劉犀靈，任發(fā)政，2，雷新根，3，侯彩云，2

(1北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院/食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3美國(guó)康奈爾大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，紐約 14853)

糖尿病是一種與胰島素分泌障礙及能量代謝紊亂相關(guān)的慢性疾病[1-3]。茶葉中含有豐富的活性物質(zhì)，具有抗氧化[4]、預(yù)防肥胖[5]、增強(qiáng)免疫[6]等多種功效，其降血糖作用及機(jī)理被廣泛報(bào)道[7]。作為具有芽型茶和葉型茶的白茶[8-9]，卻缺少相關(guān)的研究。因此，本研究選取芽型茶白毫銀針、芽葉型茶白牡丹及多葉型茶壽眉三種白茶作為研究對(duì)象，并以多葉型茶類黃大茶作為對(duì)照，構(gòu)建誘發(fā)性糖尿病小鼠模型，對(duì)此4種茶葉水提物(TWEs)的降血糖效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步探究作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白毫銀針、白牡丹、壽眉及黃大茶，購(gòu)于北京市馬連道茶城。SPF級(jí)雄性4w齡ICR小鼠，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；40%脂肪供能高脂高糖飼料及小鼠維持飼料，上海普路騰生物科技有限公司；鏈脲霉菌素(Streptozotocin，STZ)，美國(guó)Sigma公司；鹽酸二甲雙胍，北京協(xié)和藥廠；Trizol試劑，碧云天生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(5X All-In-One RT Master)，美國(guó)abm公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye)，美國(guó)abm公司；小鼠內(nèi)參引物GAPDH，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004分析天平；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱；SHZ-III循環(huán)水真空泵；RE-52AA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；真空冷凍干燥機(jī)；Roche血糖儀活力型；Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀；DY89—II電動(dòng)玻璃勻漿器；Epoch酶標(biāo)檢測(cè)儀；JY92—IIn超聲細(xì)胞粉碎機(jī)；Thermofisher Nanodrop 2000核酸蛋白檢測(cè)儀；Biometra T-personal 梯度PCR儀；Roche lightcycler 96熒光定量PCR儀；Eppendorf 54180R低溫超速離心機(jī)等。

1.3 方法

1.3.1 茶葉水提物的制備與成分分析 將茶葉用粉碎后過40目篩備用，準(zhǔn)確稱取粉碎茶樣，按1∶15的茶水比，80～90℃水浴浸提1h，過濾后將濾渣用同樣方法浸提，合并兩次濾液，55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，將濃縮液真空冷凍干燥，得到白毫銀針?biāo)嵛?TWE-YZ)、白牡丹水提物(TWE-MD)、壽眉水提物(TWE-SM)和黃大茶水提物(TWE-HC)，密封包裝，4℃保存?zhèn)溆肹10]。采用福林酚法測(cè)定TWEs茶多酚總量[11]、蒽酮—硫酸比色法測(cè)定TWEs茶多糖含量[12]、三氯化鋁比色法測(cè)定TWEs總黃酮[13]。

1.3.2 構(gòu)造糖尿病模型與分組 購(gòu)買小鼠于屏障環(huán)境動(dòng)物房(溫度22±2℃、濕度50%±5%、壓差20～50Pa、12/12h光暗循環(huán))，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組(NC)喂養(yǎng)維持飼料，其余換成高脂高糖飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4w后，隔夜禁食12h，將STZ溶解于pH 4.2～4.5的檸檬酸鹽緩沖液，給小鼠腹腔注射STZ 110mg/kg·BW，1w之后測(cè)定血糖，空腹血糖(FBG)≥11.1mmol/L，造模成功[14]。并按照FBG隨機(jī)分組為模型對(duì)照組(MC)、陽性對(duì)照組(PC)、TWE-YZ干預(yù)組、TWE-MD干預(yù)組、TWE-SM干預(yù)組、TWE-HC干預(yù)組，每組10只小鼠。

1.3.3 劑量設(shè)計(jì) 茶葉人體推薦劑量為9.0g/60kg·BW[15]，參照保健功能食品評(píng)價(jià)規(guī)范，設(shè)置人體推薦劑量的30倍作為干預(yù)劑量，且TWEs的提取率為33%±5%，得到小鼠的灌胃劑量為1.5g/kg·BW。PC組選用鹽酸二甲雙胍藥物干預(yù)，根據(jù)成人的每日最大劑量(1～1.5g)，換算成小鼠用藥劑量為250mg/kg·BW[16]。

