溫金明，石曉東，高潤梅，戎丹仁，柳昱旻

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801)

1943年，Marker研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元是合成甾體激素藥物的原料，薯蕷屬(DioscoreaL.)植物的開發(fā)利用便在全世界范圍內(nèi)迅速展開，目前，全球甾體激素類藥物多于60%以薯蕷皂苷元為原料[1]。我國對(duì)薯蕷植物資源的開發(fā)利用始于20世紀(jì)50年代，國內(nèi)含薯蕷皂苷元的根狀莖植物有17種1亞種3變種，其中，盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC. H. Wright)和穿龍薯蕷(DioscoreanipponicaMakino)的薯蕷皂苷元含量較高、品質(zhì)較好[2-7]。盾葉薯蕷是我國的特有種，主要分布于長江流域，在南方多省區(qū)已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但薯蕷皂苷元產(chǎn)量仍難以滿足工業(yè)需要，供求矛盾突出[5，8-9]。所以，在我國北方地區(qū)發(fā)掘與薯蕷皂苷元相同藥用成分的其他植物資源，是解決甾體藥物原料供應(yīng)的重要課題。

穿龍薯蕷在我國主要分布于山西、陜西、東北等地區(qū)，多生于海拔100～1 700 m的稀疏雜木林內(nèi)和山腰河谷兩側(cè)的山坡灌木叢中及林緣[10]。其根莖入藥歷史悠久，有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、心絞痛、慢性氣管炎、慢性布魯菌病、脂肪瘤等療效較好[11]。穿龍薯蕷根莖中薯蕷皂苷元含量為0.93%～2.26%，但受土壤、水分、溫度、光照等環(huán)境因子的影響，各產(chǎn)地的藥材質(zhì)量存在差異[12-14]。因此，篩選高含量的種質(zhì)對(duì)于穿龍薯蕷的栽培具有重要意義。傳統(tǒng)的種質(zhì)篩選方法是對(duì)所有種質(zhì)皂苷含量進(jìn)行測(cè)定分析，盲目性較大，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)財(cái)，不利于大規(guī)模篩選。葉片特征對(duì)于盾葉薯蕷種質(zhì)篩選和保存具有一定的指導(dǎo)意義，根據(jù)葉片形態(tài)對(duì)薯蕷種質(zhì)進(jìn)行粗篩，無疑能加快高含量種質(zhì)篩選的進(jìn)程。已有研究表明，三角葉薯蕷(DioscoreadeltoideaWall.)的薯蕷皂苷元含量與葉片的長度、寬度呈正相關(guān)[15]；寬葉型盾葉薯蕷的薯蕷皂苷元含量較長葉型植株含量高[12，16]；盾葉薯蕷葉的葉綠素含量與光合速率正相關(guān)，光合速率越強(qiáng)，光合產(chǎn)物含量越大，根狀莖產(chǎn)量越高，薯蕷皂苷元含量越高[17]。

本試驗(yàn)以山西省蟒河和關(guān)帝山2個(gè)種源地的穿龍薯蕷植株為研究對(duì)象，分析穿龍薯蕷葉片的形態(tài)多樣性特征，比較不同葉形的葉綠素與光合產(chǎn)物的含量，以期探討葉形態(tài)與光合產(chǎn)物間的相關(guān)性，為穿龍薯蕷的良種選育工作提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試種源分別取之于山西省蟒河自然保護(hù)區(qū)和關(guān)帝山龐泉溝自然保護(hù)區(qū)。

1.2 試驗(yàn)地概況

蟒河自然保護(hù)區(qū)(112°22′10″～112°31′35″E，35°12′30″～35°17′20″N)位于晉城市陽城縣境內(nèi)，海拔300～1 572 m，年均降水量600～900 mm，年均溫14 ℃，無霜期180 d，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候[18]。

