常文仙，張和倩，周雙男，黃輝煌，涂 波，周春保，張紀(jì)元，王福生

AIDS是由HIV-1感染引起的免疫缺陷性疾病，其免疫學(xué)特征有CD4+T細(xì)胞進行性減少，持續(xù)性免疫激活和系統(tǒng)性炎癥[1-2]。隨著高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active anti-retroviral therapy,HAART）的應(yīng)用，HIV-1/AIDS患者免疫功能逐漸恢復(fù)，生活質(zhì)量得以改善，AIDS相關(guān)性死亡明顯減少[3]。但HIV-1感染者還是具有較高的發(fā)病率和病死率，每年仍有很多患者死于心血管病或腫瘤等非AIDS相關(guān)事件[4-5]。研究證實，HIV-1感染中，持續(xù)的免疫激活不僅與疾病進展密切相關(guān)，而且與患者早期免疫衰老和發(fā)病率增加有關(guān)[6-7]。因此，人們猜測HIV-1感染者發(fā)生非AIDS相關(guān)事件和死亡的風(fēng)險增加也是由于持續(xù)的免疫激活所致[8]。

CD73是一種胞外核苷酸酶，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞表面，其與另一種核苷酸酶CD39協(xié)同作用將ATP轉(zhuǎn)化為腺苷，腺苷與相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[9-10]。炎癥或應(yīng)激條件下，ATP從受損細(xì)胞內(nèi)釋放，與其受體結(jié)合激活免疫細(xì)胞從而促進炎性反應(yīng)。CD39和CD73將ATP逐步水解生成腺苷，一方面降低了ATP引起的炎性反應(yīng)，另一方面生成的腺苷本身就是免疫抑制性物質(zhì)[11]。腺苷不僅能抑制淋巴細(xì)胞的活化和增殖，還可以調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞的作用，抑制其細(xì)胞因子的釋放，從多方面降低免疫反應(yīng)，避免過度的免疫活化[12-13]。因此，CD39/CD73/腺苷途徑作為“免疫開關(guān)”，將ATP驅(qū)動的促炎反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛上佘战閷?dǎo)的抗炎狀態(tài)[14]，其在HIV-1感染相關(guān)的免疫活化中發(fā)揮的作用逐漸受到重視。

研究報道，HIV-1感染者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells,Tregs）上CD39表達(dá)上調(diào)，并協(xié)同Tregs抑制免疫反應(yīng)，有助于控制免疫活化[15-16]。同時Moreno-Fernandez等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1感染早期，CD39+Tregs可通過CD39依賴機制抑制T細(xì)胞內(nèi)HIV-1的復(fù)制，對機體起到保護作用。此外，Nikolova等[16]報道CD39的變異體在非洲人群和亞洲人群中表達(dá)水平不同，而且具有延緩AIDS進展的作用。CD73是CD39/CD73/腺苷途徑的限速酶，研究發(fā)現(xiàn)HIV-1感染者外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞上CD73的表達(dá)均明顯減少，且與AIDS進展相關(guān)[18-20]。但對于不同地區(qū)的HIV-1感染群體，其T細(xì)胞上CD73的變化特點及其與疾病進展的關(guān)系還不清楚。CD38是活化性分子，檢測CD38+CD8+T細(xì)胞的頻率可以反映HIV-1感染者T細(xì)胞的活化程度。因此，本研究針對我國HIV-1感染者外周血CD8+T細(xì)胞上CD73的表達(dá)情況展開研究，并分析其與AIDS疾病進展和T細(xì)胞活化的關(guān)系，進而探討CD73/腺苷通路在中國AIDS人群疾病進展中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 本研究入選HIV-1感染者65例，所有病例均來自解放軍第三〇二醫(yī)院2016年4月—2017年2月期間的門診患者，平均年齡為（34.2±9.6）歲，所有患者為未接受抗病毒治療，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會艾滋病學(xué)組2015年修訂的《艾滋病診療指南》[21]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18歲和＞65歲者；②目前存在機會性感染者；③妊娠婦女或產(chǎn)褥期婦女；④有精神疾病或其他嚴(yán)重疾病者；⑤不愿意合作者。如表1所示，HIV-1感染者根據(jù)CD4+T細(xì)胞計數(shù)分為CD4+T細(xì)胞計數(shù)≥ 200個/μl組和＜ 200個/μl組。另外在病例收集期間納入27例實驗室同事作為健康對照（health control,HC），平均年齡為（32.7±6.8）歲。所有病例及健康對照均簽署知情同意書。

