李國烈，蔣金芳，蘇 旭，覃明麗，杜 鑫，何沛蓉，何家國

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桑葚中克百威和3-羥基克百威殘留量測定

李國烈，蔣金芳，蘇 旭，覃明麗，杜 鑫，何沛蓉，何家國

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，四川南充 637000)

建立了桑葚中克百威和3-羥基克百威殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)。桑葚樣品經(jīng)乙腈提取，石墨化碳黑氨基復(fù)合柱(Carbon/NH2)凈化，以甲醇和0.1%甲酸水溶液作為流動相洗脫，采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進行采集，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，克百威和3-羥基克百威在1.00~200.00 μg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.99，方法檢出限均為0.25 μg/kg，定量限均為1.00 μg/kg。在1.00~100.00 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率、精密度和基質(zhì)效應(yīng)均滿足分析方法要求。該試驗方法適用于桑葚中克百威和3-羥基克百威殘留量的測定。

桑葚；克百威；3-羥基克百威；殘留；基質(zhì)效應(yīng)；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

克百威(carbofuran)和3-羥基克百威(3-hydroxycarbofuran)屬于廣譜、高效的氨基甲酸酯類殺蟲、殺螨、殺線蟲劑，具有內(nèi)吸、觸殺、胃毒作用，并有一定的殺卵作用，曾廣泛用于害蟲的防治，如蚜蟲、害螨等[1-4]。但是，由于克百威和3-羥基克百威具有高毒性，現(xiàn)已經(jīng)被美國及我國明令禁止用于部分農(nóng)產(chǎn)品，農(nóng)業(yè)部199號公告禁止克百威在蔬菜、果樹、茶葉和中草藥材上使用[5-7]。然而，由于克百威和3-羥基克百威具有良好的防治效果，在生產(chǎn)中還存在違規(guī)使用的現(xiàn)象，在蔬菜、水果上時有檢出[8]。GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定，其殘留物為克百威和3-羥基克百威之和，以克百威表示，在水果中的最大殘留限量為0.02 mg/kg[9]。

目前，克百威和3-羥基克百威在蔬菜和水果中的殘留檢測報道比較多，檢測基質(zhì)包括了辣椒、黃瓜、豇豆、番茄、蘋果、葡萄、草莓、蜂蜜、小麥、水稻和土壤等[1,4-7,10-15]，但尚未見這2種農(nóng)藥在桑葚基質(zhì)中的殘留檢測報道。本試驗建立了桑葚中克百威和3-羥基克百威殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(UPLC-MS/MS)，以期為桑葚中克百威和3-羥基克百威的殘留檢測提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品和試劑

克百威(標(biāo)準品編號為GBW(E)081312)和3-羥基克百威(標(biāo)準品編號為GBW(E)081313)標(biāo)準品購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)，甲醇、乙腈、甲苯、甲酸均為質(zhì)譜級，購自Fisher公司。

1.2 儀器和設(shè)備

超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(Waters，UPLC-TQS)，色譜柱(Waters，Xbridge C18，3.5 μm 3.0×50 mm)，固相萃取裝置(Agilent)，50 mL離心管(Eppendorf)，固相萃取小柱(Agilent，Mega BE CARB/NH2500 mg/6 mL)，搖床(IKA，HS501)，氮吹儀(Organomation，N-EVAP112)，旋渦混合器(IKA，Vortex Genius 3)，離心機(Sigma，3-18KS)，超純水儀(Millipore，Milli-Q)以及微孔濾膜(津騰，PTFE 0.22 μm)等。

1.3 樣品前處理

準確稱取勻漿后的桑葚樣品10.00 g于50 mL離心管中，加入20.00 mL乙腈，置于搖床上振搖30 min，加入5 g氯化鈉，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，置于離心機中10 000 r/min離心10 min，移取上清液10.00 mL待凈化。

1.4 樣品凈化

將移取的10.00 mL提取液加入已經(jīng)過5 mL乙腈＋甲苯(體積比為3︰1)預(yù)淋洗Mega BE CARB/NH2柱，收集淋洗液，再用25 mL乙腈＋甲苯(體積比為3︰1)分5次洗脫，合并淋洗液，于40 ℃氮吹吹至近干，用5.00 mL 50%甲醇定容，旋渦混合器混勻后過0.22 μm濾膜，待檢測。