關(guān)帝山龐泉溝自然保護(hù)區(qū)(37°20′～38°20′N，110°18′～111°18′E)位于呂梁山中段，處于交城、方山兩縣之間，海拔1 300～2 800 m，年均降水量約820 mm，年均溫4.3 ℃，無霜期180 d，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候[19]。

1.3 試驗(yàn)方法

2014年9-10月分別于試驗(yàn)種源地采集穿龍薯蕷部分地下根莖，沙藏越冬至2015年4月，取出根莖植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院苗圃，常規(guī)水肥管理。2017年5月，選取2個(gè)種源地長勢(shì)旺盛的穿龍薯蕷植株，按照葉色、葉裂數(shù)等葉部形態(tài)的差異，選取180枚成熟葉片，進(jìn)行葉形態(tài)測(cè)量和生理指標(biāo)測(cè)定。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 葉形態(tài)指標(biāo)測(cè)量 采用EPSON Scan掃描儀獲取葉片的數(shù)字圖像，利用 Image J軟件分別測(cè)量葉長(葉基到葉尖的長度)、葉寬(垂直于葉柄方向的葉片最寬處)、葉面積和葉張角(葉基部夾角)[20]。人工數(shù)取葉裂數(shù)，計(jì)算葉片長寬比。為了分析的便利，對(duì)葉張角進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ. 葉張角<40°；Ⅱ. 40°≤葉張角<50°；Ⅲ. 50°≤葉張角<60°；Ⅳ. 60°≤葉張角<70°；Ⅴ. 葉張角≥70°。

1.4.2 葉生理指標(biāo)測(cè)定 葉綠素含量測(cè)定采用直接浸提法[21]，可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[22]，可溶性糖和淀粉含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[22]，還原糖含量的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法[23]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析，差異水平為0.05；采用Excel 2013進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 穿龍薯蕷葉形態(tài)多樣性分析

測(cè)量計(jì)算穿龍薯蕷的葉長、葉寬、長寬比、葉面積、葉裂數(shù)和葉張角等形態(tài)指標(biāo)，并就葉形態(tài)差異和指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2.1.1 葉形態(tài)差異 穿龍薯蕷葉形態(tài)多樣性明顯，表現(xiàn)在葉色深淺、葉長、葉寬、葉裂、葉張角等方面，結(jié)果如表1所示。

表1 穿龍薯蕷葉形態(tài)差異 Tab.1 Leaf morphological differences of Discorea nipponica Makino

由表1可知，就2個(gè)種源地比較而言，除了長寬比之外，關(guān)帝山種源地穿龍薯蕷葉片的葉長、葉寬、葉面積、葉裂數(shù)和葉張角的變異系數(shù)均大于蟒河種源地，即關(guān)帝山種源地的葉形態(tài)變異大于蟒河種源地。2個(gè)種源地都存在2種葉型：長葉型(葉片長度大于寬)和寬葉型(葉片寬度大于長度)：蟒河種源的葉長為4.43～8.30 cm，葉寬為2.26～8.69 cm，長寬比為0.79～2.31；關(guān)帝山種源的葉長為3.35～8.59 cm，葉寬為2.13～8.63 cm，長寬比為0.83～1.78。葉片大小差異直接造成葉面積的明顯差異：蟒河種源地葉面積為9.12～52.17 cm2，關(guān)帝山種源地5.40～49.29 cm2，變異系數(shù)高達(dá)0.34和0.37。此外，葉形態(tài)多樣性在葉裂數(shù)和葉張角方面也有體現(xiàn)：2個(gè)種源地的葉裂數(shù)變異系數(shù)分別為0.34和0.36；葉張角差異明顯，關(guān)帝山種源地多于蟒河種源地近3°。

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析穿龍薯蕷2個(gè)種源地不同葉型和各級(jí)葉張角所占的比例，結(jié)果如圖1所示。

圖1 兩個(gè)種源地的葉型和葉張角比例 Fig.1 Percentage of leaf type and leaf angle of two provenances