1.2 試劑 本實驗所用的主要熒光抗體包括鼠抗人CD8-PerCP、鼠抗人CD38-APC、鼠抗人CD3-FITC/CD45-PerCP/CD8-PE/CD4-APC抗體組合均購自美國BD Biosciences公司；鼠抗人CD3-BV510、鼠抗人CD73-BV421購自美國Biolegend公司，同時購買對應(yīng)的同型對照抗體。

1.3 方法

1.3.1 CD4+T細(xì)胞計數(shù) 取HIV-1感染者新鮮采集的EDTA抗凝血50 μl至Trucount管內(nèi)，加入CD3/CD45/CD8/CD4抗體組合共20 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min，加入免洗溶血素450 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min后利用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測，實驗數(shù)據(jù)用MultiSET軟件進行分析[22]，得到CD3+、CD4+及CD8+T細(xì)胞計數(shù)。1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測CD8+T細(xì)胞上CD73和CD38的表達(dá) 取新鮮采集的EDTA抗凝血300 μl至5 ml流式管內(nèi)，依次加入熒光標(biāo)記抗體CD3-BV510 5 μl、CD8-PerCP 5 μl、CD73-BV421 5 μl、CD38-APC 20 μl；另設(shè)同型對照管，依次加入熒光抗體CD3-BV510、CD8-PerCP、IgG-APC各20 μl及 IgG-BV421 5 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min，加入3 ml溶血素，震蕩后避光10 min，1600 rpm離心5 min，棄去上清，再用2 ml PBS洗滌2遍，離心后棄上清，加300 μl 1%多聚甲醛固定，放入4 ℃冰箱，24 h內(nèi)使用FACS Verse型流式細(xì)胞儀檢測[31]，實驗數(shù)據(jù)用Flowjo 7.6軟件進行分析。

1.3.3 血漿HIV-1 RNA檢測 取EDTA抗凝血6 ml，2000 rpm離心10 min，吸取血漿，放入-80 ℃冰箱凍存。待標(biāo)本收集完全后，取400 μl血漿，利用HIV-1核酸定量檢測試劑盒（QIAGEN）， 在 CFX96TM Real-Time system型熒光定量PCR分析儀（BIO-RAD）上定量檢測血漿中HIV-1 RNA。擴增的靶核酸位置是HIV gag區(qū)，可擴增HIV-1 M群的A-H亞型和N群基因型樣本。實驗設(shè)1個內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品，陰性質(zhì)控，結(jié)果以每毫升血漿含病毒拷貝數(shù)表示[24]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析并用GraphPad Prism 5.0制圖。正態(tài)分布的定量資料以±s表示，非正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)（最小值，最大值）表示。2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞的頻率變化 統(tǒng)計顯示，HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞的頻率明顯低于HC組（U= 139.000，P= 0.001），見圖1A。HIV-1感染者的組間比較顯示，CD4+T細(xì)胞計數(shù)＜ 200個/μl組的外周血CD73+CD8+T細(xì)胞的頻率顯著低 于CD4+T細(xì)胞計數(shù)≥ 200個/μl組（U=206.500，P= 0.017），見圖1B。

2.2 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)的變化 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)明顯低于HC組（U=301.000，P=0.001），見圖1C。CD4+T細(xì)胞計數(shù)＜ 200個 /μl組外周血CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)顯著低于CD4+T 細(xì)胞計數(shù)≥ 200個 /μl組（U= 180.000，P=0.005），見圖1D。

圖1 HIV-1感染者CD73+CD8+ T細(xì)胞頻率和絕對計數(shù)的變化Figure 1 Change of the frequency and absolute count of CD73+CD8+ T cells in HIV-1 infected patients

2.3 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)、頻率與CD4+T細(xì)胞計數(shù)的相關(guān)性 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞的絕對計數(shù)、頻率均與其CD4+T細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)（r=0.555，P=0.001；r=0.342，P=0.005），見圖2 A和B。