1.3.4 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn) 在4w干預(yù)結(jié)束前，所有小鼠隔夜禁食不禁水15h，測(cè)定FBG，作為0時(shí)血糖。然后給小鼠灌胃葡萄糖1.5g/kg·BW，記錄灌胃后30、60、90、120min血糖，并繪制時(shí)刻—血糖折線圖[17]。按照式(1)計(jì)算折線圖的曲線下面積。

AUC/(mmol·h/L)=(A/2+B+C+D+E/2)/2

(1)

式(1)中，A、B、C、D、E分別表示0、30、60、90、120min時(shí)刻的血糖值。

1.3.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后，所有鼠禁食12h，眼眶采血，將血樣在4℃、3 500r/min離心15min，分離血清樣本分別測(cè)定血清胰島素水平(FIS)和FBG。

1.3.6 胰腺組織病理學(xué)分析 取小鼠胰腺組織于組織固定液，固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，做切片，H&E染色，光學(xué)顯微鏡觀察胰腺組織病理學(xué)變化，200倍視野下拍照。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) Trizol法提取小鼠肝臟總RNA[18]，檢測(cè)RNA的濃度及OD260/OD280比值，將比值在1.8～2.0的樣品用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1μL的cDNA，上下游引物各0.3μL，ddH2O補(bǔ)充至10μL，按照梯度程序：95℃、10min，95℃、15 S，60℃、60 S循環(huán)35次。并以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-(ΔΔCT)法[19]對(duì)糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。所測(cè)基因?yàn)榱蜓踹€蛋白互作蛋白(TXNIP)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Foxo1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)(表1)。

表1 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TWEs主要功效成分含量

如表2所示，白茶TWEs的茶多酚含量明顯高于TWE-HC大約為1.3～1.6倍。三種白茶TWEs中，芽型茶TWE-YZ的茶多酚含量顯著高于多葉型茶TWE-SM和芽葉型茶TWE-MD(P<0.05)?？梢姡枞~生產(chǎn)工藝和原料的嫩度影響茶葉的茶多酚含量。

表2 TWEs的主要功效成分 單位：mg/g

注：字母不同表示差異顯著，P<0.05

由表2可知，茶多糖含量與茶葉嫩度相關(guān)，其中多葉型茶TWE-HC和TWE-SM茶多糖最高，芽葉型茶TWE-MD次之，芽型茶TWE-YZ最低，呈現(xiàn)梯度下降的規(guī)律。此外，對(duì)TWEs的黃酮類化合物總量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，白茶TWEs的總黃酮含量相對(duì)較高，大約為TWE-HC的1.4倍。白茶TWEs中，TWE-SM和TWE-YZ黃酮含量較高，TWE-MD次之，未呈現(xiàn)與茶葉嫩度相關(guān)的梯度規(guī)律。

2.2 TWEs對(duì)糖尿病小鼠體重、攝食量及始末血糖的影響

由圖1A可以看出，除NC和PC組外，所有組體重均有明顯的降低，從第3周開始，TWEs組體重趨于穩(wěn)定，而MC組體重波動(dòng)較大，整體趨于降低。從圖1B可以看出，只有NC組和PC組體重呈現(xiàn)正增長(zhǎng)，而MC組及其他TWEs干預(yù)組均呈現(xiàn)出負(fù)增長(zhǎng)，推測(cè)與注射STZ造成糖尿病模型有關(guān)，并且二甲雙胍對(duì)維持小鼠正常體重具有較好作用。TWEs干預(yù)組中，YZ組與SM組體重增長(zhǎng)百分比顯著高于MC組(P<0.05)，說明TWE-YZ與TWE-SM有利于緩解糖尿病所造成的小鼠體重減輕癥狀，其他兩種TWEs也有所緩解，但沒有顯著性。

由圖1C可以看出，除NC組外，小鼠的攝食量都明顯增加，出現(xiàn)了多食癥狀。并且MC組和PC組小鼠攝食量一直偏高，而TWEs組攝食量相對(duì)較小，低于MC組與PC組，說明TWEs干預(yù)可以一定程度上減輕小鼠的多食癥狀，而二甲雙胍作用較弱。