1.5 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件

流動相采用甲醇、乙腈和含有0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫，洗脫程序見表1，流動相使用前用超聲波脫氣。色譜柱溫：35 ℃，樣品室溫度16 ℃，進樣量：1 μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進行采集。脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮氣，流量分別為1 000 L/h和150 L/h，碰撞氣為高純氬氣，流量為0.10 mL/min，脫溶劑溫度為500 ℃。定量離子對、定性離子對、毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞電壓等相關(guān)參數(shù)見表2。

表1 流動相及梯度洗脫條件

表2 測定桑葚中克百威和3-羥基克百威殘留的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 方法標(biāo)準曲線和檢測限

用桑葚空白基質(zhì)溶液配制濃度為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 μg/L的克百威和3-羥基克百威基質(zhì)標(biāo)準溶液，采用1.5儀器條件進行分析，分別以克百威和3-羥基克百威定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準曲線，并進行回歸分析求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準曲線采用Masslynx V4.1軟件繪制。檢出限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品進行測定，采用Masslynx V4.1軟件計算克百威和3-羥基克百威的信噪比(S/N)，以S/N≥3時的樣品濃度為方法檢出限[16]。

1.7 方法回收率和精密度

回收率試驗采用加標(biāo)回收試驗法。取桑葚空白樣品，按照添加濃度1.00、10.00、100.00 μg/kg3分別加入相應(yīng)的克百威和3-羥基克百威標(biāo)品溶液中，每個濃度水平做6個平行。所有樣品按1.3和1.4進行樣品前處理，采用1.5儀器條件測定藥物濃度，根據(jù)隨行測定的基質(zhì)標(biāo)準曲線計算樣品的實測濃度?；厥章?%)=樣品實測濃度/樣品理論濃度×100%。精密度試驗采用加入法，參照回收率試驗方法，所有樣品連續(xù)測定3 d，根據(jù)隨行測定的基質(zhì)標(biāo)準曲線計算樣品的實測濃度，采用Microsoft Excel 2010軟件計算該方法的日內(nèi)和日間精密度。

1.8 方法基質(zhì)效應(yīng)

采用Matuszew ski等[17]提出的方法，比較不同條件下的峰面積平均值。在純的克百威和3-羥基克百威標(biāo)品溶液(A)，桑葚樣品基質(zhì)提取后添加克百威和3-羥基克百威標(biāo)品(B) 2個條件下，分別采用1.00、10.00、100.00 μg/L 3個質(zhì)量濃度來評價克百威和3-羥基克百威在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，每個條件下重復(fù)測定5個樣品，基質(zhì)效應(yīng)為B/A。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法選擇性

該試驗條件下，克百威和3-羥基克百威采用反相液相色譜分離，流動相中加入0.1%體積分數(shù)的甲酸來提高ESI+的離子化效率。結(jié)果表明，克百威和3-羥基克百威保留時間分別為4.61 min和3.84 min，峰形及分離度良好，且可獲得較強的分子離子峰強度，桑葚基質(zhì)對桑葚樣品中克百威和3-羥基克百威的測定干擾小。克百威基質(zhì)標(biāo)準溶液圖譜、克百威桑葚空白樣品圖譜和克百威桑葚加標(biāo)樣的圖譜分別見圖1、圖2和圖3；3-羥基克百威基質(zhì)標(biāo)準溶液圖譜，3-羥基克百威桑葚空白樣品圖譜和3-羥基克百威桑葚加標(biāo)樣的圖譜分別見圖4、圖5和圖6。

2.2 標(biāo)準曲線和檢測限

克百威和3-羥基克百威基質(zhì)匹配標(biāo)準曲線在質(zhì)量濃度1.00~200.00 μg/L時線性關(guān)系良好，標(biāo)準曲線回歸方程分別為=3.385 25×107+927.5(2=0.999，權(quán)重為1/)和=4.841 57×106+190.8(2=0.999，權(quán)重為1/)。以3倍基線噪音的藥物濃度為最低檢出限，克百威和3-羥基克百威在桑葚中的方法檢出限均為0.25 μg/kg。以4倍方法檢出限為定量限，則克百威和3-羥基克百威在桑葚中的定量限為1.00 μg/kg[16]。