2.4 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)與HIV-1載量的相關(guān)性 HIV-1感染者CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)與血漿HIV-1載量呈現(xiàn)弱負(fù)相關(guān)（r=-0.261，P=0.035），見圖2C，但其頻率與HIV-1載量之間沒有相關(guān)性（r=-0.140，P=0.265），見圖2D。

2.5 HIV-1感染者CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)、頻率與CD38+CD8+T細(xì)胞頻率的相關(guān)性 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞的絕對計數(shù)和頻率均與其CD38+CD8+T細(xì)胞頻率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.384，P=0.002；r=-0.387，P=0.001），圖3A和B。

3 討 論

持續(xù)的免疫活化和系統(tǒng)性炎癥是HIV-1慢性感染期的重要特征，可加快HIV-1/AIDS患者免疫衰老和系統(tǒng)老化的過程，對患者的預(yù)后和生存帶來諸多不利影響[25]。HIV-1感染中免疫過度活化的主要原因是循環(huán)中HIV-1的持續(xù)存在，病毒直接或間接作用于機體免疫系統(tǒng)，引起廣泛性免疫活化[6]。但在部分HAART后血漿病毒載量低于檢測下限的患者中仍能觀察到持續(xù)的免疫激活反應(yīng)，表明除了病毒本身的作用外，還有其他引起免疫激活的因素存在，如腸道菌群的移位，其他病毒如巨細(xì)胞病毒的再活化以及體內(nèi)T細(xì)胞的平衡失調(diào)等[19]。

圖2 HIV-1感染者CD73+CD8+ T細(xì)胞絕對計數(shù)、頻率與CD4+ T細(xì)胞計數(shù)和HIV-1載量的相關(guān)性Figure 2 Correlation of absolute count and frequency of CD73+CD8+ T cells with CD4+ T cell count and HIV-1 viral load in HIV-1 infected patients

CD38是衡量T細(xì)胞活化水平的主要表面分子，有研究表明CD38+CD8+T細(xì)胞在HIV-1感染者體內(nèi)顯著增多，既反映了HIV-1/AIDS患者的免疫活化水平，也是疾病進展的獨立預(yù)測因素[26]。本研究就HIV-1感染后CD73+CD8+T細(xì)胞與AIDS進展的關(guān)系及其在T細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫活化方面的作用展開研究。本研究首先檢測了CD73在HC及HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與HC組相比，HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞的頻率和絕對計數(shù)均明顯減少，且CD4+T細(xì)胞計數(shù)＜ 200個/μl的AIDS患者減少更為明顯，相關(guān)性分析顯示CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)與CD4+T細(xì)胞計數(shù)呈明顯正相關(guān)。本研究結(jié)果與國外的報道一致[18-20]，后又進一步證實HIV-1感染者體內(nèi)CD73+CD8+T細(xì)胞減少并與AIDS疾病進展密切相關(guān)。CD38是T細(xì)胞活化的分子標(biāo)志，本研究中HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞的頻率及絕對計數(shù)均與其CD38+CD8+T細(xì)胞頻率呈負(fù)相關(guān)，提示該群細(xì)胞在控制T細(xì)胞活化方面具有一定作用。

此外，關(guān)于CD73+CD8+T細(xì)胞對抗病毒免疫應(yīng)答的影響，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，只有CD73+CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)與HIV-1感染者血漿中病毒載量呈弱負(fù)相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)（r=0.261）較小，這可能與實驗樣本量不足或個體差異有關(guān)，但總體可見HIV-1感染者中CD73+CD8+T細(xì)胞的減少不利于病毒的清除。國外研究認(rèn)為CD73+T細(xì)胞可通過生成腺苷抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)[19]，因此CD73+CD8+T細(xì)胞的減少應(yīng)該有助于抗病毒免疫反應(yīng)，但本研究的結(jié)果與之相反，提示CD73+CD8+T細(xì)胞在抗病毒免疫方面可能存在其他未知的機制，需要更深入的研究加以證實。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細(xì)胞的絕對計數(shù)和頻率均明顯減少，并與T細(xì)胞活化和AIDS進展密切相關(guān)。而關(guān)于CD73+CD8+T細(xì)胞減少的原因以及其影響病毒載量和T細(xì)胞活化的相關(guān)機制目前還不清楚，未來可以針對這幾方面展開研究，從而闡明該群細(xì)胞在AIDS疾病進展中的作用機制。

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