使檸檬酸鉛溶解，變成無(wú)色透明狀，最后再加雙蒸水至50 mL，此時(shí)溶液的pH為12。

2.3.9 2%瓊脂 稱取1 g瓊脂溶于50 mL的0.01 mol/L pH7.4的PBS中，加熱溶解，高壓滅菌，冷卻后儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 胚胎超薄切片制備

2.4.1 前固定 將預(yù)冷的2.5%戊二醛，在3.5 cm的塑料培養(yǎng)皿中作2個(gè)100μL的小液滴。在體視鏡下，用吸胚針將胚胎從培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移到固定液中，每個(gè)液滴中放置50枚胚胎。待固定10 min后再將胚胎在轉(zhuǎn)移到新鮮的固定液中，放4℃冰箱中再固定2 h。

2.4.2 清洗 同樣在3.5 cm的塑料培養(yǎng)皿中作3個(gè)100 μL的0.01 mol/L PBS小液滴，于體視鏡下，用吸胚針將胚胎從固定液中轉(zhuǎn)移至0.01 mol/L PBS中，室溫下清洗三次，每次10～15 min。

2.4.3 后固定 同樣做2個(gè)50～100 μL的1%鋨酸小液滴，將胚胎轉(zhuǎn)移到其中，室溫避光固定1.5 h。

2.4.4 清洗 同樣在3.5 cm的塑料培養(yǎng)皿中作3個(gè)100 μL的0.01 mol/L PBS小液滴，于體視鏡下，利用吸胚針將胚胎從固定液中轉(zhuǎn)移至0.01 mol/L PBS中，室溫下清洗三次，每次10～15 min。

2.4.5 瓊脂糖預(yù)包埋 將清洗好的胚胎用吸胚針小心的轉(zhuǎn)移到PCR反應(yīng)管，再加50 μL的PBS，2 000 r/min離心1～2 min。用小量程移液器小心吸棄PBS，慢慢加入100 μL 40℃左右的2%的瓊脂糖溶液，立即以2 000 r/min離心1～2 min。待瓊脂糖凝固后用牙簽將胚胎團(tuán)取出，然后切割成1～2 mm3的小瓊脂糖塊。

2.4.6 脫水 將瓊脂糖塊在青霉素小瓶中按照以下程序進(jìn)行脫水：先用30%丙酮4℃脫水15 min，再用50%丙酮4℃脫水15 min，然后在70%丙酮中4℃過夜；次日在80%丙酮中室溫脫水15 min，90%丙酮室溫脫水10 min，再經(jīng)100%丙酮室溫脫水2次，每次10 min。

2.4.7 滲透 將瓊脂糖塊先在Epon-812包埋劑與丙酮1:2(V/V)混和液中室溫滲透2 h，再在Epon-812包埋劑與丙酮2:1(V/V)混和液中室溫滲透4～6 h，然后在37℃干燥箱中，純Epon-812包埋劑中滲透4～6 h。浸透過程均在干燥器中進(jìn)行。

2.4.8 包埋 將Epon-812倒入平板包埋板中，用牙簽將瓊脂糖塊放入包埋劑中，37℃過夜，于次日早晨將瓊脂糖塊位置擺正。

2.4.9 聚合 將干燥箱調(diào)至45℃，聚合12 h, 然后在60℃聚合24 h～36 h。聚合完畢，關(guān)閉溫箱。待自然冷卻后，取出包埋塊，保存于干燥器中。

2.4.10 半薄切片和染色 用單面刀片修整聚合良好的胚胎團(tuán)頂端，直至胚胎團(tuán)表面成梯形，四邊修整成約45℃斜面，整個(gè)包埋塊類似于一個(gè)平頂?shù)乃?。用超薄切片機(jī)切出0.5μm的切片，用撈片鑷撈起切片，放在載玻片上，玻片置于酒精燈上加熱烘干(時(shí)間大約為1 min)。然后滴1滴1%甲苯胺藍(lán)染色液，繼續(xù)烘烤數(shù)秒鐘后冷卻1～2 min，再用自來(lái)水將玻片表面染液沖洗徹底后，濾紙吸干水分，自然干燥，光鏡下觀察，定位于形態(tài)完好的囊胚上。

2.4.11 超薄切片及染色 根據(jù)半薄切片提示，將胚胎團(tuán)頂端平面修整為長(zhǎng)2 mm、寬1 mm的長(zhǎng)方形，用超薄切片機(jī)切出50～100 nm超薄切片，再用直徑3 mm、200目銅網(wǎng)撈起，濾紙吸干后用蠟盤進(jìn)行醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，蒸餾水沖洗后在透射電子顯微鏡下觀察。