由圖1可知，就2個(gè)種源地的葉型均以長葉型居多，蟒河種源長葉型占83%，關(guān)帝山種源長葉型占91%。就葉張角來看，2種源均以第Ⅱ級(jí)(40°～50°)比例最大，蟒河種源占38%，關(guān)帝山種源占32%；Ⅲ、Ⅳ級(jí)次之，即多數(shù)葉片的葉張角為40°～70°。蟒河種源Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)葉張角占總?cè)~數(shù)的83%，關(guān)帝山占77%；關(guān)帝山種源有>10%的葉片葉張角>70°，蟒河種源有<10%葉片葉張角>70°，但約有12%的葉片葉張角<40°。

統(tǒng)計(jì)分析不同葉色的葉型與各級(jí)葉張角的比例，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，2種葉色的葉片均以長葉型占據(jù)優(yōu)勢(shì)，深色葉中，長葉型占80%，淺色葉中，長葉型占比大于深色葉片，占96%。就葉張角來看，深色葉片中各級(jí)葉張角占比接近，Ⅰ～Ⅳ級(jí)占89%；淺色葉片中葉張角比例差異較大：第Ⅱ級(jí)比例最高，占40%；Ⅱ～Ⅳ級(jí)比例占90%，即多數(shù)葉片的葉張角為40°～70°；Ⅰ級(jí)占比最少，為3%。

2.1.2 葉形態(tài)指標(biāo)間的相關(guān)性 對(duì)穿龍薯蕷葉片的葉色、葉長等形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示。

圖2 不同葉色的葉型和葉張角比例 Fig.2 Percentage of leaf type and leaf angle of different leaf color

葉形態(tài)指標(biāo)Leafmorphologicalindicators葉色Leafcolor葉長Leaflength葉寬Leafwidth葉面積Leafarea葉裂數(shù)Leafcrack葉張角Leafangle葉色Leafcolor1．00葉長Leaflength-0．62??1．00葉寬Leafwidth-0．51??0．81??1．00葉面積Leafarea-0．63??0．86??0．94??1．00葉裂數(shù)Leafcrack-0．110．30??0．51??0．43??1．00葉張角Leafangle0．03-0．22??-0．25??-0．18?-0．40??1．00

注：**.在0.01水平上顯著相關(guān)；*.在0.05水平上顯著相關(guān)。表3-4同。

Note：**.The significant correlation at the level of 0.01；*.The significant correlation at the level of 0.05. The same as Tab.3-4.

由表2可知，葉長與葉寬、葉面積、葉裂數(shù)呈極顯著正相關(guān)，與葉張角呈極顯著負(fù)相關(guān)；葉寬與葉面積、葉裂數(shù)呈極顯著正相關(guān)，與葉張角呈極顯著負(fù)相關(guān)；葉面積與葉裂數(shù)呈極顯著正相關(guān)，與葉張角呈顯著負(fù)相關(guān)；葉裂數(shù)與葉張角呈極顯著負(fù)相關(guān)；葉色與葉長、葉寬、葉面積呈極顯著負(fù)相關(guān)。通過以上分析可知，穿龍薯蕷葉部形態(tài)指標(biāo)間顯著相關(guān)，均可用作穿龍薯蕷種質(zhì)資源篩選。

2.2 葉綠素含量分析

對(duì)穿龍薯蕷葉片的葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行各形態(tài)指標(biāo)不同類型的含量比較，結(jié)果列于表3。

由表3可知，穿龍薯蕷葉片葉綠素含量與種源地、葉型相關(guān)性不顯著，與葉色相關(guān)性極顯著。穿龍薯蕷葉片的葉綠素含量在不同種源地和葉型之間無顯著差異，在不同葉裂數(shù)間存在顯著差異。深綠色葉片的Chla、Chlb和ChlT含量的平均值均高于淺綠色葉片，但Chla/Chlb的平均值小于淺綠色葉片。葉5裂的葉片中，Chla和ChlT含量平均值最高，顯著高于其他3，4裂的葉片；葉6裂的葉片中，Chla/Chlb的平均值最高，為8.62，顯著高于2，3，5裂的葉片。葉綠素含量在不同類型之間葉張角的差異較小。