由圖1D可以看出，注射STZ后，測(cè)定了初始血糖值，糖尿病模型鼠組別之間沒有顯著差異(P>0.05)，并且FBG均在20mmol/L左右。MC組經(jīng)過4w喂養(yǎng)后，F(xiàn)BG有一定升高，說明MC組小鼠的糖尿病病情不斷惡化。TWEs干預(yù)組中，F(xiàn)BG均有一定程度降低，PC組、YZ組、MD組、SM組及HC組的血糖下降率分別為35.5%、21.7%、27.3%、34.8%及25.1%?？梢钥闯觯琓WE-SM降血糖的效果最好，其作用效果與鹽酸二甲雙胍接近，其次為TWE-MD。

圖1 TWEs對(duì)小鼠體重、攝食量及始末血糖值的影響注：*與正常組相比，P<0.05；**P<0.01；#與模型組相比，P<0.05；##P<0.01(下同)

圖2 TWEs對(duì)小鼠葡萄糖耐量的影響

2.3 TWEs對(duì)糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響

口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)可以確診糖尿病[21]。圖2A表明，MC組血糖在30min時(shí)明顯升高，之后血糖雖有降低，但非常緩慢，表現(xiàn)出葡萄糖不耐受。TWEs組及PC組血糖在30min驟升之后，血糖恢復(fù)得相對(duì)較快，但難以區(qū)分各組間的差異性。由圖2B可知，TWEs及二甲雙胍均對(duì)小鼠葡萄糖耐受有一定程度的改善，其中PC組、HC組的AUC顯著低于MC組(P<0.05)，而SM組則極顯著低于MC組(P<0.01)，顯示出了較好的效果。結(jié)合表2可知，TWE-SM和TWE-HC的茶多糖含量均較高，并且TWE-HC的茶多糖含量大約是TWE-SM的1.8倍，但是TWE-HC改善小鼠葡萄糖耐量的效果卻不如TWE-SM。推測(cè)可能是由于TWE-SM的茶多酚、茶多糖及黃酮含量均相對(duì)較高，三者之間存在某種協(xié)同機(jī)制，改善小鼠的葡萄糖不耐受，進(jìn)而降低小鼠血糖。Zhou等[22]分別以茶葉水提物(TWE)、粗茶多糖(CTP)及精制茶多糖(TPF)為原料，用四氧嘧啶誘導(dǎo)昆明小鼠建立糖尿病模型，研究上述三類物質(zhì)的降血糖效果。結(jié)果表明，CTP降血糖效果最好，TPF次之。同樣證明了茶葉中起降血糖作用的并非單一組分，而是多種組分互相協(xié)調(diào)的結(jié)果。

2.4 TWEs對(duì)HOMA模型的影響

根據(jù)小鼠FBG和FIS計(jì)算出了胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-B)，這種計(jì)算方式是基于肝臟葡萄糖的輸出和胰腺胰島素的分泌呈動(dòng)態(tài)平衡，計(jì)算公式為[23]：HOMA-IR=FBG*FIS/22.5；HOMA-B=(20*FIS)/(FBG-3.5)%。由圖3A和3B可以看出，TWEs及二甲雙胍均對(duì)小鼠HOMA-IR有一定改善，其中MD組效果最好，HOMA-IR值顯著低于MC組(P<0.05)。而HOMA-B值SM組最高，與NC組沒有顯著差異(P>0.05)。由此可見，不同TWEs均可調(diào)節(jié)FBG與FIS之間的平衡，但是其調(diào)節(jié)方式有所差異。