圖1 克百威基質(zhì)標(biāo)準溶液圖譜(5.00 μg/L)

圖2 克百威桑葚空白樣品圖譜

圖3 克百威桑葚加標(biāo)樣圖譜(5.00 μg/kg)

圖4 3-羥基克百威基質(zhì)標(biāo)準溶液圖譜(5.00 μg/L)

圖5 3-羥基克百威桑葚空白樣品圖譜

圖6 3-羥基克百威桑葚加標(biāo)樣圖譜(5.00 μg/kg)

2.3 方法回收率和精密度

該試驗條件下，克百威和3-羥基克百威在桑葚中3個添加濃度下的回收率分別為106.72%、96.01%、89.68%和100.62%、95.65%、87.45%，相對標(biāo)準偏差均在5.00%以內(nèi)(表3)，表明該試驗方法在測定桑葚中克百威和3-羥基克百威的殘留時具有較好的回收率。方法的日內(nèi)精密度相對標(biāo)準偏差分別為4.22%、2.07%、2.25%和2.19%、2.80%、1.59%，日間精密度相對標(biāo)準偏差分別為4.00%、3.57%、3.74%和3.64%、4.52%、2.57%(表4)，表明該試驗方法在檢測桑葚中的克百威和3-羥基克百威時，具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.4 方法基質(zhì)效應(yīng)

在該試驗條件下，采用Matuszew ski等[17]提出的方法從3個質(zhì)量濃度水平來評價克百威和3-羥基克百威在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，其結(jié)果見表3。在1.00、10.00、100.00 μg/L 3個質(zhì)量濃度水平下，克百威在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)分別為(91.92±4.04)%、(91.07±0.78)%和(90.61±1.32)%，3-羥基克百威在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)分別為(94.30±5.14)%、(91.30±1.10)%和(91.73±1.11)%。從結(jié)果可知，2種農(nóng)藥在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，并都隨著藥物添加質(zhì)量濃度的增加而增強，但基質(zhì)效應(yīng)平均值為90.61%~94.30%，說明基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響較小。

表3 桑葚中克百威和3-羥基克百威的回收率(n=6)

表4 桑葚中克百威和3-羥基克百威的日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)

表5 3個不同質(zhì)量濃度下的信號峰面積及基質(zhì)效應(yīng)(n=5)

3 結(jié) 論

該試驗中桑葚樣品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基復(fù)合柱凈化，超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定其中克百威和3-羥基克百威的殘留量。此法前處理過程操作簡便，方法的選擇性、檢測限、回收率、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和標(biāo)準曲線線性范圍及其相關(guān)系數(shù)均滿足樣品分析方法要求，適用于桑葚中克百威和3-羥基克百威的殘留檢測。

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Determination of Carbofuran and 3-Hydroxycarbofuran Residues in Mulberry

LI Guolie, JIANG Jinfang, SU Xu, QIN Mingli, DU Xin, HE Peirong, HE Jiaguo

(Nanchong Monitoring and Test Center for Agricultural Products Quality, Nanchong 637000, China)

An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) assay for quantification of carbofuran and 3-hydroxycarbofuran, in mulberry was developed. The carbofuran and 3-hydroxycarbofuran were extracted by acetonitrile，purified by Carbon/NH2and analyzed with a methanol-0.1% formic acid solution-acetonitrile mobile phase. The residues of carbofuran and 3-hydroxycarbofuran were determined by multiple reaction monitoring (MRM) mode with positive electrospray ionization (ESI+)，and quantified by the method of external standard. The results showed that the calibration curves were good linear relationship between the ratio of the peak areas and the concentrations of from 1.00 to 200 μg/L and the correlation coefficient (R) was both more than 0.99. The limits of detection were 0.25 μg/kg and the limit of quantification were 1.00 μg/kg. The recovery, precision and matrix effect of this method, with 1.00－100 μg/kg additive amount, can meet the requirements of analytical method. This method was suitable for the determination of carbofuran and 3-hydroxycarbofuran residues in mulberry.

mulberry; carbofuran; 3-hydroxycarbofuran; residue; matrix effect; UPLC-MS/MS

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2018.02.13

TQ450.7

A

1009-6485(2018)02-0057-06

李國烈(1984—)，男，四川巴中人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測工作，E-mail: glie2012@163.com。

2018-01-22。