2.3 葉片光合產(chǎn)物含量分析

對(duì)穿龍薯蕷葉片的光合產(chǎn)物含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，穿龍薯蕷葉片的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和還原糖含量與種源地和葉型的相關(guān)性不顯著，與葉色的相關(guān)性極顯著。穿龍薯蕷葉片的淀粉含量與種源地相關(guān)性極顯著，與葉色相關(guān)性顯著，與葉型相關(guān)性不顯著。穿龍薯蕷深綠色葉片的4種光合產(chǎn)物含量的平均值都大于淺綠色葉片。2裂葉片的可溶性蛋白質(zhì)和還原糖含量顯著高于其他裂數(shù)葉片，可溶性糖含量顯著高于4裂、5裂和6裂的葉片，淀粉含量顯著高于4裂和5裂的葉片。不同類型葉張角葉片除了淀粉，其他3種光合產(chǎn)物含量均差異顯著，含量的整體變化趨勢(shì)是隨葉張角的增大，光合產(chǎn)物含量顯著增加。

進(jìn)一步分析相關(guān)性強(qiáng)弱，結(jié)果如圖3所示。

表3 穿龍薯蕷葉綠素含量 Tab.3 Chlorophyll content of Discorea nipponica Makino

注：同一列不同小寫字母示差異顯著(P<0.05)。表4同。

Note：Different letter in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same as Tab.4.

表4 穿龍薯蕷光合產(chǎn)物含量 Tab.4 Photosynthate content of Discorea nipponica Makino

圖3 葉張角與光合產(chǎn)物含量的相關(guān)性Fig.3 Correlation between leaf angle and photosynthate content

由圖3可知，穿龍薯蕷葉張角與葉片內(nèi)光合產(chǎn)物的含量顯著相關(guān)，但不同產(chǎn)物的相關(guān)性強(qiáng)弱不同，依次為可溶性蛋白>可溶性糖>還原糖>淀粉。

3 討論與展望

3.1 薯蕷屬植物葉形態(tài)多樣性情況

薯蕷科中薯蕷屬種類最多，共6組600種，多數(shù)種葉部形態(tài)多樣，以盾葉薯蕷和穿龍薯蕷為甚。其中，盾葉薯蕷葉形為三角狀卵形、心形或箭形，通常3淺裂至3深裂，葉脈掌狀分布[24]；穿龍薯蕷葉片卵圓形，葉色有深綠、淺綠二色，常呈2～6淺裂或深裂。此外，不同分布區(qū)的薯蕷屬植物在葉形態(tài)也存在差異[25]。本研究根據(jù)長寬比可以把薯蕷屬植物的葉片分成兩大類型：長葉型和寬葉型。穿龍薯蕷存在2種葉型，2個(gè)種源地葉型都以長葉型為主，關(guān)帝山種源的長葉型比例高于蟒河種源。多數(shù)穿龍薯蕷的葉張角為40°～70°。深綠色葉片多為厚紙質(zhì)，淺綠色葉片多為薄紙質(zhì)。葉形態(tài)指標(biāo)之間的差異反映了穿龍薯蕷葉部形態(tài)特征的多樣性，表明穿龍薯蕷是一個(gè)葉形態(tài)“多型性”的種。此外，穿龍薯蕷葉部形態(tài)指標(biāo)間顯著相關(guān)，均可用作穿龍薯蕷種質(zhì)資源篩選。