2.5 圖片處理

所有圖片采用Adobe Photoshop 7.0 軟件處理。

3 結(jié)果

在37℃、5%CO2條件下正常培養(yǎng)的小鼠早期囊胚細(xì)胞中，可見到大量的線粒體分布于胞質(zhì)中，圍繞細(xì)胞核排列(見圖A)。大部分線粒體為呈圓形或帽狀的不成熟線粒體，線粒體基質(zhì)密度較大，在線粒體的邊緣具有不發(fā)達(dá)的弓形嵴；少數(shù)線粒體為橢圓形或棒狀的成熟線粒體，具發(fā)達(dá)的橫嵴，基質(zhì)較淺；還有一些線粒體為不成熟線粒體狀態(tài)和成熟線粒體的過渡態(tài)，線粒體開始變大，拉長(zhǎng)，并有橫嵴出現(xiàn)。39℃熱應(yīng)激組小鼠早期囊胚細(xì)胞內(nèi)線粒體發(fā)生輕微腫脹，還有少量線粒體發(fā)生空泡化(見圖B、C)；熱應(yīng)激結(jié)束后胚胎經(jīng)37℃再培養(yǎng)2 h，腫脹的線粒體能夠恢復(fù)到正常。41℃熱應(yīng)激組小鼠早期囊胚細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)目減少，線粒體嚴(yán)重變形和腫脹(見圖D)；腫脹的線粒體變大變圓，基質(zhì)變淺呈透明形態(tài)、嵴變短變少甚至消失(見圖E)；有的線粒體嵴排列紊亂不清晰見圖F)。熱應(yīng)激結(jié)束后胚胎經(jīng)37℃再培養(yǎng)2 h，線粒體變形和腫脹現(xiàn)象沒有得到緩解。

圖A-F 不同強(qiáng)度熱應(yīng)激后小鼠早期囊胚線粒體的形態(tài)變化注：A：37℃正常培養(yǎng)組胚胎；B-C：39℃熱應(yīng)激組胚胎；D-F：41℃熱應(yīng)激組。其中：M為線粒體，SM為腫脹線粒體，N為細(xì)胞核，Nu為核仁，Ly為溶酶體，RER為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，LD為脂滴。

4 討論

熱應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯的機(jī)制還不清楚。當(dāng)其他細(xì)胞遭受熱應(yīng)激時(shí)，會(huì)發(fā)生線粒體腫脹、畸形、活力低下、膜電位降低[7-9]、骨架重排[10,11,12]、蛋白質(zhì)集聚[13]、細(xì)胞器重排或崩解[14]、膜結(jié)構(gòu)和通透性變化[15,16]等變化。熱應(yīng)激所導(dǎo)致的各種細(xì)胞器形態(tài)、數(shù)量、位置的變化，既是熱應(yīng)激損傷胚胎細(xì)胞器的一種表現(xiàn)，也是胚胎對(duì)抗熱應(yīng)激的一種保護(hù)性反應(yīng)。熱應(yīng)激損傷和胚胎自我保護(hù)之間的相互對(duì)抗決定著細(xì)胞的存亡。

線粒體是對(duì)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激最為敏感的細(xì)胞器之一。在熱應(yīng)激刺激下，線粒體內(nèi)膜上PTP開啟，由于線粒體基質(zhì)內(nèi)的高滲透壓，細(xì)胞內(nèi)容物無(wú)選擇性內(nèi)流，以致線粒體基質(zhì)發(fā)生腫脹。PTP的開啟還會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)外H+梯度消失，呼吸鏈脫偶聯(lián)，ATP合成受阻，能量供應(yīng)不足。另外，線粒體上PTP孔道開放，使膜間隙中與凋亡相關(guān)的活性物質(zhì)，如細(xì)胞色素C、AIF、Smac/DIABLO等釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-19]。在本研究中， 39℃ 2 h熱應(yīng)激僅導(dǎo)致小鼠早期囊胚的線粒體輕微腫脹和少數(shù)線粒體發(fā)生空泡化，熱應(yīng)激后胚胎在37℃再培養(yǎng)2 h后，線粒體形態(tài)基本上恢復(fù)到正常。而41℃ 2 h熱應(yīng)激導(dǎo)致小鼠早期囊胚的線粒體嚴(yán)重變形，高度腫脹；損傷的線粒體被溶酶體吞噬、消化，最后在溶酶體中形成嗜鋨小體或髓樣小體。熱應(yīng)激胚胎經(jīng)37℃再培養(yǎng)2 h后，線粒體異常仍舊非常嚴(yán)重。說明41℃熱應(yīng)激2 h對(duì)線粒體損傷程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了線粒體的自我修復(fù)能力，這可能是41℃熱應(yīng)激2 h導(dǎo)致小鼠早期囊胚后續(xù)發(fā)育力下降的主要原因之一。

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