2.5 小鼠胰腺組織的病理學(xué)分析

如圖4所示，NC組胰島形態(tài)正常，胰島細(xì)胞排列成團(tuán)成索，染色淺；外分泌部為染色較深的漿液腺泡，腺細(xì)胞成錐形，細(xì)胞基部胞質(zhì)呈強(qiáng)嗜堿性，頂部胞質(zhì)含嗜酸性分泌顆粒，核大，圓形，近細(xì)胞基部。而MC組胰島細(xì)胞變性，排列紊亂；基膜增厚，胰島細(xì)胞核空泡化；胰島捏毛細(xì)血管擴(kuò)張。MC組胰島細(xì)胞壞死，有脂肪變性征兆，胰島損傷較為嚴(yán)重。而PC組胰島細(xì)胞變性、壞死，核固縮、深染；毛細(xì)血管擴(kuò)張；周圍結(jié)締組織增生，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胰島損傷同樣較為嚴(yán)重，可見二甲雙胍藥物對(duì)胰腺組織病理學(xué)形態(tài)的改善并不顯著。YZ組胰島細(xì)胞出現(xiàn)肥大，腦漿空泡化。MD組胰島細(xì)胞核深染。SM組胰島肥大，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；胰島細(xì)胞變性，核固縮、深染。HC組胰島細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了毛細(xì)血管擴(kuò)張?？梢?，TWEs均在不同程度上改善了胰腺組織的病理學(xué)形態(tài)。

圖3 TWEs對(duì)HOMA模型的影響

圖4 小鼠胰腺組織病理學(xué)分析

圖5 TWEs對(duì)糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 TWEs對(duì)糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖5A可知，MC組小鼠肝臟的TXNIP表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，TWEs的干預(yù)均使TXNIP的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，其中YZ和MD組的效果優(yōu)于SM和HC組。TXNIP是胰島細(xì)胞的炎癥分子，可介導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡。可見，四種TWEs均可下調(diào)TXNIP的表達(dá)量，減緩胰島細(xì)胞炎癥，抑制TXNIP所介導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡[24]。由圖5B可知，MC組小鼠肝臟的Foxo1表達(dá)顯著升高(P<0.05)，TWEs的干預(yù)均使Foxo1的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，且各組間沒有顯著差異。Foxo1是胰島β細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子，可β細(xì)胞的增殖，促進(jìn)糖異生相關(guān)基因的表達(dá)，使得胰島素的分泌量減少，葡萄糖的生成量增加，血糖升高[25-26]。由圖5C可知，SM組的GLUT4表達(dá)量顯著高于NC組(P<0.05)，而GLUT4可激活葡萄糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)受體，促進(jìn)葡萄糖的吸收與利用[27]。由此可見，TWE-SM可通過上調(diào)GLUT4的表達(dá)量來提高糖尿病鼠的葡萄糖利用效率，進(jìn)而達(dá)到降低糖尿病小鼠血糖的作用。由圖5D可知，MC組和HC組PEPCK1的表達(dá)量顯著高于NC組(P<0.01)，3種白茶TWEs干預(yù)均使其表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01)，且三者無顯著差異。PEPCK1是糖異生的關(guān)鍵調(diào)控基因，促進(jìn)葡萄糖的合成。因此，3種白茶TWEs通過下調(diào)糖異生的關(guān)鍵調(diào)控基因，進(jìn)而抑制葡萄糖合成路徑。

3 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)所設(shè)劑量下，白毫銀針、白牡丹、壽眉及黃大茶水提物均可降低小鼠血糖，其中壽眉水提物最為明顯，白牡丹水提物次之；四種茶葉水提物均可改善小鼠葡萄糖耐量，其中壽眉水提物具有極顯著作用，黃大茶水提物有顯著作用；白牡丹水提物可顯著改善小鼠胰島素抵抗。綜上所述，多葉型茶壽眉改善糖尿病小鼠病癥效果較好。白毫銀針和白牡丹水提物可通過下調(diào)TXNIP、Foxo1及PEPCK1的表達(dá)量，來減緩胰島細(xì)胞炎癥，抑制胰島β細(xì)胞的凋亡，并抑制糖異生通路；壽眉水提物通過上調(diào)GLUT4的表達(dá)量，下調(diào)PEPCK1的表達(dá)量，促進(jìn)葡萄糖的吸收與利用，并抑制糖異生通路，直接調(diào)節(jié)了血糖水平。黃大茶水提物也可調(diào)控部分基因的表達(dá)量，但效果不如白茶顯著。因此，三種白茶均有降血糖功效，而且多葉型茶壽眉的降血糖效果更為明顯，優(yōu)于同為多葉型茶的黃大茶，推測(cè)是由于壽眉茶多酚與茶多糖含量均較高的緣故，而茶多酚與茶多糖協(xié)同降血糖的機(jī)理，還有待進(jìn)一步研究?！?/p>

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