3.2 葉形態(tài)與有效成分間的關(guān)系

植物所處的生態(tài)環(huán)境及豐富的形態(tài)多樣性可能與有效成分之間存在關(guān)系，為進(jìn)一步分析穿龍薯蕷不同種源地、不同類型葉片與其地下根狀莖有效成分薯蕷皂苷元含量之間的關(guān)系，本研究先對(duì)2個(gè)種源地不同形態(tài)葉片的光合產(chǎn)物含量進(jìn)行了測(cè)定。植株體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量的高低間接反映各種代謝活動(dòng)的強(qiáng)弱，植物產(chǎn)品的品質(zhì)性狀，常以糖含量作為重要指標(biāo)?？扇苄蕴鞘强偺堑囊粋€(gè)重要組成部分，是植物碳水化合物代謝中重要的運(yùn)輸形式，可溶性糖含量的高低，反映了植株體內(nèi)可利用物質(zhì)和能量的供應(yīng)基礎(chǔ)[26-27]。淀粉作為營養(yǎng)性多糖，在淀粉酶作用下可以水解為可溶性糖[28]。還原糖是指可被氧化充當(dāng)還原劑的糖。本研究表明，穿龍薯蕷葉張角與葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、淀粉、還原糖含量顯著相關(guān)，含量的整體變化趨勢(shì)是隨葉張角的增大，葉片的這4種光合產(chǎn)物含量增大。說明葉張角可用作穿龍薯蕷種質(zhì)資源篩選時(shí)首選的葉部形態(tài)指標(biāo)。

穿龍薯蕷葉部形態(tài)、葉綠素含量和光合產(chǎn)物含量產(chǎn)生差異的原因有兩方面：一是生境的多樣性：葉形態(tài)的差異是對(duì)不同生境條件的長期適應(yīng)造成的；蟒河和關(guān)帝山2個(gè)分布區(qū)的海拔、林下光照、降水量、日平均氣溫、土壤類型等立地條件不同，使穿龍薯蕷產(chǎn)生了與之相適應(yīng)的形態(tài)類型。二是遺傳的多樣性：薯蕷屬植物的染色體數(shù)目變異較大，且倍性復(fù)雜[29-30]；有研究結(jié)果顯示，懷山藥和大薯形態(tài)特征豐富，染色體數(shù)目為40條或60條，葉形態(tài)特征與染色體數(shù)目存在一定的相關(guān)性[31-32]。

3.3 穿龍薯蕷研究的展望

穿龍薯蕷葉部形態(tài)存在多樣性，為選種栽培提供了豐富的資源。根據(jù)葉形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行粗篩，這可以減少篩選的盲目性，提高準(zhǔn)確度，縮短野外篩選的時(shí)間，大大加快高質(zhì)量種質(zhì)篩選的進(jìn)程，對(duì)于野生穿龍薯蕷資源中高薯蕷皂苷元含量的種質(zhì)篩選、保護(hù)和繁殖有著重要意義，對(duì)解決甾體藥物原料供應(yīng)有著現(xiàn)實(shí)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但基于多樣性研究，尤其是遺傳多樣性的研究方面起步較晚，今后應(yīng)加強(qiáng)以下幾方面的研究：一是應(yīng)用常規(guī)研究方法與先進(jìn)的生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，分析穿龍薯蕷皂苷元含量與多樣性特征之間的關(guān)系，研究和評(píng)價(jià)穿龍薯蕷資源的多樣性；二是應(yīng)用DNA分子標(biāo)記的方法比較和分析高皂苷元含量類型的特征性基因片段加強(qiáng)遺傳多樣性的研究；三是加強(qiáng)穿龍薯蕷代謝過程的研究，探索穿龍薯蕷藥用部分(地下莖)生長規(guī)律與薯蕷皂苷元積累的動(dòng)態(tài)關(guān)系，設(shè)法對(duì)穿龍薯蕷代謝過程進(jìn)行改造，使之具有最佳薯蕷皂苷元產(chǎn)生模式；四是對(duì)薯蕷皂苷元含量高的穿龍薯蕷品種，進(jìn)行形態(tài)、生理和DNA水平等方面的研究，從中篩選更優(yōu)良的品種，運(yùn)用組織培養(yǎng)等方法進(jìn)行擴(kuò)大利用[17]。

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